Notre équipe s’intéresse à la relation structure-fonction d’une protéine, l’antithrombine (AT), un inhibiteur physiologique de la coagulation, en vue d’un développement thérapeutique. Cette protéine anticoagulante, capable de lier un motif pentasaccharidique sur les dérivés hépariniques, possède en outre, à fortes concentrations (500%), des propriétés anti-inflammatoires médiées par sa liaison aux héparan-sulfates cellulaires. Ce profil a mené à l’évaluation de l’AT dans des situations associant un emballement de la coagulation et de l’inflammation, comme c’est le cas au cours du sepsis sévère et d’autres situations d’ischémie-reperfusion (I/R). Cependant, les fortes concentrations utilisées dans les études précliniques nécessiteraient d’administrer des doses d’AT incompatibles avec le profil de sécurité de cette protéine anticoagulante.Dans ce contexte, nous avons, au cours de ce travail, caractérisé un variant d’AT (AT-N135Q-Pro394) dépourvu d’activité anticoagulante et doué d’une affinité augmentée pour l’héparine. Ce variant est capable de piéger des dérivés hépariniques et apparait comme un candidat idéal pour une utilisation comme antidote en cas de surdosage en héparine non fractionnée (HNF), héparines de bas poids moléculaire (HBPM) ou fondaparinux. Par ailleurs, ce variant pourrait être utilisé à des doses cytoprotectrices, sans risque hémorragique.Afin de tester cette dernière hypothèse, nous avons développé un modèle d’I/R rénale chez la souris, qui s’accompagne d’une augmentation significative de marqueurs de dysfonction rénale (Urée, Créatinine, Kim-1) et de l’inflammation (expression tissulaire de cxcl-1, il-6). L’AT avait déjà été montrée protectrice (Mizutani et al, Blood 2003) dans un modèle murin comparable. De façon surprenante, nous n’avons observé aucun des effets protecteurs décrits, ni sur l’inflammation ni sur la fonction rénale, et que ce soit avec de l’AT plasmatique, de l’AT recombinante ou encore avec un mélange équimolaire d’AT latente et native. Ce même modèle nous a pourtant permis de mettre en évidence les effets nephroprotecteurs et anti-inflammatoires d’une autre protéine anticoagulante, la protéine C activée. Ces résultats décevants font écho à la rétractation pour fraude de l’article de Mizutani et al. en 2013. Le travail approfondi que nous avons mené nous permet de clarifier la littérature et d’affirmer que l’AT, d’origine plasmatique ou recombinante, ne possèdent pas d’effet protecteur dans l’I/R rénale chez la souris. Dans ces conditions, le variant AT-N135Q-Pro394 n’a pas été testé.Concernant la seconde indication, l’AT-N135Q-Pro394 avait déjà été évaluée in vivo comme antidote aux dérivés hépariniques, HNF, HBPM et fondaparinux, avec d’excellents résultats. Néanmoins, cet effet antidote a été exploré spécifiquement par mesure de l’activité anti-facteur Xa alors que l’AT inhibe plusieurs enzymes de la cascade de coagulation tel que les facteurs VIIa, IXa et IIa. Nous avons donc exploré cet effet antidote dans un test plus global de la coagulation, le test de génération de thrombine (TGT) pour pouvoir le comparer aux autres stratégies non spécifiques utilisées pour antagoniser les dérivés hépariniques (facteur VII activé recombinant, concentré de complexes prothrombiques activés ou protamine). De façon intéressante, dans un plasma mimant un surdosage, notre variant présente un effet antidote supérieur aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine vis-à-vis du fondaparinux et des HBPMs, respectivement, et équivalent au sulfate de protamine vis-à-vis de l’HNF. Enfin, dans du plasma en l’absence d’anticoagulant, l’AT-N135Q-Pro394 ne montre aucun effet sur la génération de thrombine contrairement aux agents hémostatiques et au sulfate de protamine qui, ajoutés seuls dans du plasma, modifient significativement le profil des TGT / Our team topic focuses on the structural-function relationship of a natural anticoagulant, antithrombin (AT), in order to develop potential therapeutic agents. AT inhibits several serine proteases of the coagulation cascade and its inhibitory activity is increased when AT binds to a pentasaccharidic motif contained within in the heparin derivatives. At high concentrations (500%), AT also exerts anti-inflammatory and cytoprotective properties through its binding to heparan sulfate proteoglycans, making it a good candidate for supportive therapy in clinical settings associating inflammation and coagulation activation. Indeed, AT has already been evaluated in vivo in various models of ischemia-reperfusion injury (IRI) and AT even reached a large-scale clinical trial in severe sepsis. However, the high concentrations of AT that are needed to exert anti-inflammatory properties are inconsistent with the safety profile of this anticoagulant protein.In this context we have further characterized an AT variant (AT-N135Q-Pro394) with increased affinity to heparin but devoid of anticoagulant activity. Indeed, this variant was described to be able to trap heparin derivatives and our work was to pursue the characterization of this variant as an antidote toward heparin derivatives in clinical situations of overdosing. In addition, this AT variant binds to heparan sulfate proteoglycans with higher affinity, as compared to native AT, and appears as a promising cytoprotective agent whose administration would not be associated with any bleeding risk.To test the latter hypothesis, we developed a murine model of renal IRI in which the renal function was severely impaired, as attested by increased kidney injury markers (urea, creatinine, kim-1) and local kidney inflammation (renal gene expression of il-6 and cxcl-1). Indeed, in 2003, Mizutani et al. reported a protective effect of AT in a similar murine model of renal IRI. Surprisingly, we observed none of the described protective effects, neither on inflammation nor renal function, with plasma AT, recombinant AT and an equimolar mixture of native and latent AT. Nevertheless, the same model enabled us to highlight the nephroprotective and anti-inflammatory properties of another anticoagulant protein, activated protein C (APC), as previously reported. These disappointing results coincided with the withdrawal in 2013 of the study of Mizutani et al., and our work allowed us to clarify the literature and to claim that neither recombinant nor plasma-derived native nor latent forms of AT exhibit a protective effect in renal IRI in mice. Under these conditions, AT-N135Q-Pro394 variant has not been tested in our model.AT-N135Q-Pro394 has also been previously shown to efficiently neutralise the anticoagulant activity of heparin derivatives, including unfractionated heparin (UFH), low molecular weight heparins (LMWH) and fondaparinux in vivo. Nevertheless, this reversal effect was only explored by anti-factor Xa assays whereas AT inhibits a number of coagulation proteases, including factors VIIa, IXa and IIa. Therefore, we explored AT-N135Q-Pro394 variant in a more global coagulation assay, the thrombin-generation assay (TGA), in order to compare its activity with non-specific reversal agents used toward heparin derivative overdose (recombinant-activated factor VII, activated prothrombin-complex concentrate or protamine). Interestingly, in plasma mimicking an overdose, our variant demonstrated greater reversal efficiency as compared to hemostatic agents and protamine sulfate toward fondaparinux and LMWH, respectively, and was as efficient as protamine sulfate toward UFH. Finally, when added to native plasma (in the absence of heparin derivative), AT-N135Q-Pro394 showed no effect on thrombin generation unlike hemostatics and protamine sulfate that all significantly affect the TGA profile

Malgré les améliorations significatives apportées par la thérapie antirétrovirale à la durée et à la qualité de vie des personnes vivant avec le VIH, elle ne permet pas de complètement éliminer le virus de l’organisme. La persistance du virus est due à l’existence de réservoirs viraux, des cellules infectées de manière latente par le VIH. Ces réservoirs nécessitent un traitement antirétroviral à vie, car le virus réapparait en cas d’interruption du traitement, signifiant que l’immunité des cellules T spécifiques du VIH n’est pas restaurée. Bien que cela soit théoriquement possible, seule une fraction de personne vivant avec le VIH, appelée Contrôleurs Élites, parvient à contrôler le virus en absence de traitement. Pour la majorité des individus, l’infection par le VIH entraîne une évasion virologique ainsi qu’un épuisement et une altération des réponses cellulaires spécifiques au VIH. À ce jour, les stratégies thérapeutiques visant à éliminer les réservoirs viraux ont échoué, en partie en raison de la présence de provirus principalement défectifs dans ces réservoirs. Dans cette thèse, nous avons identifié et caractérisé les provirus défectifs latents du VIH pouvant être transcrits et/ou traduits, ainsi que la relation entre ces réservoirs et les réponses immunitaires spécifique du virus. Dans un premier temps, nous avons montré que bien que défectifs et potentiellement incapable de donner lieu à la réplication virale, ces provirus peuvent être transcrits et traduits soit par réactivation à l’aide d’agents de réversion de la latence, soit de manière spontanée. Ces réservoirs donnent lieu à plusieurs populations de réservoirs, en fonction de la présence ou de l’absence certains gènes viraux. Nous avons déterminé que ces différentes populations sont régies par le profil génomique des cellules infectées. Les provirus identifiés étaient très rarement intacts, mais l’intégrité du génome était associée à la processivité de la transcription et de la traduction. Dans un second objectif, nous avons caractérisé les réponses T CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH avant et après le début du traitement antirétroviral. Nous avons observé que les réponses T CD4+ spécifiques étaient comparables pendant l’infection chronique et après le traitement. En revanche, les réponses T CD8+ diminuaient considérablement après l’initiation de la thérapie antirétrovirale. Nous avons également constaté que la taille du réservoir traductionnellement actif pendant le traitement antirétroviral était négativement associée aux réponses T CD8+ spécifiques avant le début de la thérapie, tandis que le réservoir incapable de traduire les protéines du VIH subsistait. Ces observations mettent en évidence le rôle des cellules T CD8+ dans le contrôle de l’infection par le VIH, comme nous l’avons observé chez les Contrôleurs Élites. Nos travaux contribuent à une meilleure compréhension des réservoirs viraux du VIH, qui pourraient potentiellement être impliqués dans l’inflammation chronique et la dysfonction immunitaire associé à la pathogénèse du VIH. / Despite the significant improvement brought by antiretroviral therapy in the duration and quality of life for people living with HIV, it does not completely eliminate the virus from the body. The persistence of the virus is due to the existence of viral reservoirs, which are cells latently infected with HIV. These reservoirs require lifelong antiretroviral treatment because of the viral rebound reoccurring in case of treatment interruption. This suggests that HIV-specific T cell immunity is not restored. Although theoretically possible, only a fraction of people living with HIV, known as Elite Controllers, are able to control the virus in the absence of treatment. For the majority of individuals, HIV infection leads to virologic escape, as well as exhaustion and altered cellular responses to HIV. To date, therapeutic strategies aimed at eliminating viral reservoirs have failed, partly due to the presence of predominantly defective proviruses in these reservoirs. In this thesis, we have identified and characterized latent defective proviruses of HIV that can be transcribed and/or translated. We also have characterized the relationship between these reservoirs and the specific immune responses to the virus. Firstly, we have shown that although defective and potentially replication-incompetent, these proviruses can be transcribed and translated either through reactivation using latency reversal agents or spontaneously. These reservoirs give rise to several populations of reservoirs, depending on the presence or absence of certain viral genes. We have determined that these different populations are governed by the genomic profile of infected cells. The identified proviruses were rarely intact, and genome integrity was associated with the processivity of transcription and translation. Then, we characterized the specific CD4+ and CD8+ T cell responses to HIV before and after the initiation of antiretroviral treatment. We observed that specific CD4+ T cell responses were comparable during chronic infection and after treatment. However, CD8+ T cell responses decreased significantly after the initiation of antiretroviral therapy. We also found that the size of the translationally active reservoir during antiretroviral treatment was negatively associated with the specific CD8+ T cell responses prior to treatment initiation, while the translation-incompetent cells persisted. These observations highlight the role of CD8+ T cells in the control of HIV infection, as observed in Elite Controllers. Our work contributes to a better understanding of HIV viral reservoirs, which could potentially be involved in chronic inflammation and immune dysfunction associated with HIV pathogenesis.