A major problem regarding public health is the emergence of antibiotic resistant bacterial strains, especially methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). This is mainly attributed to the unnecessary overuse of antimicrobial drugs by patients; however, one aspect that is often neglected is their untargeted mechanism of action, affecting not only the infection itself but also commensal bacteria which are often opportunistic pathogens causing many diseases as well. Therefore, our goal was to develop a bioresponsive antibiotic delivery system triggered by virulence factors. The designed system is comprised of a polymer to enhance its pharmacokinetic profile, a peptide cleavable linker, and the antibiotic agent itself. The bacterial protease aureolysin which is expressed by S. aureus during infections would cleave the linker and partially release the antibiotic which would be still attached to a remaining tetrapeptide. These would be cleaved by a group of proteases naturally present in plasma called aminopeptidases, finally releasing the compound. In the first part of this project, we searched for a suitable sequence to serve as a cleavable linker. It should be sensitive towards the target bacterial protease but not be cleaved by any human enzymes to guarantee the specificity of the system. Therefore, we synthesized three peptide sequences via Solid Phase Peptide Synthesis and incubated them with aureolysin as well as with many human matrix Metalloproteases. The analysis and quantification of enzymatic activity was monitored chromatographically (RP-HPLC). The plasminogen originated sequence was chosen since it was not sensitive towards MMPs, but cleaved by aureolysin. In the second part, we tried to incorporate the chosen peptide sequences as crosslinkers in hydrogel formulations. The purpose was to physically incorporate the antibiotic within the hydrogel, which would be released by the cleavage of those sequences and the consequent loosening the hydrogel net. For that purpose we used a commercially available hydrogel kit with a PVA matrix modified with maleimide, which allows a conjugation reaction with thiol functionalized crosslinkers. Three fluorophores were chosen to serve as antibiotic models and a diffusion assay was performed. Only the glomerular structured Green Fluorescent Protein (GFP) presented a low diffusion rate, thus the aureolysin release assays were performed only using this prototype. Assays showed that with a low hydrogel polymer concentration, the fluorophore either quickly diffused into the medium or was not released at all. The physical incorporation of the antibiotic within the hydrogel pores was therefore abolished as a suitable release approach. For a second attempt, we covalently bound a fluorophore to the linker, which was conjugated to the hydrogel matrix. The incubation with aureolysin and subsequent RP-HPLC analysis showed a peak with the same retention time correspondent to the fragment product after cleavage of the free linker. This is a proof that the concept of linking the peptide sequence to the antibiotic is a promising strategy for its bioresponsive release. Within the third part of this study, we analyzed the degradation of the resulted fragment after aureolysin activity and subsequent full release of the antibiotic by human aminopeptidases. We determined the concentration of those enzymes in human plasma and synthesized the fragment by conjugating the tetrapeptide sequence to aminofluorescein via EDC/NHS reaction. By incubating the construct with the lowest aminopeptidase concentration measured in plasma, the fluorophore was completely released within two hours, showing the efficacy of these enzymes as bioresponsive agents. The last part was the construction of the PEGylated linker-antibiotic. For this purpose we chose the tetracycline like antibiotic chelocardin (CHD) as our prototype. The conjugation of the linker- CHD to the polymer was performed by copper free click chemistry. The cleavage rate of the linker by aureolysin was very similar to the one obtained for the free peptide, indicating that the PEGylation does not interfere on the enzymatic activity. However, by trying to increase the loading ratio of chelocardin onto the polymer, we observed a very low cleavage rate for the system, indicating the formation of aggregates by those constructs. The designed system has proved to be a smart strategy for the delivery on demand of antibiotics in which the drug is only released by the presence of S. aureus during their virulent state. / Ein weltweites Problem des Gesundheitswesens ist die Entstehung von antibiotikaresistenten Bakterienstämmen, besonders Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA). Eine wichtige Ursache für Resistenzentwicklungen ist die unüberlegte Verschreibung von Antibiotika; allerdings das breite Wirkspektrum der meisten Substanzen ist ein stets vernachlässigter Aspekt. Dies betrifft nicht nur die Pathogene selbst, sondern auch die bakterielle Mikroflora des Patienten, die opportunistische Pathogene darstellen und in machen Fallen ebenfalls verschiedene Erkrankungen hervorrufen können. Unser Ziel ist die Entwicklung eines bioresponsiven Freisetzungssystems für Antibiotika. Das System besteht aus einem Polymer zur Optimierung der Pharmakokinetik, einem Peptidlinker sowie dem eigentlichen Antibiotikum. Die bakterielle Protease Aureolysin wird von S. aureus exprimiert, sobald sich das Bakterium in seinem virulenten Zustand befindet. Das Enzym schneidet den Linker, wodurch das Antibiotikum zum Teil freigesetzt wird. Da es noch an Aminosäureartefakte gebunden ist, muss es im Anschluss durch eine Aminopeptidase, einer Gruppe von Exoproteasen des humanen Plasmas, abgespalten werden. Die erste Phase des Projektes war die Suche nach einer passenden Peptidsequenz, die als Linker geeignet ist. Diese soll nur durch die Zielprotease und nicht durch andere humane Proteasen geschnitten werden, um die Spezifizität des Systems zu gewährleisten. Es wurden drei Sequenzen ausgewählt und mittels Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Diese wurden mit Aureolysin sowie humanen Matrix-Metalloproteasen (MMP) inkubiert; die Produkte wurden chromatographisch (RP-HPLC) charakterisiert und die enzymatische Aktivität bestimmt. Die von Plasminogen abgeleitete Sequenz wurde von keiner der Matrix-Metalloproteasen geschnitten, wohl aber von Aureolysin. Eine ausführliche Analyse des Aureolysin-Verdaus zeigte, dass der Linker innerhalb weniger Stunden komplett geschnitten wird. In der zweiten Phase wurde die Peptidsequenz als Crosslinker in verschiedene Hydrogelmatrices inkorporiert. Die Strategie war der physikalische Einschluss des Antibiotikums in das Hydrogel und die anschließende Freisetzung durch Spaltung dieser Sequenzen und Lockerung des Hydrogelnetzes auf molekularer Ebene. Hierfür wurde ein kommerzielles Hydrogelkit mit Maleinsäureamid-modifizierter PVA Matrix verwendet, die mit Thiol-funktionalisierten Linkern konjugiert werden können. Drei verschiedene Fluorophore wurden als Modelle für die Diffusionsversuche verwendet. Nur das glomeruläre green fluorescent protein (GFP) besaß eine ausreichend niedrige Diffusionskonstante und wurde deshalb als Prototyp für die weiteren Schneidversuche verwendet. Die Ergebnisse zeigen, dass der Fluorophor bei niedrigen Matrixkonzentrationen schnell aus den Poren in das umgebende Medium diffundiert, während er bei höheren Konzentrationen nicht freigesetzt wird. Die physikalische Inkorporierung des Antibiotikums wurde aus diesen Gründen verworfen und nicht durchgeführt. Als zweiter Versuch wurde der Fluorophor kovalent an den Linker gekoppelt, welcher im Anschluß an die Matrix konjugiert wurde. Die Inkubation mit Aureolysin und die nachfolgende RP-HPLC-Analyse zeigte einen Peak bei der Retentionszeit entsprechend dem Fragmentprodukt, das durch Inkubation des freien Linkers entsteht. Die kovalente Bindung zwischen der antimikrobiellen Substanz und dem Linker ist eine vielversprechende Strategie für eine bio-responsive Freisetzung. In der dritten Phase des Projektes wurde die Zersetzung des resultierenden Fragments nach Aureolysin-Verdau und die anschließende vollständige Freisetzung des Antibiotikums durch humane Aminopeptidasen untersucht. Die Konzentration an Aminopeptidasen im humanen Plasma wurde bestimmt und die durch Aureolysin entstehende Peptidsequenz an Aminofluorescein mittels EDC/NHS-Reaktion gekoppelt. Die Inkubation des Konstruktes mit der niedrigsten Aminopeptidase-Konzentration, die im Plasma bestimmt werden konnte zeigte, dass der Fluorophor in zwei Stunden vollständig freigesetzt wurde. Die letzte Phase hat sich mit der PEGylierung des Linker-Antibiotikum-Komplexes beschäftigt. Das Tetracyclin-analoge Antibiotikum Chelocardin wurde als Prototyp ausgewählt und am Helmholtz-Institut für Pharmazeutische Forschung des Saarlandes synthetisiert. Die Konjugation des Linker-CHD-Konstruktes an das Polymer wurde mittels kupferfreier Click-Chemie durchgeführt. Der PEGylierte Linker wurde in einer ähnlichen Rate durch Aureolysin geschnitten wie der freie Linker, was beweist, dass das Polymer keinen Einfluss auf die enzymatische Aktivität hat. Allerdings wurde während der Optimierung der Beladung von CHD je Polymermolekül eine sehr niedrige Freisetzung des Antibiotikums beobachtet, was durch Aggregatbildung der Konstrukte erklärt werden kann. Das entwickelte System ist eine interessante Delivery-Strategie für Antibiotika, welche hierdurch nur durch virulente S. aureus-Erreger freigesetzt werden.

Zugl.: Augsburg, Universiẗat, Diss., 2007.

University, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in engl. und dt. Sprache.

Techn. Universiẗat, Diss., 2004--Darmstadt.