Th.--Pharm.--Paris 5, 1981. N°: 58.

Th.--Méd.--Reims, 1981. N°: 26.

Th. 3e cycle--Pharm.--Paris 5, 1980. N°: 10.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les héparines regroupant les héparines standards (HNF), les héparines de bas poids moléculaire(HBPM), et le fondaparinux, sont des médicaments anticoagulants. Ils potentialisent l’antithrombine (AT) : un inhibiteur physiologique de la coagulation. Leur utilisation en thérapeutique est associée à un risque hémorragique majeur. Actuellement, le sulfate de protamine est le seul antidote disponible vis-à-vis des HNF. Il est partiellement efficace vis-à-vis des HBPM, et n’a aucun effet contre le fondaparinux, qui n’a pas d’antidote jusqu’à présent. C’est dans ce contexte que nous proposons des AT modifiées inactives, mais capables de se lier aux molécules d’héparines. Ces AT déplaceraient les molécules d’héparines de l’AT plasmatique, et neutraliseraient leur effet anticoagulant. Pour produire de telles AT, nous avons choisi une approche recombinante et une approche chimique. Dans la première approche, nous avons exprimé le variant AT-N135Q-Pro394. Ce variant possède une activité anti-Xa ou anti-IIa inférieure à 0,02% en présence de dérivés hépariniques, et une affinité à l’héparine 3 fois meilleure, comparée à l’AT plasmatique. En revanche, dans l’approche chimique, nous avons modifié l’AT plasmatique par la 2,3-butanedione (AT-BD), un réactif chimique de caractérisation des arginines. Contrairement au variant, cette AT-BD a une perte d’activité anticoagulante modérée, puis une affinité à l’héparine 20 fois meilleure, comparée à l’AT plasmatique. Malgré ces différences de propriétés biochimiques, ces 2 AT modifiées neutralisent d’une façon similaire les héparines in vitro et sur un modèle murin. Par ailleurs, à l’inverse du sulfate de protamine, nos antidotes n’ont pas d’activité anticoagulante propre sur un test de céphaline activée. Ainsi, ce travail de thèse a permis non seulement de proposer les premiers et les seuls antidotes spécifiques au fondaparinux décrits, mais aussi des antidotes alternatifs pour tous les anticoagulants hépariniques. / Unfractionnated heparin (UFH), low molecular weight heparins (LMWH), and fondaparinux are used therapeutically as anticoagulants. They potentiate antithrombin (AT): a physiological inhibitor of coagulation. Their therapeutic use is associated with a major risk of bleeding. Currently, protamine sulfate is the only antidote available for UFH. It is partially effective for LMWH, and has no effect against fondaparinux, which has no antidote. So, we propose modified inactive AT, but able to bind heparin molecules as antidote of these heparins. These molecules would compete with plasmatic AT for binding to heparins, and neutralize their anticoagulant effect. To produce that AT, we realized a genetic approach and a chemical approach. In the first approach, we expressed the variant AT-N135Q-Pro394 that had an anti-Xa or anti-IIa activity below 0.02% in the presence of heparins, and heparin affinity three times higher, compared to the plasmatic AT. In the chemical approach, we modified the plasmatic AT by 2,3-butanedione (AT-BD), a chemical reagent for arginin’s characterization. The AT-BD had a moderate loss of anticoagulant activity, and a heparin affinity 20 times higher, compared to the plasmatic AT. Despite these differences in biochemical properties, these two modified AT neutralize similarly heparins in vitro and in a mouse model. Moreover, unlike protamine sulfate, our antidotes had not an intrinsic anticoagulant effect in activated partial thromboplastin test. Thus, this PhD-work offers the first and the only specific antidote described to fondaparinux, and it can be used too alternatively for all anticoagulant heparins.

Notre équipe s’intéresse à la relation structure-fonction d’une protéine, l’antithrombine (AT), un inhibiteur physiologique de la coagulation, en vue d’un développement thérapeutique. Cette protéine anticoagulante, capable de lier un motif pentasaccharidique sur les dérivés hépariniques, possède en outre, à fortes concentrations (500%), des propriétés anti-inflammatoires médiées par sa liaison aux héparan-sulfates cellulaires. Ce profil a mené à l’évaluation de l’AT dans des situations associant un emballement de la coagulation et de l’inflammation, comme c’est le cas au cours du sepsis sévère et d’autres situations d’ischémie-reperfusion (I/R). Cependant, les fortes concentrations utilisées dans les études précliniques nécessiteraient d’administrer des doses d’AT incompatibles avec le profil de sécurité de cette protéine anticoagulante.Dans ce contexte, nous avons, au cours de ce travail, caractérisé un variant d’AT (AT-N135Q-Pro394) dépourvu d’activité anticoagulante et doué d’une affinité augmentée pour l’héparine. Ce variant est capable de piéger des dérivés hépariniques et apparait comme un candidat idéal pour une utilisation comme antidote en cas de surdosage en héparine non fractionnée (HNF), héparines de bas poids moléculaire (HBPM) ou fondaparinux. Par ailleurs, ce variant pourrait être utilisé à des doses cytoprotectrices, sans risque hémorragique.Afin de tester cette dernière hypothèse, nous avons développé un modèle d’I/R rénale chez la souris, qui s’accompagne d’une augmentation significative de marqueurs de dysfonction rénale (Urée, Créatinine, Kim-1) et de l’inflammation (expression tissulaire de cxcl-1, il-6). L’AT avait déjà été montrée protectrice (Mizutani et al, Blood 2003) dans un modèle murin comparable. De façon surprenante, nous n’avons observé aucun des effets protecteurs décrits, ni sur l’inflammation ni sur la fonction rénale, et que ce soit avec de l’AT plasmatique, de l’AT recombinante ou encore avec un mélange équimolaire d’AT latente et native. Ce même modèle nous a pourtant permis de mettre en évidence les effets nephroprotecteurs et anti-inflammatoires d’une autre protéine anticoagulante, la protéine C activée. Ces résultats décevants font écho à la rétractation pour fraude de l’article de Mizutani et al. en 2013. Le travail approfondi que nous avons mené nous permet de clarifier la littérature et d’affirmer que l’AT, d’origine plasmatique ou recombinante, ne possèdent pas d’effet protecteur dans l’I/R rénale chez la souris. Dans ces conditions, le variant AT-N135Q-Pro394 n’a pas été testé.Concernant la seconde indication, l’AT-N135Q-Pro394 avait déjà été évaluée in vivo comme antidote aux dérivés hépariniques, HNF, HBPM et fondaparinux, avec d’excellents résultats. Néanmoins, cet effet antidote a été exploré spécifiquement par mesure de l’activité anti-facteur Xa alors que l’AT inhibe plusieurs enzymes de la cascade de coagulation tel que les facteurs VIIa, IXa et IIa. Nous avons donc exploré cet effet antidote dans un test plus global de la coagulation, le test de génération de thrombine (TGT) pour pouvoir le comparer aux autres stratégies non spécifiques utilisées pour antagoniser les dérivés hépariniques (facteur VII activé recombinant, concentré de complexes prothrombiques activés ou protamine). De façon intéressante, dans un plasma mimant un surdosage, notre variant présente un effet antidote supérieur aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine vis-à-vis du fondaparinux et des HBPMs, respectivement, et équivalent au sulfate de protamine vis-à-vis de l’HNF. Enfin, dans du plasma en l’absence d’anticoagulant, l’AT-N135Q-Pro394 ne montre aucun effet sur la génération de thrombine contrairement aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine qui, ajoutés seuls dans du plasma, modifient significativement le profil des TGT / Our team topic focuses on the structural-function relationship of a natural anticoagulant, antithrombin (AT), in order to develop potential therapeutic agents. AT inhibits several serine proteases of the coagulation cascade and its inhibitory activity is increased when AT binds to a pentasaccharidic motif contained within in the heparin derivatives. At high concentrations (500%), AT also exerts anti-inflammatory and cytoprotective properties through its binding to heparan sulfate proteoglycans, making it a good candidate for supportive therapy in clinical settings associating inflammation and coagulation activation. Indeed, AT has already been evaluated in vivo in various models of ischemia-reperfusion injury (IRI) and AT even reached a large-scale clinical trial in severe sepsis. However, the high concentrations of AT that are needed to exert anti-inflammatory properties are inconsistent with the safety profile of this anticoagulant protein.In this context we have further characterized an AT variant (AT-N135Q-Pro394) with increased affinity to heparin but devoid of anticoagulant activity. Indeed, this variant was described to be able to trap heparin derivatives and our work was to pursue the characterization of this variant as an antidote toward heparin derivatives in clinical situations of overdosing. In addition, this AT variant binds to heparan sulfate proteoglycans with higher affinity, as compared to native AT, and appears as a promising cytoprotective agent whose administration would not be associated with any bleeding risk.To test the latter hypothesis, we developed a murine model of renal IRI in which the renal function was severely impaired, as attested by increased kidney injury markers (urea, creatinine, kim-1) and local kidney inflammation (renal gene expression of il-6 and cxcl-1). Indeed, in 2003, Mizutani et al. reported a protective effect of AT in a similar murine model of renal IRI. Surprisingly, we observed none of the described protective effects, neither on inflammation nor renal function, with plasma AT, recombinant AT and an equimolar mixture of native and latent AT. Nevertheless, the same model enabled us to highlight the nephroprotective and anti-inflammatory properties of another anticoagulant protein, activated protein C (APC), as previously reported. These disappointing results coincided with the withdrawal in 2013 of the study of Mizutani et al., and our work allowed us to clarify the literature and to claim that neither recombinant nor plasma-derived native nor latent forms of AT exhibit a protective effect in renal IRI in mice. Under these conditions, AT-N135Q-Pro394 variant has not been tested in our model.AT-N135Q-Pro394 has also been previously shown to efficiently neutralise the anticoagulant activity of heparin derivatives, including unfractionated heparin (UFH), low molecular weight heparins (LMWH) and fondaparinux in vivo. Nevertheless, this reversal effect was only explored by anti-factor Xa assays whereas AT inhibits a number of coagulation proteases, including factors VIIa, IXa and IIa. Therefore, we explored AT-N135Q-Pro394 variant in a more global coagulation assay, the thrombin-generation assay (TGA), in order to compare its activity with non-specific reversal agents used toward heparin derivative overdose (recombinant-activated factor VII, activated prothrombin-complex concentrate or protamine). Interestingly, in plasma mimicking an overdose, our variant demonstrated greater reversal efficiency as compared to hemostatic agents and protamine sulfate toward fondaparinux and LMWH, respectively, and was as efficient as protamine sulfate toward UFH. Finally, when added to native plasma (in the absence of heparin derivative), AT-N135Q-Pro394 showed no effect on thrombin generation unlike hemostatics and protamine sulfate that all significantly affect the TGA profile

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les héparines regroupant les héparines standards (HNF), les héparines de bas poids moléculaire(HBPM), et le fondaparinux, sont des médicaments anticoagulants. Ils potentialisent l'antithrombine (AT) : un inhibiteur physiologique de la coagulation. Leur utilisation en thérapeutique est associée à un risque hémorragique majeur. Actuellement, le sulfate de protamine est le seul antidote disponible vis-à-vis des HNF. Il est partiellement efficace vis-à-vis des HBPM, et n'a aucun effet contre le fondaparinux, qui n'a pas d'antidote jusqu'à présent. C'est dans ce contexte que nous proposons des AT modifiées inactives, mais capables de se lier aux molécules d'héparines. Ces AT déplaceraient les molécules d'héparines de l'AT plasmatique, et neutraliseraient leur effet anticoagulant. Pour produire de telles AT, nous avons choisi une approche recombinante et une approche chimique. Dans la première approche, nous avons exprimé le variant AT-N135Q-Pro394. Ce variant possède une activité anti-Xa ou anti-IIa inférieure à 0,02% en présence de dérivés hépariniques, et une affinité à l'héparine 3 fois meilleure, comparée à l'AT plasmatique. En revanche, dans l'approche chimique, nous avons modifié l'AT plasmatique par la 2,3-butanedione (AT-BD), un réactif chimique de caractérisation des arginines. Contrairement au variant, cette AT-BD a une perte d'activité anticoagulante modérée, puis une affinité à l'héparine 20 fois meilleure, comparée à l'AT plasmatique. Malgré ces différences de propriétés biochimiques, ces 2 AT modifiées neutralisent d'une façon similaire les héparines in vitro et sur un modèle murin. Par ailleurs, à l'inverse du sulfate de protamine, nos antidotes n'ont pas d'activité anticoagulante propre sur un test de céphaline activée. Ainsi, ce travail de thèse a permis non seulement de proposer les premiers et les seuls antidotes spécifiques au fondaparinux décrits, mais aussi des antidotes alternatifs pour tous les anticoagulants hépariniques.

Dans ce travail nous nous sommes intéressés à caractériser les modulateurs génétiques et environnementaux de la génération de thrombine (ETP).Nous avons montré que le taux d’antithrombine (AT) peut être considéré comme un facteur continu de risque de thrombose. L’ETP, le plus élevé, est observé chez les porteurs d’un déficit quantitatif en AT. Les porteurs de la mutation AT Cambridge II présentent également une augmentation de l’ETP. Parallèlement à l’AT, nous avons confirmé l’effet positif de l’allèle PT 20210A sur la génération de thrombine d’autant plus qu’il existe des antécédents personnels de thrombose veineuse (TV). A côté de ces contributions, nous avons confirmé le rôle des taux plasmatiques de fibrinogène et de facteur II, du groupe sanguin et de la prise de contraceptifs oraux sur l’ETP.Nos résultats montrent également que chez le rat, un régime riche en graisses a un effet sur la génération de thrombine. Le régime gras maintient des taux élevés d’ETP après le sevrage, alors qu’une alimentation standard le diminue. Cet effet est partiellement expliqué par l’élévation des taux de facteur VII coagulant et ne suit pas l’évolution des modifications classiques du métabolisme glucidolipidique. Les niveaux élevés d’ETP observés pendant une alimentation riche en graisses se normalisent quatre semaines après le retour à une alimentation standard.En conclusion nos données suggèrent que l’ETP peut être considéré comme un indicateur de l’état prothrombotique des patients, mais son utilisation à l’échelle individuelle dans la prédiction du risque de thrombose veineuse reste à approfondir. La mesure de la génération de thrombine peut être un outil utile pour évaluer les conséquences des modifications du régime alimentaire ou des médicaments pour traiter l’obésité sur le potentiel procoagulant circulant / In this work, we studied genetic and environmental modulators of thrombin generation by endogenous thrombin potential (ETP).We showed that plasma levels of antithrombin (AT) can be considered as risk factors for thrombosis. ETP levels are higher in patients presenting a quantitative defect of AT. In addition, mutation AT Cambridge II is also associated with an increase of ETP. Besides the AT, we confirmed a positive effect of the prothrombin 20210A allele on thrombin generation, especially in presence of venous thrombosis antecedents. These contributions, we have confirmed the role of plasma fibrinogen and factor II, blood group and oral contraceptives on thrombin generation.In addition, our results also showed an effect of high fat diet on thrombin generation in rats. Conversely to the standard fat diet, high fat diet maintened high levels of ETP after weaning. High fat diet-induced effects persisted four weeks after switching to standard fat diet. This effect could be partially explained by higher rates of coagulation factors VII and did not follow classical changes in glucidolipidic metabolism.In conclusion our data suggest that ETP can be considered as an indicator of the prothrombotic state in patients, but require more explanation to predict a risk of venous thrombosis. The measurement of thrombin generation may be a useful tool for assessing the impact of changes in diet or medication to treat obesity on circulating procoagulant potential.

Introduction: Au moins 30% des AVC ischémiques chez les jeunes demeurent inexpliqués malgré une investigation extensive. Le rôle de certains états prothrombotiques (ÉP) dans la thrombose artérielle reste incertain, possiblement à cause du petit nombre de patients, de populations hétérogènes ou d’ÉP analysés individuellement dans les études antérieures, alors que leur prévalence est basse. Méthodologie : Étude cas-témoins sur une cohorte rétrospective (2002-2011). Les patients âgés de ≤50ans lors d’un AVC ischémique furent identifiés sur une base de données hospitalière. Après exclusion des individus ayant une investigation étiologique incomplète, un syndrome antiphospholipide ou aucun ÉP testé, la cohorte fut divisée en groupes cas (AVC idiopathique) et témoins (étiologie identifiée). La prevalence de chaque ÉP fut comparée entre les groupe, ainsi que la présence de ≥2 ÉP (analyse primaire), sans et avec ajustement pour les facteurs de risque non-prothrombotiques (régression logistique). En analyse de sous-groupe, la présence de ≥1 ÉP fut comparée entre les cas avec versus sans foramen ovale perméable (FOP), entre les cas ou contrôles porteurs d’un FOP avec versus sans migraine, de même qu’entre les cas versus témoins de sexe féminin en incluant la contraception orale parmi les ÉP. Résultats : 502 jeunes avec AVC ischémique furent identifiés. Après exclusion de 108 patients, 184 cas et 210 témoins furent comparés, (âge moyen : 39,2 ans, 51% hommes). La prévalence des ÉP ne différait pas entre les cas et contrôles : déficits en protéine S (0,6%), protéine C (3,4%), antithrombine (1,2%), mutation de la prothrombine (2,5%), facteur V Leiden (4,6%), et anticardiolipines (titre 15-40 unités GPL ou MPL; 3,3%). La présence de ≥2 ÉP n’était pas associée à l’AVC idiopathique, avant (p=0,48) ou après ajustement (p=0,74). La présence de ≥1 ÉP ne différait pas entre les sous-groupes étudiés. Conclusion: Il n’y a pas d’association entre les ÉP, isolés ou en association, avec l’AVC ischémique idiopathique chez les jeunes, même en presence de FOP ou de migraine. / Background: Despite extensive workup, more than 30% of ischemic strokes in young adults remain idiopathic. The role of some prothrombotic factors (PF) in arterial thrombosis remains unclear in previous studies. This may be due to small sample sizes, heterogeneous characteristics of populations studied, or analyzing individual PF with low prevalence. Methods: We conducted a case-control study using a retrospective cohort (2002-2011). From a hospital database, we identified patients with ischemic stroke at age ≤50 years. We excluded patients with incomplete baseline investigation or antiphospholipid syndrome, and those without prothrombotic testing. We compared the prevalence of each PF, as well as the presence of ≥2 PF (primary analysis) between cases with idiopathic stroke and controls with defined stroke etiology, before and after adjusting for non-prothrombotic risk factors. By subgroup analysis, we compared the presence of ≥1 PF between cases with versus without patent foramen ovale (PFO), between cases or controls with PFO with versus without migraine, as well as between women (cases versus controls), including oral contraceptives among PF. Results: 502 young ischemic stroke patients were identified. We excluded 108 patients. We analyzed 184 cases and 210 controls (Mean age : 39.2 y-o, 51% male). Prevalence of individual PF did not differ between cases and controls : protein S (0.6%), protein C (3.4%), antithrombin (1.2%) deficiencies, mutant prothrombin (2.5%), factor V Leiden (4.6%), and total anticardiolipin (titers 15-40 units GPL or MPL; 3,3%). There was no association between the presence of ≥2 PF and idiopathic stroke, before (p=0,48) and after adjusting for non-prothrombotic risk factors (p= 0,74). No differences were observed between subgroups for the presence of ≥1 PF. Conclusion: There is no association between prothrombotic risk factors (analyzed individually or as a group) and idiopathic ischemic stroke in the young, even in those with a PFO or with migraine.