Doctor en Ciencias Biomédicas / Melanoma es la neoplasia cutánea más agresiva, con una incidencia ascendente a pesar de numerosos esfuerzos de prevención. En la actualidad existen diversas estrategias de tratamiento, sin embargo, no todos los pacientes responden a ellas. En nuestro laboratorio se ha ensayado una inmunoterapia basada en células dendríticas (DCs) maduradas con un lisado de líneas celulares de melanoma (TRIMEL), que ha incrementado hasta 3 veces la sobrevida en pacientes que desarrollan una respuesta inmunológica de hipersensibilidad retardada (DTH+). Hasta la fecha no se han desarrollado avances en el estudio de la fracción no peptídica de este lisado ni de su capacidad de activar células iNKT, capaces de reconocer antígenos glicolipídicas en contexto CD1d. Hipótesis: Células iNKT infiltran tumores de pacientes con melanoma avanzado y son capaces de ser activadas in vitro por células dendríticas utilizadas en inmunoterapia antitumoral. Objetivo General: Determinar el rol en pacientes con melanoma de células iNKT infiltrantes de tumor y activadas por células dendríticas maduradas ex vivo utilizadas en inmunoterapia antimelanoma. Métodos: Se determinaron células iNKT infiltrantes de tumor mediante inmunofluorescencia y se correlacionó su presencia en lesiones de melanoma primario en todos los estadios según Breslow con la sobrevida de la enfermedad. Se evaluó la capacidad de las fracciones glicolipídica y proteica de TRIMEL para inducir maduración en células dendríticas. Para este fin, las fracciones se obtuvieron mediante gradiente de densidad con MTBE (Metil-terbutil-éter) y se usaron para estimular DCs generadas en base a rhIL-4 y GM-CSF. En estas condiciones se evaluó la presencia de diversas moléculas de superficie y la producción de citoquinas. Para evaluar la capacidad de estas DCs de activar células iNKT, desde PBMC se aisló la población CD3+ mediante cell-sorting y cultivadas con distintas DCs generadas. Se analizó la proliferación celular utilizando el ensayo CFSE. También se evaluó la presencia de células iNKT mediante inmunofluorescencia en tacos de parafina de las DTH realizadas a pacientes de inmunoterapia. Resultados: Encontramos infiltración por células iNKT en todos los estadíos de la enfermedad, siendo mayor en Breslow avanzados, sin una correlación con la sobrevida global. Al evaluar la maduración de DCs, esta fue mayor en el grupo estimulada con la fracción peptídica de TRIMEL. DCs estimuladas con la fracción glicolipídica de TRIMEL no mostraron diferencias con la condición no tratada. Al evaluar mediante ensayo de proliferación realizado con CFSE, se evidenció mayor proliferación en la condición tratada con la fracción peptídica. Finalmente, sólo en 1 de 3 pacientes en los que se analizó la presencia de iNKT en las DTH se encontraron estas células. Conclusiones: unificando todos los hallazgos discutidos previamente, células iNKT infiltran tumores de melanoma, las que podrían ser inducidas a proliferar por DCs estimuladas con la fracción peptídica de TRIMEL y de esa forma migrar a sitios inflamados como representan las lesiones DTH. / Melanoma is the most aggressive skin tumor, with a growing incidence worldwide, despite of prevention strategies. Nowadays, there are several new therapies to treat it, however the overall survival continues to be low. Our lab has been studying a Dendritic Cell (DC) based immunotherapy maturated with a melanoma cell lines lysate (TRIMEL), which has increased survival up to 3 times in patients that developed a delayed type hypersensitivity response (DTH+). To this date no studies have been made regarding the non peptidic fraction of this lysate or its capability to activate a subpopulation of T Cells called iNKT cells, characterized by their ability to recognize glycolipids in a CD1d manner. Hypothesis: iNKT Cells infiltrate melanoma patient’s tumors and are capable to be activated in vitro by Dendritic cells Main Objective: To determinate the role of tumor infiltrating iNKT cells activated by matured Dendritic Cells ex vivo used in antimelanoma immunotherapy in melanoma patients Methods: The presence of tumor infiltrating iNKT Cells in primary melanoma in all of Breslow stages was evaluated by expression of TCR Vα24Jα18 by Immunofluorescence microscopy. To evaluate the capability of glycolipid and peptidic TRIMEL fraction to induce DCs maturation, they were isolated from TRIMEL using a MTBE (Metil-terbutil-ether) density gradient. Afterwards, these fractions were used to stimulate DCs generated with a rhIL-4 and GM-CSF protocol and surface molecules expression were assessed, as well as cytokine secretion. To evaluate DCs effectiveness to activate iNKT Cells’ proliferation, CD3+ population was isolated from Buffy Coats using cell-sorting technology and they were cultured with DCs. Proliferation was accessed with CFSE dye assay. Finally, DTH infiltrating iNKT cells were asessed in paraffined embedded samples by immunofluorescence microscopy. Results: We found that iNKT cells infiltrated melanoma tumors in every Breslow stage, with higher infiltration on advanced stages,with no correlation with overall survival. The peptidic fraction of TRIMEL induced higher expression of maturation related surface molecules in addition to cytokine secretion, whereas glycolipidic fraction showed no difference with the untreated condition. iNKT cell had a higher proliferation rate when cultured with DCs treated with the peptidic fraction of TRIMEL. And finally, we found the infiltration of iNKT in 1 of the 3 patients DTH. Conclusions: Taking together all the previous results, iNKT cells infiltrate melanoma Tumors, and they could be induced to proliferate by DCs stimulated with the peptidic fraction of TRIMEL and as well supporting their migration to inflamed tissues like the DTH samples. / 2021