A parede celular das plantas inclui componentes polissacarídeos complexos, e a sacarificação destes polímeros necessita da ação de conjuntos de enzimas que atuem em sinergia. Enzimas podem formar complexos multi-enzimáticos que possuem mais de uma atividade catalítica derivada de domínios distintos de uma mesma cadeia polipeptídica. O objetivo deste trabalho foi construir uma enzima bifuncional com os domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) para desconstrução de material lignocelulósico de cana-de-açúcar. Para isso, dois diferentes domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) oriundos de Clostridium thermocellum foram fundidas para criar a quimera feruloil esterase/acetil-xilano esterase (FaeAxe). O desenho racional da quimera foi feito utilizando-se de métodos computacionais, que permitiram a criação de um modelo estrutural da enzima. A construção da quimera foi feita por overlap PCR, clonada em vetor pET-SUMO e expressa em Escherichia coli. As duas enzimas parentais (Fae e Axe) foram clonadas em vetor pET28 e expressas em E. coli. Durante a etapa de expressão, observou-se que todas as enzimas foram expressas na forma solúvel. As enzimas feruloil esterase e acetilxilano esterase têm como substrato o polímero arabinoxilano, cuja degradação é uma etapa chave na sacarificação de biomassa. Dessa forma, as atividades da quimera, bem como das enzimas parentais foram testadas contra polímeros arabinoxilano de trigo e arabinoxilano de cana-de-açúcar após a hidrólise pela endoxilanase GH11 de Bacillus Subtilis e analisadas por meio de espectrometria de massas. A atividade desacetilase da enzima parental acetil-xilano esterase e da quimera FaeAxe foram confirmadas, evidenciando que a quimera preservou essa atividade catalítica. A atividade da enzima feruloil esterase e da quimera FaeAxe na remoção de ácido ferúlico dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase GH11 não foi observada / The plant cell wall is comprised of a matrix of polysaccharides and saccharification of these polymers requires the joint action of diverse enzymes. Enzymes may form multi-enzymatic complexes that have more than one catalytic activity derived from different domains of a single polypeptide chain. The aim of this work was to construct a bifunctional enzyme with two catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) for degradation of sugar cane lignocellulosic material. The two different catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) from Clostridium thermocellum were fused to generate a bifunctional chimera feruloyl esterase/acetylxylan esterase (FaeAxe). A molecular model was created by rational design using a 3D-structure guided strategy. The fusion was created using overlap PCR, and the resulting product was cloned into the pETSUMO vector. The chimeric protein and the parental enzymes were expressed in Escherichia coli and purified and the enzymes were expressed in soluble form. Xylanases, feruloyl esterases and acetylxylan esterases degrade arabinoxylan polymers and their activity is a key step in the saccharification of biomass. The catalytic properties of the chimera and of the parental enzymes were tested against wheat and sugarcane arabinoxylan polymers after hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis and analyzed by mass spectroscopy. The deacetylase activity of acetyl-xylan esterase parental enzyme and FaeAxe chimera were confirmed, showing that the chimera kept the deacetylase activity. After hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis the feruloyl esterase and FaeAxe chimera activities on ferulic acid removal were not observed

A parede celular das plantas inclui componentes polissacarídeos complexos, e a sacarificação destes polímeros necessita da ação de conjuntos de enzimas que atuem em sinergia. Enzimas podem formar complexos multi-enzimáticos que possuem mais de uma atividade catalítica derivada de domínios distintos de uma mesma cadeia polipeptídica. O objetivo deste trabalho foi construir uma enzima bifuncional com os domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) para desconstrução de material lignocelulósico de cana-de-açúcar. Para isso, dois diferentes domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) oriundos de Clostridium thermocellum foram fundidas para criar a quimera feruloil esterase/acetil-xilano esterase (FaeAxe). O desenho racional da quimera foi feito utilizando-se de métodos computacionais, que permitiram a criação de um modelo estrutural da enzima. A construção da quimera foi feita por overlap PCR, clonada em vetor pET-SUMO e expressa em Escherichia coli. As duas enzimas parentais (Fae e Axe) foram clonadas em vetor pET28 e expressas em E. coli. Durante a etapa de expressão, observou-se que todas as enzimas foram expressas na forma solúvel. As enzimas feruloil esterase e acetilxilano esterase têm como substrato o polímero arabinoxilano, cuja degradação é uma etapa chave na sacarificação de biomassa. Dessa forma, as atividades da quimera, bem como das enzimas parentais foram testadas contra polímeros arabinoxilano de trigo e arabinoxilano de cana-de-açúcar após a hidrólise pela endoxilanase GH11 de Bacillus Subtilis e analisadas por meio de espectrometria de massas. A atividade desacetilase da enzima parental acetil-xilano esterase e da quimera FaeAxe foram confirmadas, evidenciando que a quimera preservou essa atividade catalítica. A atividade da enzima feruloil esterase e da quimera FaeAxe na remoção de ácido ferúlico dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase GH11 não foi observada / The plant cell wall is comprised of a matrix of polysaccharides and saccharification of these polymers requires the joint action of diverse enzymes. Enzymes may form multi-enzymatic complexes that have more than one catalytic activity derived from different domains of a single polypeptide chain. The aim of this work was to construct a bifunctional enzyme with two catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) for degradation of sugar cane lignocellulosic material. The two different catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) from Clostridium thermocellum were fused to generate a bifunctional chimera feruloyl esterase/acetylxylan esterase (FaeAxe). A molecular model was created by rational design using a 3D-structure guided strategy. The fusion was created using overlap PCR, and the resulting product was cloned into the pETSUMO vector. The chimeric protein and the parental enzymes were expressed in Escherichia coli and purified and the enzymes were expressed in soluble form. Xylanases, feruloyl esterases and acetylxylan esterases degrade arabinoxylan polymers and their activity is a key step in the saccharification of biomass. The catalytic properties of the chimera and of the parental enzymes were tested against wheat and sugarcane arabinoxylan polymers after hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis and analyzed by mass spectroscopy. The deacetylase activity of acetyl-xylan esterase parental enzyme and FaeAxe chimera were confirmed, showing that the chimera kept the deacetylase activity. After hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis the feruloyl esterase and FaeAxe chimera activities on ferulic acid removal were not observed

O Brasil, segundo maior produtor mundial de biocombustíveis, produz etanol a partir da extração e fermentação de sacarose de colmos de cana-de-açúcar. A utilização da energia presente nas ligações químicas entre os carboidratos da parede celular (celulose, hemiceluloses e pectina), das biomassas de folha e bagaço (hoje ambos considerados resíduos de produção), é uma possibilidade para o incremento, de cerca de 3 vezes o valor atual, na produção de etanol. O entendimento da estrutura química dos polissacarídeos da parede celular de cana-de-açúcar é imprescindível para que esta tecnologia seja desenvolvida. O presente trabalho teve como objetivo isolar as hemiceluloses de colmo de cana-de-açúcar e estudar as suas estruturas químicas. Para tal, utilizou-se AIR (Alcohol Insoluble Residue) - parede celular sem açúcar solúvel - de colmo e folha de cana-de-açúcar SP80-3280 em hidrólises enzimáticas com endo-β-xilanase, liquenase e celulase isoladamente ou em conjunto de forma a determinar a estrutura fina dos polímeros atacáveis por tais hidrolases. O AIR de colmo também foi submetido ao fracionamento da parede celular com oxalato de amônio, seguido de extrações com 1M e 4M de NaOH para a separação das hemiceluloses. Somente as frações 1M e 4M de NaOH foram analisadas, através de hidrólises com endo-β-xilanases, seguido da análise dos oligossacarídeos resultantes por HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) e por espectrometria de massas MALDI-TOF. Paralelamente, grupos de oligossacarídeos provenientes de hidrólises do colmo com endo-β-xilanase foram isolados por cromatografia em camada delgada (TLC) preparativa e, em seguida, hidrolisados com α-arabinofuranosidases e analisados por PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) para o esclarecimento da estrutura fina de arabinoxilanos. Os resultados obtidos mostraram a presença de xiloglucano na fração NaOH 4M em pequena proporção, cerca de 3% da parede celular, sendo este xiloglucano de 2 tipos: estrutura fina típica de gramíneas (composta por glucose, e os oligossacarídeos isoprimeverose, XG, XXG, XXGG, XXGGG) e estrutura fina de eudicotiledôneas e monocotiledôneas não-comelinóides (composta por oligossacarídeos: XXXG, XLXG/XXLG, XXXXG). A análise por MALDI-TOF da hidrólise das frações 1M e 4M de colmo de cana-de-açúcar com endo-β-xilanase revelou a existência de xilanos lineares (série homóloga de xilanos) em conjunto com um grupo de xilanos ramificados com arabinose de forma regular, com motivos arabinosilados com até 6 xiloses na cadeia principal. As hidrólises com endo-β-xilanase e liquenase em conjunto revelaram que o arabinoxilano e o β-glucano, juntos, perfazem cerca de 40% da parede celular de cana-de-açúcar, e não interferem na hidrólise uma da outra, permitindo o uso concomitante das enzimas em processos industriais. Além disso, especula-se que as arabinoses do arabinoxilano interagem, possivelmente, através de ligações por compostos fenólicos, prevenindo a ação enzimática. O presente trabalho começa a desvendar a estrutura fina das principais hemiceluloses da parede celular de colmo de cana-de-açúcar e aponta para a necessidade de experimentos que permitam compreensão de outros níveis de complexidade da parede celular, como por exemplo, as ramificações com agliconas e interações entre os polissacarídeos. / Brazil is the second-generation ethanol producer in the World, obtaining it from sugarcane soluble sugar from culms. The second generation ethanol consists of using the energy present in the covalent linkages of the cell wall carbohydrates (cellulose, hemicelluloses and pectin) from culms and leaves (both considered nowadays as litter). This is considered as a great opportunity to increase ethanol production up to 3 times the current figures. The knowledge about sugarcane polysaccharide structure is crucial for the development of the second-generation ethanol technology. This work, aimed at the isolation and structural studis of the hemicellulosic components of the sugarcane cell walls. To achieve this, AIR (Alcohol Insoluble Residue) from culms and leaves (SP 80-3280 variety) were digested with endo-β-xylanase, lichenase and cellulase (in different sequences, or with isolated or combined enzymes) to help determining the fine structures of the polysaccharides. The AIR from culm was fractionated with increasing alkali concentrations (NaOH 0,1M, 1M and 4M) to purify the different hemicelluloses. Only the 1M and 4M fractions were analyzed, after digestions with endo-β-xylanase, followed by HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) and MALDI-TOF Mass Spectrometry analyses. Also, the oligosaccharides obtained by the endo-β-xylanase digestion were isolated by preparative TLC (Thin Layer Chromatography), re-digested with α-arabinofuranosidases and finally analyzed by PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) in order to clarify the fine structure of the arabinoxylan from sugarcane culm. The same fractionated material was digested by an endo-β-glucanase to clarify the xyloglucan structure. The results showed that in the 4M fraction, a small concentration of xyloglucan can be found (ca. 3% of the total hemicelluloses), and this polysaccharide has the typical grass structure: XG, XXG, XXGG and XXGGG/XLGG. Other oligosaccharides, typical from eudicotyledons were also found: the XXXG, XLXG/XXLG and XXXXG. The MALDI-TOF and PACE analyses performed after digestion with endo-β-xylanase and α-arabinofuranosidases, revealed the presence of linear xylan oligosaccharides (from 2 to 14) and also fragments with arabinose substitutions. The digestions with endo-β-xylanase and lichenase at the same time, revealed that the arabinoxylan and β-glucans, are 40% of all the sugarcane cell wall mass, and one enzyme does not interfere in the activity of the other. The present work starts to clarify the fine structure of the sugarcane culm (and leaves) major hemicelluloses, and also suggest that experiments aimed at understanding cell wall complexity are important steps to help developing efficient cellulosic ethanol technologies to obtain second generation ethanol from sugarcane biomass.

O Brasil, segundo maior produtor mundial de biocombustíveis, produz etanol a partir da extração e fermentação de sacarose de colmos de cana-de-açúcar. A utilização da energia presente nas ligações químicas entre os carboidratos da parede celular (celulose, hemiceluloses e pectina), das biomassas de folha e bagaço (hoje ambos considerados resíduos de produção), é uma possibilidade para o incremento, de cerca de 3 vezes o valor atual, na produção de etanol. O entendimento da estrutura química dos polissacarídeos da parede celular de cana-de-açúcar é imprescindível para que esta tecnologia seja desenvolvida. O presente trabalho teve como objetivo isolar as hemiceluloses de colmo de cana-de-açúcar e estudar as suas estruturas químicas. Para tal, utilizou-se AIR (Alcohol Insoluble Residue) - parede celular sem açúcar solúvel - de colmo e folha de cana-de-açúcar SP80-3280 em hidrólises enzimáticas com endo-β-xilanase, liquenase e celulase isoladamente ou em conjunto de forma a determinar a estrutura fina dos polímeros atacáveis por tais hidrolases. O AIR de colmo também foi submetido ao fracionamento da parede celular com oxalato de amônio, seguido de extrações com 1M e 4M de NaOH para a separação das hemiceluloses. Somente as frações 1M e 4M de NaOH foram analisadas, através de hidrólises com endo-β-xilanases, seguido da análise dos oligossacarídeos resultantes por HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) e por espectrometria de massas MALDI-TOF. Paralelamente, grupos de oligossacarídeos provenientes de hidrólises do colmo com endo-β-xilanase foram isolados por cromatografia em camada delgada (TLC) preparativa e, em seguida, hidrolisados com α-arabinofuranosidases e analisados por PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) para o esclarecimento da estrutura fina de arabinoxilanos. Os resultados obtidos mostraram a presença de xiloglucano na fração NaOH 4M em pequena proporção, cerca de 3% da parede celular, sendo este xiloglucano de 2 tipos: estrutura fina típica de gramíneas (composta por glucose, e os oligossacarídeos isoprimeverose, XG, XXG, XXGG, XXGGG) e estrutura fina de eudicotiledôneas e monocotiledôneas não-comelinóides (composta por oligossacarídeos: XXXG, XLXG/XXLG, XXXXG). A análise por MALDI-TOF da hidrólise das frações 1M e 4M de colmo de cana-de-açúcar com endo-β-xilanase revelou a existência de xilanos lineares (série homóloga de xilanos) em conjunto com um grupo de xilanos ramificados com arabinose de forma regular, com motivos arabinosilados com até 6 xiloses na cadeia principal. As hidrólises com endo-β-xilanase e liquenase em conjunto revelaram que o arabinoxilano e o β-glucano, juntos, perfazem cerca de 40% da parede celular de cana-de-açúcar, e não interferem na hidrólise uma da outra, permitindo o uso concomitante das enzimas em processos industriais. Além disso, especula-se que as arabinoses do arabinoxilano interagem, possivelmente, através de ligações por compostos fenólicos, prevenindo a ação enzimática. O presente trabalho começa a desvendar a estrutura fina das principais hemiceluloses da parede celular de colmo de cana-de-açúcar e aponta para a necessidade de experimentos que permitam compreensão de outros níveis de complexidade da parede celular, como por exemplo, as ramificações com agliconas e interações entre os polissacarídeos. / Brazil is the second-generation ethanol producer in the World, obtaining it from sugarcane soluble sugar from culms. The second generation ethanol consists of using the energy present in the covalent linkages of the cell wall carbohydrates (cellulose, hemicelluloses and pectin) from culms and leaves (both considered nowadays as litter). This is considered as a great opportunity to increase ethanol production up to 3 times the current figures. The knowledge about sugarcane polysaccharide structure is crucial for the development of the second-generation ethanol technology. This work, aimed at the isolation and structural studis of the hemicellulosic components of the sugarcane cell walls. To achieve this, AIR (Alcohol Insoluble Residue) from culms and leaves (SP 80-3280 variety) were digested with endo-β-xylanase, lichenase and cellulase (in different sequences, or with isolated or combined enzymes) to help determining the fine structures of the polysaccharides. The AIR from culm was fractionated with increasing alkali concentrations (NaOH 0,1M, 1M and 4M) to purify the different hemicelluloses. Only the 1M and 4M fractions were analyzed, after digestions with endo-β-xylanase, followed by HPAEC-PAD (High Performance Anionic Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection) and MALDI-TOF Mass Spectrometry analyses. Also, the oligosaccharides obtained by the endo-β-xylanase digestion were isolated by preparative TLC (Thin Layer Chromatography), re-digested with α-arabinofuranosidases and finally analyzed by PACE (Polyacrylamide Carbohydrate Electrophoresis) in order to clarify the fine structure of the arabinoxylan from sugarcane culm. The same fractionated material was digested by an endo-β-glucanase to clarify the xyloglucan structure. The results showed that in the 4M fraction, a small concentration of xyloglucan can be found (ca. 3% of the total hemicelluloses), and this polysaccharide has the typical grass structure: XG, XXG, XXGG and XXGGG/XLGG. Other oligosaccharides, typical from eudicotyledons were also found: the XXXG, XLXG/XXLG and XXXXG. The MALDI-TOF and PACE analyses performed after digestion with endo-β-xylanase and α-arabinofuranosidases, revealed the presence of linear xylan oligosaccharides (from 2 to 14) and also fragments with arabinose substitutions. The digestions with endo-β-xylanase and lichenase at the same time, revealed that the arabinoxylan and β-glucans, are 40% of all the sugarcane cell wall mass, and one enzyme does not interfere in the activity of the other. The present work starts to clarify the fine structure of the sugarcane culm (and leaves) major hemicelluloses, and also suggest that experiments aimed at understanding cell wall complexity are important steps to help developing efficient cellulosic ethanol technologies to obtain second generation ethanol from sugarcane biomass.