Submitted by Almir Azevedo (barbio1313@gmail.com) on 2017-06-23T12:20:40Z No. of bitstreams: 1 dissertação mestrado ien 2015 Fagner Santos do Carmo.pdf: 2634463 bytes, checksum: 492adfb185de630bd9eb4395153ea9a5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T12:20:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertação mestrado ien 2015 Fagner Santos do Carmo.pdf: 2634463 bytes, checksum: 492adfb185de630bd9eb4395153ea9a5 (MD5) Previous issue date: 2015-06 / O câncer de próstata é o segundo tipo mais prevalente em homens no mundo inteiro, originando milhares de mortes todos os anos e apresentando elevadas taxas de incidência futura de novos acometimentos. Comparada as técnicas diagnósticas disponíveis, a conjugação de aptâmeros a radionuclídeos, mostra-se eficaz na entrega de drogas a processos tumorais, onde há a capacidade de rastreamento da rota fisiológica percorrida pelo radiomarcado e da mensuração do concentrado em regiões anatômicas específicas através da PET/CT. A afinidade e a especificidade dos aptâmeros promovem o direcionamento seletivo do radioisótopo a tecidos e órgãos MUC1positivos. Dessa forma, este trabalho objetivou a radiomarcação do anti-MUC1 aos radioisótopos 68Ga e 22Na como agente de imagiologia molecular in vivo para o diagnóstico precoce e preciso do processo carcinogênico em próstata. A radiomarcação do aptâmero anti-MUC1 com o 68Ga e o 22Na foi avaliada com a incubação do oligonucleotídeo diretamente a soluções individuais dos radioisótopos em diferentes tempos e temperatura. Apresentando-se eficiente em todos os processos independentemente das variações aplicadas. Corridas cromatográficas em CCD foram aplicadas obtendo marcação de um composto com pureza radioquímica média de 89,07% (89,07±7,79) para o 68Ga e 90,37% (90,37±13,61) para o 22Na, valores superiores ao fator de aceitação para a implementação clínica. Para confrontar os resultados da CCD, a solução radiomarcada também foi sujeita a análises em CLAE, onde foi confirmada a radiomarcação do aptâmero anti-MUC1 com o 68Ga no tempo de retenção médio de 4,842 minutos (4,842±0,03) e 3,679 (3,679±0,51) para o 22Na. No intuito de avaliar o comportamento do oligonucleotídeo radiomarcado in vivo, o anti-MUC1 foi conjugado ao 99mTc e administrado a ratos Wistar sadios, revelando rápido clareamento sanguíneo (0,10±0,06), alta captação do material radioativo no rins (esquerdo 0,94±011 e direito 1,01±0,32) devido a excreção preferencial ser renal. A baixa captação em fígado (0,19±0,09) evidenciou a estabilidade do composto radiomarcado e insignificativas captações de órgãos abdominais mostraram a tendência da minimização dos efeitos da radiação de fundo. Não foi possível detectar a captação cerebral, portanto o complexo não atravessa a barreira hematoencefálica e todos os outros órgãos obtiveram captação em faixa muito baixa ou não detectável. Os resultados de marcação e biodistribuição descritos neste estudo determinaram o potencial do aptâmero anti-MUC1 radiomarcado aos radioisótopos emissores de prósiton 68Ga e 22Na a atuar como agente de imagiologia molecular na área da medicina nuclear.

Microesferas lipídicas (ML) são excelentes sistemas de delivery de drogas e são relativamente estáveis. O Objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema capaz de encapsular proteínas antigênicas da membrana de L. amazonensis. Proteínas de membrana são importantes na formulação de vacinas, uma vez que estas proteínas são os primeiros componentes celulares a entrarem em contato com a célula hospedeira, provocando e mediando a resposta imune. Esta é uma ferramenta útil para evitar ou inativar a invasão do parasita. As ML são constituídas por óleo de soja (OS), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol e extrato de proteínas solubilizadas (EPS) (previamente tratadas para remoção do detergente). Primeiramente foram ensaiadas formulações de ML contendo álcool polivinílico (PVA). Estudos de microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que as ML são formadas quando PVA 3% (p/v) é usado na formulação. Além disso, foi feito marcação das proteínas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e a microscopia de fluorescência revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes, o qual indicou a encapsulação das proteínas na região lipofílica das ML. A presença do PVA na formulação das ML acarretou em algumas limitações cruciais para a continuidade da nossa pesquisa, levando a substituição deste pelo glicerol. Com o objetivo de otimizar nossa formulação foram avaliadas cinco diferentes formulações contendo glicerol 2,5% (p/v). Nestas formulações foram avaliadas as relações molares de DPPC:Colesterol:OS. As partículas formadas apresentaram um diâmetro médio de 200nm, baixa polidispersão, e estabilidade por um período de 30 dias, de acordo com ensaios de espalhamento de luz dinâmico. Ensaios de gradiente de densidade de sacarose das ML mostraram que proteínas e lipídios se encontram juntos no gradiente de sacarose (5-50% p/v) sugerindo que a preparação de ML foi homogênea e que as proteínas estão interagindo com este sistema lipídico. Termogramas obtidos por calorimetria diferencial de varredura (DSC) corroboram com a formação de um sistema de ML-proteína estáveis, além de fornecer indícios que as proteínas se encontram localizadas no núcleo oleoso das ML. Os resultados mostraram que foram encapsulados 85% das proteínas do EPS nas microesferas, e que estas não perderam sua atividade antigênica mesmo após todo o complexo processo de preparação do sistema. Estudos de viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos e o ensaio de geração de nitrito mostraram que o sistema ML associado às proteínas não apresenta efeito citotóxico para os macrófagos e ainda estimula a produção de NO nos mesmos. Com isso, podemos sugerir que ML contendo proteínas antigênicas de membrana de L. amazonensis parece ser um promissor sistema para terapia da leishmaniose. / Lipid microspheres (LM) are excellent drug delivery systems and they are also relatively stable. The aim of this work was to develop a lipid-based system to encapsulate antigenic membrane proteins from Leishmania amazonensis. Membrane proteins are important for vaccine formulation because these proteins are the first ones to get in contact with the host cell, triggering the cell mediated immune response. This is a useful tool to avoid or to inactivate parasite invasion. LM are constituted by soybean oil (SO), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), cholesterol and solubilized protein extract (SPE) (previously treated to remove detergent). First, the LM formulations containing polyvinylic alcohol (PVA) were assayed. Scanning electronic microscopy (SEM) studies have shown that LM are formed when 3% PVA (w/v) is used in the formulation. Besides, proteins were marked with fluorescein Isothiocyanate (FITC) and the fluorescence microscopy showed the presence of fluorescent spherical structures, which indicated protein encapsulation in the lipophilic region of the LM. The presence of PVA in the LM formulation has caused some crucial limitations for the continuity of the research, leading to its substitution for glycerol. In order to optimize the system, five different formulations containing 2.5% glycerol (w/v) were evaluated for DPPC:Cholesterol:OS molar ratios. The particles formed (LM-protein) presented an average diameter of 200 nm, low polydispersion and good stability for a period of 30 days, according to dynamic light scattering assays. Isopycnic density gradient centrifugation of LM-protein showed that proteins and lipids floated in the sucrose gradient (5-50% w/v) suggesting that the LM preparation is homogeneous and that the proteins are interacting with these systems. Thermograms obtained by differential scanning calorimetry (DSC) corroborate with the formation of a stable LM system, besides giving indication that proteins are located in the oily LM core. The results show that 85% of the SPE proteins were encapsulated in the LM without loosely their antigenic activity even after the system preparation process. Viability studies of the peritoneal macrophage murines and the nitrate assay generation have shown that system does not have a cytotoxic effect for the macrophages and it yet stimulate their NO production. Therefore, we conclude that LM, encapsulated with L. amazonensis membrane antigenic proteins seems to be a promising system for for therapy of Leishmaniasis

Microesferas lipídicas (ML) são excelentes sistemas de delivery de drogas e são relativamente estáveis. O Objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema capaz de encapsular proteínas antigênicas da membrana de L. amazonensis. Proteínas de membrana são importantes na formulação de vacinas, uma vez que estas proteínas são os primeiros componentes celulares a entrarem em contato com a célula hospedeira, provocando e mediando a resposta imune. Esta é uma ferramenta útil para evitar ou inativar a invasão do parasita. As ML são constituídas por óleo de soja (OS), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), colesterol e extrato de proteínas solubilizadas (EPS) (previamente tratadas para remoção do detergente). Primeiramente foram ensaiadas formulações de ML contendo álcool polivinílico (PVA). Estudos de microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostraram que as ML são formadas quando PVA 3% (p/v) é usado na formulação. Além disso, foi feito marcação das proteínas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e a microscopia de fluorescência revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes, o qual indicou a encapsulação das proteínas na região lipofílica das ML. A presença do PVA na formulação das ML acarretou em algumas limitações cruciais para a continuidade da nossa pesquisa, levando a substituição deste pelo glicerol. Com o objetivo de otimizar nossa formulação foram avaliadas cinco diferentes formulações contendo glicerol 2,5% (p/v). Nestas formulações foram avaliadas as relações molares de DPPC:Colesterol:OS. As partículas formadas apresentaram um diâmetro médio de 200nm, baixa polidispersão, e estabilidade por um período de 30 dias, de acordo com ensaios de espalhamento de luz dinâmico. Ensaios de gradiente de densidade de sacarose das ML mostraram que proteínas e lipídios se encontram juntos no gradiente de sacarose (5-50% p/v) sugerindo que a preparação de ML foi homogênea e que as proteínas estão interagindo com este sistema lipídico. Termogramas obtidos por calorimetria diferencial de varredura (DSC) corroboram com a formação de um sistema de ML-proteína estáveis, além de fornecer indícios que as proteínas se encontram localizadas no núcleo oleoso das ML. Os resultados mostraram que foram encapsulados 85% das proteínas do EPS nas microesferas, e que estas não perderam sua atividade antigênica mesmo após todo o complexo processo de preparação do sistema. Estudos de viabilidade dos macrófagos peritoneais murinos e o ensaio de geração de nitrito mostraram que o sistema ML associado às proteínas não apresenta efeito citotóxico para os macrófagos e ainda estimula a produção de NO nos mesmos. Com isso, podemos sugerir que ML contendo proteínas antigênicas de membrana de L. amazonensis parece ser um promissor sistema para terapia da leishmaniose. / Lipid microspheres (LM) are excellent drug delivery systems and they are also relatively stable. The aim of this work was to develop a lipid-based system to encapsulate antigenic membrane proteins from Leishmania amazonensis. Membrane proteins are important for vaccine formulation because these proteins are the first ones to get in contact with the host cell, triggering the cell mediated immune response. This is a useful tool to avoid or to inactivate parasite invasion. LM are constituted by soybean oil (SO), dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC), cholesterol and solubilized protein extract (SPE) (previously treated to remove detergent). First, the LM formulations containing polyvinylic alcohol (PVA) were assayed. Scanning electronic microscopy (SEM) studies have shown that LM are formed when 3% PVA (w/v) is used in the formulation. Besides, proteins were marked with fluorescein Isothiocyanate (FITC) and the fluorescence microscopy showed the presence of fluorescent spherical structures, which indicated protein encapsulation in the lipophilic region of the LM. The presence of PVA in the LM formulation has caused some crucial limitations for the continuity of the research, leading to its substitution for glycerol. In order to optimize the system, five different formulations containing 2.5% glycerol (w/v) were evaluated for DPPC:Cholesterol:OS molar ratios. The particles formed (LM-protein) presented an average diameter of 200 nm, low polydispersion and good stability for a period of 30 days, according to dynamic light scattering assays. Isopycnic density gradient centrifugation of LM-protein showed that proteins and lipids floated in the sucrose gradient (5-50% w/v) suggesting that the LM preparation is homogeneous and that the proteins are interacting with these systems. Thermograms obtained by differential scanning calorimetry (DSC) corroborate with the formation of a stable LM system, besides giving indication that proteins are located in the oily LM core. The results show that 85% of the SPE proteins were encapsulated in the LM without loosely their antigenic activity even after the system preparation process. Viability studies of the peritoneal macrophage murines and the nitrate assay generation have shown that system does not have a cytotoxic effect for the macrophages and it yet stimulate their NO production. Therefore, we conclude that LM, encapsulated with L. amazonensis membrane antigenic proteins seems to be a promising system for for therapy of Leishmaniasis