La protéine Hsp12 est une protéine de choc thermique (12 kDa) exprimée par la levure Saccharomyces cerevisiae et associée à la réponse au stress. En effet, il a été montré que les transcrits du gène HSP12 sont exprimés en réponse à différents stress. De plus, la protéine Hsp12 serait responsable de la sucrosité du vin observée au cours de l’autolyse des levures lors de la vinification. Cependant, le goût sucré pourrait provenir de la protéine Hsp12 entière, ou, d’un ou plusieurs peptides issus de la protéine Hsp12. L’objectif de cette étude était d’obtenir la protéine Hsp12 native pure à partir de culture de Saccharomyces cerevisiae afin de comprendre son rôle, d’une part dans la réponse au stress chez la levure et, d’autre part dans la sucrosité du vin.Des cultures de la souche œnologique Fx10 de Saccharomyces cerevisiae ont été réalisées afin d’étudier la protéine Hsp12 native. La production de la protéine Hsp12 en réponse à différents stress a été étudiée au cours des cultures, grâce à un dosage ELISA développé lors de cette étude. Il a ainsi été mis en évidence que la protéine Hsp12 est produite en quantités significativement supérieures en réponse à des stress thermiques et osmotiques. Le stress éthanolique quant à lui entraine une diminution de la quantité de protéine Hsp12. La protéine Hsp12 native extraite à partir des cultures a été purifiée. Un procédé de purification en 3 étapes a été développé. Plusieurs résines et conditions chromatographiques ont été criblées en microplaques. La résine en mode mixte PPA HyperCel a permis d’éliminer des contaminants majeurs grâce à sa sélectivité. La chromatographie d’exclusion stérique a permis d’éliminer les contaminants restants et ainsi d’obtenir la protéine Hsp12 native avec une pureté de 99%. Différentes techniques biophysiques et calorimétriques ont permis de caractériser la protéine Hsp12 native purifiée, en présence de membranes modèles. Il a ainsi été démontré que la protéine Hsp12 est une protéine intrinsèquement non ordonnée (intrinsically disordered protein - IDP). Elle est caractérisée par l’absence de structures secondaires en solution aqueuse et par la formation d’hélices α en présence de SDS et du phospholipide PiP2. La liaison avec le PiP2 suggère un rôle dans la stabilisation de la membrane plasmique des levures. La protéine Hsp12 pourrait ainsi avoir un rôle de chaperonne de membrane. Une caractérisation organoleptique de la protéine Hsp12 native purifiée a également été réalisée. Il apparait que la protéine Hsp12 entière n’est pas responsable de la sucrosité mais plutôt un ou des peptides issus sa digestion enzymatique. / Hsp12 is a heat shock protein (12 kDa) expressed by the yeast Saccharomyces cerevisiae and associated with the stress response. Indeed, it has been shown that transcripts of the HSP12 gene are expressed in response to different stresses. In addition, the protein Hsp12 would be responsible for the sweetness of wine observed during the autolysis of yeasts during vinification. However, the sweet taste could come from the entire Hsp12, or from one or more peptides derived from Hsp12. The objective of this study was to obtain the pure native Hsp12 protein from Saccharomyces cerevisiae culture in order to understand its role, on the one hand in the stress response in yeast and on the other hand in the sweetness of wine.Cultures of the Saccharomyces cerevisiae Fx10 enological strain were made to study the native Hsp12 protein. The production of the Hsp12 protein in response to different stresses was studied during the cultures, thanks to an ELISA assay developed during this study. It has thus been demonstrated that the Hsp12 protein is produced in significantly greater quantities in response to thermal and osmotic stress. Ethanol stress causes a decrease in the amount of Hsp12 protein. The native Hsp12 protein extracted from the cultures was purified. A 3-step purification process has been developed. Several resins and chromatographic conditions were screened in microplates. PPA HyperCel mixed-mode resin has eliminated major contaminants due to its selectivity. Steric exclusion chromatography allowed the removal of remaining contaminants and thus obtain the native Hsp12 protein with a purity of 99%. Various biophysical and calorimetric techniques were used to characterize the purified native Hsp12 protein in the presence of model membranes. It has thus been demonstrated that the Hsp12 protein is an intrinsically disordered protein (IDP). It is characterized by the absence of secondary structures in aqueous solution and by the formation of α helices in the presence of SDS and phospholipid PiP2. The binding with PiP2 suggests a role in the stabilization of the plasma membrane of yeasts. The Hsp12 protein could thus act as a membrane chaperone. Organoleptic characterization of the purified native Hsp12 protein was also performed. It appears that the entire Hsp12 protein is not responsible for the sweetness but rather one or more peptides resulting from its enzymatic digestion.

Des hormones gonadotropiques sont utilisées pour la maîtrise de la reproduction dans le domaine vétérinaire. Ces hormones sont actuellement extraites de tissus ou de fluides animaux. L’entreprise CEVA Santé Animale a récemment fait le choix stratégique de produire ces hormones par voie recombinante. L’objectif de cette étude était d’obtenir une gonadotropine chorionique équine recombinante, reCG, pure et biologiquement active, à partir d’une lignée de cellules mammifères CHO. Les étapes de production, de purification et de caractérisation de l’hormone recombinante ont été développées. Les cellules CHO ont été cultivées en fiole d’Erlenmeyer dans différents milieux de culture. Le suivi de la croissance cellulaire et de la quantité d’hormone produite a permis de sélectionner deux milieux. Le procédé de production, avec ces deux milieux, a été optimisé en bioréacteur en contrôlant les paramètres de culture (température, pH). Les protéines produites dans le surnageant, de ces deux cultures, ont été nommées reCG 1 et reCG 2. Un procédé de purification en 3 étapes a été mis au point pour la reCG 1. Plusieurs résines et conditions chromatographiques ont été criblées en microplaques. Les résines multimodales utilisées ont permis d’éliminer des contaminants majeurs grâce à leur sélectivité. Les agrégats de la reCG ont été éliminés grâce à une résine anionique. Le procédé de purification global a été validé pour la reCG 1 et la reCG 2. Il a permis d’obtenir une pureté de 98 % avec un rendement de 80 %. L’activité biologique de la reCG 1 et la reCG 2, in vitro et in vivo, est comparable à celle de la protéine naturelle. L’activité biologique in vivo des reCG est cohérente avec l’étude réalisée sur les glycosylations des hormones et notamment avec leur degré de sialylation. / The gonadotrophic hormones are used for reproduction control in farming animals. Up to now, these hormones were extracted from animal fluids or tissues. The company CEVA Santé Animal has recently decided to produce recombinant versions of these hormones. The objective of this study was to obtain a pure and biologically active recombinant equine chorionic gonadotropin (reCG) after expression in CHO mammalian cells. The production, purification and characterization steps have been developed. CHO cells were grown in Erlenmeyer flasks with different culture media. Two media were selected based on their cell growth potency and of the amount of reCG produced. By using a bioreactor to control key parameters (temperature, pH), the production process was then optimized. The recombinant proteins that accumulated in the supernatant of the two conditions were called reCG 1 and reCG 2. A 3-steps purification process was then developed using reCG 1. Several resins and chromatographic conditions were screened in microplates. Multimodal resins were used to eliminate the main contaminants thanks to their selectivity. reCG aggregates were efficiently eliminated by a chromatographic step with an anionic resin. The overall purification process was finally validated for reCG 1 and reCG 2. Purity and yield were respectively, 98 % and 80 % for the two reCG. We verified that the in vitro and in vivo activities of reCG 1 and reCG 2 were comparable to those of the CG extracted from natural sources. The in vivo assays also confirmed previous studies showing that the degree of glycosylation of an hormone, and most notably their level of sialytation, is important for their biological activity.