Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6317.pdf: 1890056 bytes, checksum: dc49c9c95213e912864488dff97a859c (MD5) Previous issue date: 2013-12-13 / Financiadora de Estudos e Projetos / Xylanase and feruloyl esterase (FAE) are two enzymes of great importance for plant biomass decomposition. The hemicellulose, one of the biomass constituents, has a great structural variety, so that for its complete deconstruction, several groups of enzymes are required, including mainly xylanases. These enzymes act on the β-1,4 glycosidic bonds between the xylose residues. Xylanase activity can be enhanced in the presence of esterases, such as feruloyl esterase (FAE), since the latter catalyzes the hydrolysis of linkages which make cell wall structure to be more intricated. Such connections are formed mainly by the ferulic acid esterified to sugar residues attached to the carbohydrate main chain. It is noteworthy that the ferulic acid cross-links to hemicellulose, pectin and lignin structures. Both enzymes are of interest in many sectors, for example, during the saccharification for bioethanol production and bleaching stages of pulp and paper industry. Therefore, this study aimed to select and cultivate filamentous fungi from the Amazon rainforest capable of synthesizing FAE and xylanase, and to evaluate the application of these enzymes in the hydrolysis of sugar cane bagasse. Initially, a screening was conducted on agar plates containing ethyl ferulate. Among eleven fungi tested, seven showed a clear halo around the colony, as indicative of FAE production. Then, the fungi were cultivated in liquid nutrient medium supplemented with 1% wheat bran, and, based on productivity values, three strains of Aspergillus oryzae (P21C3, P6B2 and P27C3) were chosen for cultivation in a stirred tank bioreactor. After 24 hours of cultivation of the P21C3 strain in the bioreactor, it was obtained a crude enzyme extract with 74.85 UI.mL-1 and 47.02 UI.L-1 of xylanase and FAE activity, respectively. This extract was used for the hydrolysis of hydrothermal pretreated sugarcane bagasse with supplementation of a commercial cellulolytic enzyme preparation. These hydrolysis reactions resulted in conversions of 51.2% (cellulose to glucose) and 78.1% (hemicellulose to xylose). Furthermore, the addition of the on-site produced enzyme extract increased the glucose release by 35.8% and the xylose release by 53.8%. / A xilanase e a feruloil esterase (FAE) são duas enzimas de grande relevância na decomposição da biomassa vegetal. Um dos constituintes da biomassa, a hemicelulose, possui uma grande variedade estrutural, de modo que, para sua completa desconstrução, são necessários diversos grupos de enzimas, entre as quais se pode destacar a xilanase. Esta age sobre as ligações glicosídicas β-1,4 entre resíduos de xilose. Sua atividade pode ser incrementada na presença de esterases, tal como a feruloil esterase (FAE), haja vista que esta catalisa a hidrólise de ligações que ajudam a tornar a estrutura mais intricada. Tais ligações são formadas, principalmente, por ácido ferúlico esterificado a resíduos de açúcares anexados à cadeia principal do carboidrato. Vale ressaltar que o ácido ferúlico promove conexões entre os componentes da hemicelulose, pectina e lignina. Ambas as enzimas despertam interesse em diversos setores, como nos processos de sacarificação e de branqueamento, nas indústrias de bioetanol e de papel e celulose, respectivamente. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivos selecionar e cultivar fungos filamentosos produtores de xilanase e feruloil esterase e avaliar a aplicação dessas enzimas na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar. Inicialmente, foi realizada uma seleção em placas com ferulato de etila, entre onze fungos filamentosos isolados da região amazônica, sendo que sete formaram halo claro ao redor da colônia, como indicativo de produção de FAE. Em seguida, os fungos foram cultivados em meio líquido suplementado com 1% de farelo de trigo, e, com base nos valores de produtividade, foram escolhidas três linhagens de Aspergillus oryzae (P21C3, P27C3 e P6B2), para o cultivo em biorreator de tanque agitado. Após 24 horas de cultivo do isolado P21C3 em reator, obteve-se um extrato enzimático com 74,85 UI.mL-1 de xilanase e 47,02 UI.L-1 de FAE, o qual foi empregado para hidrólise de bagaço de cana com pré-tratamento hidrotérmico, junto ao preparado enzimático comercial de celulases. Nestas condições, obteve-se uma conversão de 51,2% (celulose em glicose) e de 78,1% (hemicelulose em xilose), sendo que, a adição do extrato enzimático obtido nesse trabalho proporcionou um ganho de 35,8% na liberação de glicose e de 53,8% na liberação de xilose.

A parede celular das plantas inclui componentes polissacarídeos complexos, e a sacarificação destes polímeros necessita da ação de conjuntos de enzimas que atuem em sinergia. Enzimas podem formar complexos multi-enzimáticos que possuem mais de uma atividade catalítica derivada de domínios distintos de uma mesma cadeia polipeptídica. O objetivo deste trabalho foi construir uma enzima bifuncional com os domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) para desconstrução de material lignocelulósico de cana-de-açúcar. Para isso, dois diferentes domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) oriundos de Clostridium thermocellum foram fundidas para criar a quimera feruloil esterase/acetil-xilano esterase (FaeAxe). O desenho racional da quimera foi feito utilizando-se de métodos computacionais, que permitiram a criação de um modelo estrutural da enzima. A construção da quimera foi feita por overlap PCR, clonada em vetor pET-SUMO e expressa em Escherichia coli. As duas enzimas parentais (Fae e Axe) foram clonadas em vetor pET28 e expressas em E. coli. Durante a etapa de expressão, observou-se que todas as enzimas foram expressas na forma solúvel. As enzimas feruloil esterase e acetilxilano esterase têm como substrato o polímero arabinoxilano, cuja degradação é uma etapa chave na sacarificação de biomassa. Dessa forma, as atividades da quimera, bem como das enzimas parentais foram testadas contra polímeros arabinoxilano de trigo e arabinoxilano de cana-de-açúcar após a hidrólise pela endoxilanase GH11 de Bacillus Subtilis e analisadas por meio de espectrometria de massas. A atividade desacetilase da enzima parental acetil-xilano esterase e da quimera FaeAxe foram confirmadas, evidenciando que a quimera preservou essa atividade catalítica. A atividade da enzima feruloil esterase e da quimera FaeAxe na remoção de ácido ferúlico dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase GH11 não foi observada / The plant cell wall is comprised of a matrix of polysaccharides and saccharification of these polymers requires the joint action of diverse enzymes. Enzymes may form multi-enzymatic complexes that have more than one catalytic activity derived from different domains of a single polypeptide chain. The aim of this work was to construct a bifunctional enzyme with two catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) for degradation of sugar cane lignocellulosic material. The two different catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) from Clostridium thermocellum were fused to generate a bifunctional chimera feruloyl esterase/acetylxylan esterase (FaeAxe). A molecular model was created by rational design using a 3D-structure guided strategy. The fusion was created using overlap PCR, and the resulting product was cloned into the pETSUMO vector. The chimeric protein and the parental enzymes were expressed in Escherichia coli and purified and the enzymes were expressed in soluble form. Xylanases, feruloyl esterases and acetylxylan esterases degrade arabinoxylan polymers and their activity is a key step in the saccharification of biomass. The catalytic properties of the chimera and of the parental enzymes were tested against wheat and sugarcane arabinoxylan polymers after hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis and analyzed by mass spectroscopy. The deacetylase activity of acetyl-xylan esterase parental enzyme and FaeAxe chimera were confirmed, showing that the chimera kept the deacetylase activity. After hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis the feruloyl esterase and FaeAxe chimera activities on ferulic acid removal were not observed

As feruloil esterases são enzimas relevantes para o processo de hidrólise de materiais lignocelulósicos oriundos de gramíneas. Estas enzimas são tradicionalmente determinadas com o emprego de substratos sintéticos de baixa massa molar. Entretanto, as atividades determinadas a partir desses ensaios não se correlacionam adequadamente com a ação das enzimas em substratos complexos e insolúveis como os materiais lignocelulósicos. Neste sentido, o presente trabalho visou desenvolver um método apropriado para medir a atividade de feruloil esterases utilizando um material lignocelulósico como substrato. Para isso, as medulas de híbridos de cana-de-açúcar com baixo teor de lignina e de um cultivar de referência com elevado teor de lignina foram usadas para preparar substratos de baixa recalcitrância usados na determinação da atividade de feruloil esterases de 3 origens diferentes. As medulas foram extraídas com água para remoção de sacarose e posteriormente analisadas quanto à composição química. As medulas foram ainda submetidas a uma etapa de pré-hidrólise com celulase comercial por 4 horas para preparar um substrato menos recalcitrante e adequado para a ação das enzimas. Após a avaliação do efeito da carga de feruloil esterases na cinética de hidrólise dos ésteres de ácido ferúlico, foi definido que os ensaios enzimáticos deveriam ser realizados com um tempo fixo de 5 minutos a fim de determinar a atividade numa faixa de conversão dos ésteres que fosse da ordem de 2%, assegurando a determinação na região de velocidade máxima de reação. Idealmente, o método foi desenhado para empregar diluições da enzima que gerassem dados de conversão levemente menores e maiores do que 2% de conversão, o que permitiu a determinação exata da carga de enzima necessária para converter 2% de éster do ácido ferúlico em ácido após 5 min de reação por interpolação de dados. As condições de reação foram fixadas em 40°C e pH 6,3. Os níveis de atividade e as reprodutibilidades experimentais determinadas para as 3 enzimas se mostraram dependentes do substrato, principalmente associadas ao teor inicial de lignina observado nas medulas in natura. Tomando as determinações de atividade da feruloil esterase de rúmen como exemplo, os dados obtidos, expressos em UI/?g de proteína, foram: 2,3 ± 0,2, 2,0 ± 0,8 e 0,6 ± 0,5, respectivamente para os substratos oriundos das medulas que continham originalmente 13,0 ± 0,3, 12,8 ± 0,5 e 19,1 ± 0,1% de lignina. Empregando os substratos oriundos de medulas com baixo teor de lignina original, o método se mostrou adequado para estudar os efeitos de variáveis como temperatura e pH do meio reacional sobre a atividade enzimática. No caso da feruloil esterase de rúmen, os estudos mostraram uma temperatura ótima de reação de 40°C e atividades crescentes em função do pH, com máximo na região de 6,3 a 7,2. Pode-se concluir que o trabalho permitiu a elaboração de uma metodologia adequada para a determinação de feruloil esterases empregando um substrato lignocelulósico, desde que este substrato seja preparado a partir de medulas de cana com baixa recalcitrância decorrente do baixo teor original de lignina. / Feruloyl esterases are important enzymes acting on the hydrolysis of lignocellulosic materials from grasses. These enzymes are traditionally determined using synthetic low molar mass substrates. However, the activities determined through these assays do not correlate with the action of the enzymes on complex and insoluble substrates such as lignocellulosic materials. According to this, the present work aimed to develop an appropriate method to measure feruloyl esterase activities using a lignocellulosic material as substrate. Pith regions, recovered from low lignin content sugarcane hybrids and from a high lignin content reference cultivar, were used to prepare low recalcitrance lignocellulosic substrates, used to determine the activity of 3 different feruloyl esterases. The pith samples were extracted with water to remove sucrose and then analyzed concerning its chemical composition. They were further subjected to a prehydrolysis step with commercial cellulase for 4 hours to prepare a less recalcitrant and proper substrates for the action of the feruloyl esterases. After evaluating the effect of enzyme loading on the hydrolysis kinetics of the ferulic acid esters, it was defined that the enzymatic assays should be done at a fixed time of 5 minutes, in order to determine the enzymatic activity in the region of maximal hydrolysis rate. Ideally, the method was designed to use enzyme dilutions that provide ferulic acid ester conversions in the range of 2 %, which allowed the exact determination of the enzyme load necessary to convert 2% of ferulic acid ester in acid after 5 minutes of reaction by interpolating data. The reaction conditions were fixed at 40°C and pH 6.3. The activity levels and the experimental reproducibility determined for the 3 enzymes showed to be dependent of the substrate, specially associated with the initial lignin content of each material. Taking the rumen feruloyl esterase activities as example, the data obtained in UI/?g of protein were 2.3 ± 0.2, 2.0 ± 0.8 e 0.6 ± 0.5, respectively for the substrates from sugarcane piths containing 13.0 ± 0.3, 12.8 ± 0.5 and 19.1 ± 0.1% of lignin. Employing the substrates with low lignin contents, the method showed to be appropriate to study the effects of variables such as the reaction temperature and pH on the enzymatic activity. For rumen feruloyl esterase, the studies showed optimum temperature at 40°C and increasing activities for increasingly pHs, with the maximum in the range 6.3-7.2. In conclusion, the work provided a proper methodology to determine feruloyl esterase activity using a lignocellulosic substrate, but the substrate needs to be prepared from a non-recalcitrance sugarcane pith that was observed in samples with low initial lignin content.

As feruloil esterases são enzimas relevantes para o processo de hidrólise de materiais lignocelulósicos oriundos de gramíneas. Estas enzimas são tradicionalmente determinadas com o emprego de substratos sintéticos de baixa massa molar. Entretanto, as atividades determinadas a partir desses ensaios não se correlacionam adequadamente com a ação das enzimas em substratos complexos e insolúveis como os materiais lignocelulósicos. Neste sentido, o presente trabalho visou desenvolver um método apropriado para medir a atividade de feruloil esterases utilizando um material lignocelulósico como substrato. Para isso, as medulas de híbridos de cana-de-açúcar com baixo teor de lignina e de um cultivar de referência com elevado teor de lignina foram usadas para preparar substratos de baixa recalcitrância usados na determinação da atividade de feruloil esterases de 3 origens diferentes. As medulas foram extraídas com água para remoção de sacarose e posteriormente analisadas quanto à composição química. As medulas foram ainda submetidas a uma etapa de pré-hidrólise com celulase comercial por 4 horas para preparar um substrato menos recalcitrante e adequado para a ação das enzimas. Após a avaliação do efeito da carga de feruloil esterases na cinética de hidrólise dos ésteres de ácido ferúlico, foi definido que os ensaios enzimáticos deveriam ser realizados com um tempo fixo de 5 minutos a fim de determinar a atividade numa faixa de conversão dos ésteres que fosse da ordem de 2%, assegurando a determinação na região de velocidade máxima de reação. Idealmente, o método foi desenhado para empregar diluições da enzima que gerassem dados de conversão levemente menores e maiores do que 2% de conversão, o que permitiu a determinação exata da carga de enzima necessária para converter 2% de éster do ácido ferúlico em ácido após 5 min de reação por interpolação de dados. As condições de reação foram fixadas em 40°C e pH 6,3. Os níveis de atividade e as reprodutibilidades experimentais determinadas para as 3 enzimas se mostraram dependentes do substrato, principalmente associadas ao teor inicial de lignina observado nas medulas in natura. Tomando as determinações de atividade da feruloil esterase de rúmen como exemplo, os dados obtidos, expressos em UI/?g de proteína, foram: 2,3 ± 0,2, 2,0 ± 0,8 e 0,6 ± 0,5, respectivamente para os substratos oriundos das medulas que continham originalmente 13,0 ± 0,3, 12,8 ± 0,5 e 19,1 ± 0,1% de lignina. Empregando os substratos oriundos de medulas com baixo teor de lignina original, o método se mostrou adequado para estudar os efeitos de variáveis como temperatura e pH do meio reacional sobre a atividade enzimática. No caso da feruloil esterase de rúmen, os estudos mostraram uma temperatura ótima de reação de 40°C e atividades crescentes em função do pH, com máximo na região de 6,3 a 7,2. Pode-se concluir que o trabalho permitiu a elaboração de uma metodologia adequada para a determinação de feruloil esterases empregando um substrato lignocelulósico, desde que este substrato seja preparado a partir de medulas de cana com baixa recalcitrância decorrente do baixo teor original de lignina. / Feruloyl esterases are important enzymes acting on the hydrolysis of lignocellulosic materials from grasses. These enzymes are traditionally determined using synthetic low molar mass substrates. However, the activities determined through these assays do not correlate with the action of the enzymes on complex and insoluble substrates such as lignocellulosic materials. According to this, the present work aimed to develop an appropriate method to measure feruloyl esterase activities using a lignocellulosic material as substrate. Pith regions, recovered from low lignin content sugarcane hybrids and from a high lignin content reference cultivar, were used to prepare low recalcitrance lignocellulosic substrates, used to determine the activity of 3 different feruloyl esterases. The pith samples were extracted with water to remove sucrose and then analyzed concerning its chemical composition. They were further subjected to a prehydrolysis step with commercial cellulase for 4 hours to prepare a less recalcitrant and proper substrates for the action of the feruloyl esterases. After evaluating the effect of enzyme loading on the hydrolysis kinetics of the ferulic acid esters, it was defined that the enzymatic assays should be done at a fixed time of 5 minutes, in order to determine the enzymatic activity in the region of maximal hydrolysis rate. Ideally, the method was designed to use enzyme dilutions that provide ferulic acid ester conversions in the range of 2 %, which allowed the exact determination of the enzyme load necessary to convert 2% of ferulic acid ester in acid after 5 minutes of reaction by interpolating data. The reaction conditions were fixed at 40°C and pH 6.3. The activity levels and the experimental reproducibility determined for the 3 enzymes showed to be dependent of the substrate, specially associated with the initial lignin content of each material. Taking the rumen feruloyl esterase activities as example, the data obtained in UI/?g of protein were 2.3 ± 0.2, 2.0 ± 0.8 e 0.6 ± 0.5, respectively for the substrates from sugarcane piths containing 13.0 ± 0.3, 12.8 ± 0.5 and 19.1 ± 0.1% of lignin. Employing the substrates with low lignin contents, the method showed to be appropriate to study the effects of variables such as the reaction temperature and pH on the enzymatic activity. For rumen feruloyl esterase, the studies showed optimum temperature at 40°C and increasing activities for increasingly pHs, with the maximum in the range 6.3-7.2. In conclusion, the work provided a proper methodology to determine feruloyl esterase activity using a lignocellulosic substrate, but the substrate needs to be prepared from a non-recalcitrance sugarcane pith that was observed in samples with low initial lignin content.

A parede celular das plantas inclui componentes polissacarídeos complexos, e a sacarificação destes polímeros necessita da ação de conjuntos de enzimas que atuem em sinergia. Enzimas podem formar complexos multi-enzimáticos que possuem mais de uma atividade catalítica derivada de domínios distintos de uma mesma cadeia polipeptídica. O objetivo deste trabalho foi construir uma enzima bifuncional com os domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) para desconstrução de material lignocelulósico de cana-de-açúcar. Para isso, dois diferentes domínios catalíticos: acetilxilano esterase (Axe) e feruloil esterase (Fae) oriundos de Clostridium thermocellum foram fundidas para criar a quimera feruloil esterase/acetil-xilano esterase (FaeAxe). O desenho racional da quimera foi feito utilizando-se de métodos computacionais, que permitiram a criação de um modelo estrutural da enzima. A construção da quimera foi feita por overlap PCR, clonada em vetor pET-SUMO e expressa em Escherichia coli. As duas enzimas parentais (Fae e Axe) foram clonadas em vetor pET28 e expressas em E. coli. Durante a etapa de expressão, observou-se que todas as enzimas foram expressas na forma solúvel. As enzimas feruloil esterase e acetilxilano esterase têm como substrato o polímero arabinoxilano, cuja degradação é uma etapa chave na sacarificação de biomassa. Dessa forma, as atividades da quimera, bem como das enzimas parentais foram testadas contra polímeros arabinoxilano de trigo e arabinoxilano de cana-de-açúcar após a hidrólise pela endoxilanase GH11 de Bacillus Subtilis e analisadas por meio de espectrometria de massas. A atividade desacetilase da enzima parental acetil-xilano esterase e da quimera FaeAxe foram confirmadas, evidenciando que a quimera preservou essa atividade catalítica. A atividade da enzima feruloil esterase e da quimera FaeAxe na remoção de ácido ferúlico dos oligossacarídeos gerados pela endoxilanase GH11 não foi observada / The plant cell wall is comprised of a matrix of polysaccharides and saccharification of these polymers requires the joint action of diverse enzymes. Enzymes may form multi-enzymatic complexes that have more than one catalytic activity derived from different domains of a single polypeptide chain. The aim of this work was to construct a bifunctional enzyme with two catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) for degradation of sugar cane lignocellulosic material. The two different catalytic domains: acetylxylan esterase (Axe) and feruloyl esterase (Fae) from Clostridium thermocellum were fused to generate a bifunctional chimera feruloyl esterase/acetylxylan esterase (FaeAxe). A molecular model was created by rational design using a 3D-structure guided strategy. The fusion was created using overlap PCR, and the resulting product was cloned into the pETSUMO vector. The chimeric protein and the parental enzymes were expressed in Escherichia coli and purified and the enzymes were expressed in soluble form. Xylanases, feruloyl esterases and acetylxylan esterases degrade arabinoxylan polymers and their activity is a key step in the saccharification of biomass. The catalytic properties of the chimera and of the parental enzymes were tested against wheat and sugarcane arabinoxylan polymers after hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis and analyzed by mass spectroscopy. The deacetylase activity of acetyl-xylan esterase parental enzyme and FaeAxe chimera were confirmed, showing that the chimera kept the deacetylase activity. After hydrolysis by GH11 endoxylanase from Bacillus subtilis the feruloyl esterase and FaeAxe chimera activities on ferulic acid removal were not observed