Toxoplasma gondii ist ein obligater intrazellulärer Parasit, der bei Menschen und Nutztieren Toxoplasmose verursacht. Die Phospholipid-Biosynthese ist entscheidend für das erfolgreiche intrazelluläre Überleben und die Replikation des Parasiten, da sie eine wichtige Rolle bei der Biogenese von Membranorganellen, der Signal- transduktion und anderen zellulären Prozessen spielt. Hier untersuchten wir die physiologische Bedeutung von zwei Synthesewegen, die für PtdEtn und PtdIns verantwortlich sind. Wir zeigen das Vorhandensein einer neuartigen PtdIns-Synthase (PIS) in T. gondii, die als TgPIS bezeichnet wird und ein funktionelles Enzym mit einem katalytisch wichtigen CDP-Alkohol- Phosphotransferase-Motiv codiert, das sich ausschließlich im Golgi-Apparat befindet. Der Parasit importiert Myoinosit aus dem Milieu und verwendet es zusammen mit de novo synthetisiertem CDP- Diacylglycerin, um PtdIns zu produzieren. Eine durch Auxin induzierbare bedingte Unterdrückung von TgPIS schaltet den Lysezyklus des Parasiten aufgrund von Defekten in der Replikation, Motilität und Austritt in Säugetierzellen aus. Das Lipidom-Profiling der PIS-Mutante zeigt eine selektive Reduktion bestimmter PtdIns- und PtdThr-Spezies, wohingegen ausgewählte PtdGro-, PtdSer- und BMP-Spezies erhöht sind, was auf eine enge Interregulation und Homöostase von anionischen Phospholipiden zur Aufrechterhaltung der Membranintegrität hindeutet. Zusätzlich identifizierten wir eine Ethanolamin-Cytidyltransferase (TgECT), das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des Kennedy-Signalwegs, das im Cytosol lokalisiert ist. Das Enzym ist eindeutig für den Lysezyklus essentiell, da seine genetische Ablation nicht durchführbar ist und der durch Auxin meditierte bedingte Abbau des Proteins das Parasitenwachstum in Plaqueassays stark beeinträchtigt. Die Lipidomanalyse der Mutante identifizierte eine wichtige Rolle bei der Biogenese ausgewählter Arten von PtdEtn, PtdSer und PtdThr. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass TgECT für die Erzeugung von Ethanolamin-Phosphor-Ceramid (EPC) erforderlich ist, einem seltenen Sphingolipid, das nur eine begrenzte Anzahl von Organismen enthalten. / Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that causes Toxoplasmosis in human and livestock. Phospholipid biosynthesis is crucial for the successful intracellular survival and replication of the parasites, as the phospholipids have important roles in the biogenesis of membrane organelles, signal transduction and other cellular processes. Here, we dissected the physiological importance of two pathways accounting for the synthesis of PtdEtn and PtdIns. We demonstrated the presence of a novel PtdIns synthase (PIS) in T.gondii termed TgPIS, expressing a functional enzyme with a catalytically vital CDP-alcohol phosphotransferase motif, which resides exclusively in the Golgi body. The parasite imports myo-inositol from milieu, and co-utilizes de novo-synthesized CDP-diacylglycerol to produce PtdIns. An auxin-inducible conditional repression of TgPIS abrogated the lytic cycle of the parasite in mammalian cells due to defects in the replication, motility and egress. Lipidomic profiling of the PIS mutant demonstrated selective reduction of certain PtdIns and PtdThr species, whereas selected PtdGro, PtdSer and BMP species were increased, which suggested a tight inter-regulation and homeostasis of anionic phospholipids to maintain the membrane integrity. In addition, we identified an ethanolamine cytidyltransferase (TgECT), the rate-limiting enzyme of Kennedy pathway, which is localized in the cytosol. The enzyme is clearly essential for the lytic cycle as its genetic ablation was not feasible, and auxin-meditated conditional knockdown severely impaired the parasite growth in plaque assays. Similarly, lipidomic analysis of the mutant identified an important role in the biogenesis of selected species of PtdEtn, PtdSer and PtdThr. Moreover, we discovered that TgECT is required for the generation of ethanolamine-phosphory ceramide (EPC), a rare sphingolipid present only a limited number of organisms.

Das Überleben und die Vermehrung der parasitär lebenden Apicomplexa setzen eine effiziente Synthese von Phospholipiden während ihres gesamten Lebenszyklus voraus. In dieser Arbeit nutzten wir zunächst Eimeria falciformis um den Prozess der Lipid-Biogenese in Sporozoiten zu untersuchen. Durch Lipidomics-Analysen wurde das Auftreten von zwei exklusiven Lipiden, Phosphatidylthreonin (PtdThr) und Inositolphosphorylceramid. Der Parasit exprimiert fast das gesamte Lipid-Biogenese- Netzwerk aus eukaryotischen und prokaryotischen Enzymen. Toxoplasma gondii diente als genmanipulierbarer Ersatz für die Untersuchung der Eimeria-Enzyme, mit dem wir ein stark räumlich segmentiertes Netzwerk der Lipidsynthese im Apicoplast, ER, Golgi und Mitochondrium zeigen konnten. Ebenso legte die Komplementierung einer T. gondii-Mutante mit einer PtdThr-Synthase von E. falciformis eine konvergente Funktion von PtdThr für den lytischen Zyklus von Kokzidien-Parasiten nahe. Außerdem setzten wir T. gondii als etablierten Modelorganismus ein, um die De- novo-Synthese und die metabolische Rolle eines bedeutenden Lipidvorläufers, CDP- Diacylglycerin (CDP-DAG), zu untersuchen. Wir konnten zwei phylogenetisch divergente CDP-DAG-Synthase (CDS) Enzyme in T. gondii nachweisen. Das eukaryotisch-typische TgCDS1 und das prokaryotisch-typische TgCDS2 lokalisieren im ER bzw. im Apicoplast. Der konditionierte Knockdown von TgCDS1 bremst das Parasitenwachstum stark ab, was den fast vollständigen Verlust der Virulenz im Mausmodell hervorruft. Das restliche marginale Wachstum der TgCDS1 Mutante wird durch zusätzliche Deletion der TgCDS2 verhindert. Lipidomics-Analysen zeigten eine signifikante und spezifische Abnahme der Phosphatidylinositol (PtdIns)- und Phosphatidylglycerol (PtdGro)-Level bei Verlust der TgCDS1- bzw. TgCDS2-Gene. Zusammengenommen zeigt unsere Arbeit ein Phospholipid-Biogenese-Modell mit erstaunlicher Kooperation verschiedener Organellen und einem extensiven Lipidtransport im Parasiten. / The survival and proliferation of apicomplexan parasites oblige efficient synthesis of phospholipids throughout their life cycles. Here, we first deployed Eimeria falciformis to investigate the process of lipid biogenesis in sporozoites. Lipidomics analyses demonstrate the occurrence of two exclusive lipids phosphatidylthreonine (PtdThr) and inositol phosphorylceramide along with other prototypical lipids. The parasite expresses nearly the entire lipid biogenesis network, which is an evolutionary mosaic of eukaryotic- and prokaryotic-type enzymes. Using Toxoplasma gondii as a gene- tractable surrogate to examine the Eimeria enzymes, we show a highly compartmentalized network of lipid synthesis distributed primarily in the apicoplast, ER, Golgi and mitochondrion. Likewise, trans-species complementation of a T. gondii mutant with a PtdThr synthase from E. falciformis suggests a convergent function of PtdThr in promoting the lytic cycle in coccidian parasites. We also employed the well-established model parasite T. gondii to explore de novo synthesis and metabolic roles of one major lipid precursor CDP-diacylglycerol (CDP- DAG). We report the occurrence of two phylogenetically divergent CDP-DAG synthase (CDS) enzymes in T. gondii. Eukaryotic-type TgCDS1 and prokaryotic-type TgCDS2 reside in the ER and apicoplast, respectively. Conditional knockdown of TgCDS1 severely attenuates parasite growth, which translates into a nearly complete loss of virulence in a mouse model. Residual growth of the TgCDS1 mutant is abolished by subsequent deletion of TgCDS2. Lipidomics analyses reveal significant and specific decline in phosphatidylinositol (PtdIns) and phosphatidylglycerol (PtdGro) upon loss of TgCDS1 and TgCDS2, respectively. Taken together, our work establishes a phospholipid biogenesis model involving significant inter-organelle cooperation and lipid trafficking in apicomplexan parasites.