Zugl.: Zürich, Univ., Diss., 2007

Osteoporose ist einer der häufigsten Knochenerkrankungen im fortschreitenden Alter und zählt, aufgrund der damit verbundenen hohen direkten und indirekten Behandlungskosten, zu einer der zehn wichtigsten volkswirtschaftlichen Krankheiten. Die Behandlung der Osteoporose ist langjährig und umfasst eine medikamentöse Therapie auf der Basis einer „knochengesunden“ Lebensweise hinsichtlich Ernährung und Bewegung. Im Rahmen von Untersuchungen zur Linderung von postmenopausalen Beschwerden, zeigte ein Extrakt der Pflanze Cimicifuga racemosa Potential zu osteoprotektiver Wirksamkeit und rückte somit in den Fokus für eine mögliche Anwendung in der Therapie und Prophylaxe von Osteoporose. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, in enger Zusammenarbeit mit der Bionorica SE, welche für die Aufreinigung und Fraktionierung des Pflanzenextraktes zuständig war, und mit der Arbeitsgruppe um Prof. Wuttke, welche parallele Rattenstudien durchführte, Methoden anzuwenden, mit denen osteoprotektive Wirksamkeiten nachgewiesen und auf einzelne Fraktionen des Extraktes limitiert werden können. ... / Osteoporosis is one of the most common bone diseases in advancing age and is, due to the associated high direct and indirect costs of treatment, one of the ten most important economic diseases. The treatment of osteoporosis lasts for many years and covers a drug therapy based on a "bone-healthy" lifestyle regarding diet and exercise. As part of investigations for the relief of postmenopausal symptoms Cimicifuga racemosa showed potential to osteoprotective effectiveness and thus the focus places special emphasis to the potential application in the treatment and prevention of osteoporosis. The aim of the present study was therefore, in close cooperation with the Bionorica SE, which was responsible for the purification and fractionation of the plant extract and the research group of Professor Wuttke, which conduct parallel rat studies, to investigate methods which demonstrate osteoprotective efficacies and may be limited to individual fractions of the extract. ...

Proteine sind dynamische makromolekulare Systeme, die nativ in verschiedenen Konfor-mationen vorliegen. Besonders Proteine mit einer ausgeprägten intrinsischen Flexibilität stellen als biologische Zielstrukturen für das computergestützte strukturbasierte Wirkstoff-design auch heute noch eine große Herausforderung dar. Die vorliegende Arbeit thematisiert die computergestützte Identifizierung neuer Liganden mit inhibitorischer Aktivität für zwei strukturell sehr flexible Enzyme, die bei verschiedenen Krankheiten eine pathophysio-logische Rolle spielen. Ein Schwerpunkt lag in diesem Zusammenhang auf der Entwicklung virtueller Screeningverfahren, die es ermöglichten, die Flexibilität der Proteine adäquat zu berücksichtigen. Der erste Teil der Arbeit beschreibt ein virtuelles Screeningverfahren für die Identifizierung von Liganden einer neuen, durch Molekulardynamik (MD) Simulationen generierten Proteinkonformation der Aldose Reduktase (AR), einem Enzym, das im Zusammenhang mit der Entstehung von Folgeerkrankungen bei Diabetes mellitus steht. Die angewandte Vorgehensweise zeigt Möglichkeiten auf, wie eine ausgeprägte Proteinflexibilität mit Hilfe computerbasierter Methoden im Rahmen eines virtuellen Screenings explizit berücksichtigt werden kann. Die Studie war auf der einen Seite hinsichtlich methodischer Aspekte von Interesse, da dadurch sowohl eine Beurteilung der Aussagekraft computergenerierter Proteinkonformationen, als auch eine Überprüfung der prinzipiellen Eignung MD-generierter Enzymkonformationen als Template für strukturbasierten Ligandendesignstudien, erfolgen konnte. Auf der anderen Seite war diese Studie aufgrund einer möglichen Erweiterung des bekannten Konformationsraumes der AR auch aus strukturbiologischer Sicht von Interesse. Bei der Suche nach geeigneten Liganden in Moleküldatenbanken kommerziell erhältlicher Verbindungen wurde eine protein- und eine ligandbasierte Strategie verfolgt. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine vergleichende Strukturanalyse verschiedener AR-Ligand-Komplexstrukturen, um Informationen hinsichtlich experimentell aufgeklärter Bindemotive, Protein-Ligand-Interaktionen sowie bestehender struktureller Differenzen zwischen der MD-Konformation und anderen Bindetaschenkonformationen der AR zu sammeln. Anschließend wurde die Bindetasche der MD-generierten Proteinstruktur hinsichtlich günstiger Interaktionspunkte analysiert, um aus den Erkenntnissen Pharmako-phormodelle als Filter für die nachfolgenden virtuellen Datenbanksuchen zu entwickeln. Als Ergänzung zum proteinbasierten Ansatz wurde eine ligandbasierte Strategie für die Identifizierung potenzieller Kandidatenmoleküle verfolgt. Dabei diente ein bekannter AR-Inhibitor als Templatstruktur, bei dem aufgrund zuvor durchgeführter Dockingexperimente die begründete Annahme bestand, dass dieser die Bindetaschenform der MD-Proteinkonfor-mation stabilisieren könnte. Hierbei wurde zunächst eine Moleküldatenbank aus kommerziell erhältlichen Verbindungen, die alle über eine bestimmte Substruktur als Ankergruppe verfügten, aufgebaut und anschließend durch Berechnung molekularer Ähnlichkeiten zu der Templatstruktur auf mögliche Kandidatenmoleküle durchsucht. Die virtuell identifizierten Moleküle der beiden Ansätze wurden im Anschluss mit Hilfe von Dockingsimulationen in die Bindetasche der MD-generierten Proteinkonformation gedockt und die berechneten Bindeposen mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren bewertet. Im nächsten Schritt erfolgte eine Untersuchung der Selektivität der Kandidatenmoleküle anhand eines Cross-Dockingexperiments an verschiedenen Bindetaschenkonformationen der AR. Auf der Grundlage aller durch das virtuelle Screeningverfahren gesammelten Informationen wurde eine finale Molekülauswahl getroffen und sechs kommerziell verfügbare Moleküle für experimentelle Untersuchungen bezogen. Die experimentelle Bestimmung der Enzyminhibition wurde dabei von Kooperationspartnern mit Hilfe eines in vitro Assays untersucht. Aufgrund einer unzureichenden Löslichkeit von vier Substanzen unter den Assaybedingungen konnte lediglich das Inhibitionspotenzial von zwei Verbindungen untersucht werden. Eine der Verbindungen zeigte bemerkenswerterweise eine inhibitorische Aktivität im einstelligen mikromolaren Bereich. Eine finale Beurteilung, ob die Zielsetzung dieser Studie, eine neue computergenerierte Bindetaschenkonformation der AR experi-mentell zugänglich zu machen, durch die vorgeschlagenen Verbindungen erfüllt werden konnte, konnte zum Zeitpunkt der Anfertigung der Dissertation aufgrund ausstehender Kristallstrukturen der jeweiligen AR-Ligand-Komplexe nicht erfolgen und bleibt das Ziel zukünftiger Arbeiten. Die Studie zeigte jedoch deutlich, dass nicht nur experimentell aufgeklärte Proteinstrukturen sondern auch die Nutzung von mit Hilfe computerbasierter Verfahren, wie z.B. mittels MD Simulationen, berechneter Proteinkonformationen als Templatstrukturen für die Identifi-zierung neuer Liganden hilfreich sein kann und daher deren Verwendung für diese Zielsetzung ihre Berechtigung hat. Der zweite Teil der Arbeit handelt von der computergestützten Identifizierung nieder-molekularer Liganden einer neuen potenziellen Bindestelle der biologischen Zielstruktur Hitzeschockprotein 70 (Hsp70), als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren. Hsp70 spielt eine pathophysiologische Rolle bei verschiedenen Krebserkrankungen sowie diversen weiteren Erkrankungen, wie z.B. neurodegenerativen Erkrankungen und Infektions-krankheiten. Bei der neuen potenziellen Bindestelle, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit näher untersucht wurde, handelte es sich um das Interdomäneninterface, der Schnittstelle zwischen der Nukleotid- und Substratbindedomäne von Hsp70. Zum Zeitpunkt der Arbeit waren keine Liganden dieser Proteinregion in der Literatur beschrieben, weshalb es zunächst galt, die Hypothese der Adressierbarkeit dieser Zielregion durch niedermolekulare Liganden zu verifizieren. Hierfür wurde ein virtuelles Screening durchgeführt, bei dem protein- sowie ligandbasierte Suchstrategien zum Einsatz kamen. Im Rahmen des proteinbasierten Ansatzes erfolgte zunächst eine Analyse der Hsp70 Tertiär-struktur auf potenziell vorhandene Ligandenbindestellen. Im Anschluss wurde das Interdomäneninterface auf günstige Interaktionspunkte für bestimmte Atomtypen und funktionelle Gruppen zukünftiger Liganden untersucht. Basierend auf diesen Informationen wurde ein Pharmakophormodell als Filter für nachfolgende virtuelle Datenbanksuchen entwickelt. Bei dem ligandbasierten Ansatz fungierte der bekannte Hsp70-Ligand Apoptozol als Templatstruktur für die virtuelle Datenbanksuche, da die Ergebnisse eines vorab durchge-führten Cross-Dockingexperiments deutlich auf eine Bindung des Moleküls an das Interdomäneninterface hinwiesen. Diese Dockingstudie lieferte erste wertvolle Hinweise hinsichtlich der Bindestelle und potenzieller Bindemodi des Moleküls an Hsp70. Im Anschluss an die virtuellen Datenbanksuchen wurden die identifizierten Kandidaten-moleküle hinsichtlich möglicher Bindemodi und Bindungsaffinitäten mittels Docking-simulationen in Verbindung mit einem Re- und Consensus-Scoringverfahren untersucht. Abschließend wurden neun ausgewählte Kandidatenmoleküle von kommerziellen Anbietern bezogen und mit Hilfe von in vitro Assays von Kooperationspartnern innerhalb der Klinischen Forschergruppe 216 auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber Multiplen Myelomzellen untersucht. Dabei konnte für fünf der neun getesteten Verbindungen bereits bei Konzentrationen im ein- bzw. zweistelligen mikromolaren Bereich eine Aktivität gemessen werden, was einer formalen Trefferquote von 56% entspricht. Weiterhin wurde und wird in Folgearbeiten von Kooperationspartnern versucht, eine Bindung der ausgewählten Kandidatenmoleküle an Hsp70 näher zu charakterisieren und sowohl am separierten Protein, als auch in der Targetzelle nachzuweisen. Darüber hinaus wurde zusätzlich ein fragmentbasierter Ansatz, basierend auf einer bestimmten Substruktur, die als eine Art Ankergruppe fungieren sollte, verfolgt. Dabei diente bei der virtuellen Suche in Moleküldatenbanken kommerzieller Anbieter ein Molekülfragment als Suchanfrage. Aus dem identifizierten Molekülsatz wurden Verbindungen unterschied-lichster struktureller Klassen für nachfolgende Dockingexperimente ausgewählt. Die berechneten Bindeposen wurden einem Re-Scoringverfahren für eine zusätzliche Abschätzung der Bindungsaffinität unterzogen. Schließlich wurden die fünf vielver-sprechendsten Verbindungen für nachfolgende experimentelle Untersuchungen kommerziell bezogen. Die Ergebnisse der nachfolgenden röntgenkristallographischen Aufklärung der Protein-Ligand-Komplexe lagen bei der Anfertigung der vorliegenden Dissertation noch nicht abschließend vor und sind Bestandteil aktueller Forschungarbeiten. Mit den durchgeführten virtuellen Screeningverfahren konnten erstmals potenzielle Liganden des Hsp70-Interdomäneninterfaces als eine neuartige Klasse von Hsp70-Inhibitoren identifiziert werden. Weiterhin können die identifizierten, zytotoxisch aktiven Verbindungen als Leitstrukturen zukünftiger Inhibitordesignstudien dienen, mit dem Ziel sowohl die Zytotoxizität dieser Moleküle zu optimieren, als auch Struktur-Wirkungsbeziehungen für die Entwicklung von Inhibitoren mit verbesserten biologischen Aktivitätsprofilen abzuleiten. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der computerbasierten Charakterisierung der Proteinflexibilität von Hsp70 mit Hilfe von MD Simulationen. In diesem Zusammenhang erfolgte eine Untersuchung intrinsischer Proteinbewegungen sowie des Konformations-raumes anhand von verschiedenen Hsp70-Enzymstrukturen. Die durchgeführten MD Simulationen waren zum Zeitpunkt der Arbeit die ersten Untersuchungen dieser Art, die nicht nur an einer einzelnen Domäne, sondern an ganzen Zweidomänenstrukturen von Hsp70 erfolgten. Die generierten Trajektorien bestätigten die überdurchschnittlich hohe Flexibilität der Zielstruktur Hsp70. Die im Rahmen der Studie identifizierten, zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht beschriebenen Proteinkonformere erweiterten das Spektrum der bekannten Hsp70-Proteinkonformationen erheblich und lieferten mögliche Enzymkonformationen, die als Templatstrukturen für zukünftige strukturbasierte Wirkstoffdesignstudien dienen können. Darüber hinaus stützten die Beobachtungen die Hypothese der prinzipiellen Eignung des Interdomäneninterfaces von Hsp70 als eine Bindestelle für neue Inhibitoren. Auf der Grundlage der gewonnenen Informationen war es weiterhin möglich, eine erste Hypothese hinsichtlich eines potenziellen inhibitorischen Wirkmechanismus der Liganden des Interdomäneninterfaces zu formulieren. Abschließend lässt sich festhalten, dass durch die vorliegende Arbeit viele neue strukturbiologische Erkenntnisse über Hsp70 gewonnen wurden. Dennoch besteht weiterer Forschungsbedarf, um die Strukturbiologie von Hsp70 umfassend aufzuklären. Möglicher-weise können in zukünftigen Studien Enzymstrukturen aufgeklärt werden, die die Existenz der in silico erzeugten und in der Arbeit beschriebenen Proteinkonformere bestätigen. / Proteins are dynamic macromolecular systems, natively existing in different conformations. Particularly proteins with a marked intrinsic flexibility serving as biological targets issue a challenge to computational structure-based drug design even today. This thesis addresses the computer-aided identification of new inhibitors of two structurally highly flexible enzymes which are playing a pathophysiological role in different diseases. Thus, the focus was on the development of virtual screenings that enable considering the protein flexibility adequately. The first part of this thesis describes a virtual screening aiming to identify ligands of a new protein conformation of aldose reductase (AR) that was generated by molecular dynamics (MD) simulations. AR is an enzyme that is related to secondary diseases of diabetes mellitus. The conducted strategy reveals possibilities how pronounced protein flexibility can explicitly be considered by computer-based methods within the scope of a virtual screening. On the one hand, the study was of special interest because of methodical aspects as both an assessment of the significance of computer-generated protein conformations and an examination of the suitability of MD-generated enzyme conformations as templates for structure-based ligand design studies could be made. On the other hand, the study was of interest with regard to structural biology due to a possible expansion of the known conformational space of the enzyme. The identification of suitable ligands out of a database of commercially available compounds was performed with the help of a protein-based as well as a ligand-based approach. During the protein-based approach a comparative structural analysis of different AR-ligand complexes was first done to collect information about experimentally elucidated binding motives, protein-ligand interactions and existing structural differences between the MD-conformation and other existing AR-binding pocket conformations. Afterwards, the binding pocket of the MD-generated protein structure was analysed with regard to favoured interaction sites. These findings served as basis for the development of pharmacophore models serving as a filter in subsequent in silico database screenings. In addition to the protein-based approach a ligand-based strategy was followed to identify potential candidate molecules. A well-known inhibitor of AR served as template structure. Based on previously conducted docking experiments one may assume that this compound might be able to stabilise the binding pocket of the MD-conformation. Consequently, a database of commercially available compounds all containing a certain substructure as anchor group was generated and feasible candidate molecules were searched via calculation of molecular similarities between database molecules and the template structure. All identified compounds were subsequently docked into the binding pocket of the MD-generated protein conformation and predicted binding poses were assessed by a re- and consensus scoring procedure. In the next step selectivity investigations at different AR binding pocket conformations were performed on the basis of a cross-docking experiment. In accordance with all information received during the virtual screening process a final compound selection was made and six commercially available molecules were ordered for further experimental analyses. These experiments were performed by cooperation partners using a well established in vitro assay. As a result of an insufficient solubility of four compounds under the assay conditions, the inhibitory potency of only two molecules could be determined. Remarkably, one compound showed an inhibitory activity at a one-digit micromolar concentration. However, as crystal structures of the particular AR-ligand complexes were pending at the time of preparing the thesis, it was not possible to finally conclude whether the purpose of this study to make a new computationally generated binding pocket conformation of AR experimentally accessible could be achieved. This task remains the aim of future projects. The study clearly demonstrated that not only the use of experimentally elucidated protein structures as template structures can be useful for the identification of new ligands but also the use of structures generated by computer-based procedures like MD simulations. The second part of this thesis is about the computer-aided identification of small ligands of a new potential binding site of the biological target heat shock protein 70 (Hsp70), as a novel Hsp70 inhibitor class. Hsp70 plays a pathophysiological role in different cancer diseases and other diseases such as neuro-degenerative disorders and infectious diseases. The interdomain interface between the nucleotide and the substrate binding domain of Hsp70 represents the new potential binding site and was comprehensively investigated as part of the present thesis. At the time of the study no ligand of this protein region was described in the literature. Thus, the hypothesis whether the target site represents an addressable binding site was needed to be proven by small ligands. For this purpose a virtual screening was conducted by using both protein- and ligand-based search strategies. During the protein-based approach, the tertiary structure of Hsp70 was analysed with regard to potentially existing ligand binding sites. Subsequently, the interdomain interface was scanned to identify favourable interaction sites of specific atom types and functional groups of future ligands. Based on the gathered information a pharmacophore model was developed, serving as a query in following in silico database screenings. The known Hsp70 ligand Apoptozol was of use as template structure for virtual database screenings as results of a previously performed cross-docking experiment indicated that the molecule binds to the interdomain interface. The study provided initial valuable hints about the binding site and potential binding modes of the molecule at Hsp70. After database screenings the identified candidate molecules were tested with regard to their possible binding modes and binding affinities by docking simulations combined with a re- and a consensus scoring procedure. Finally, nine selected compounds were purchased from commercial suppliers and their cytotoxic activity towards multiple myeloma cells was tested in an in vitro assay by cooperation partners of the clinical research group 216. Thereby, five out of nine tested compounds showed a cytotxic activity at one- to two-digit micromolar concentrations, resulting in a formal hit rate of 56%. Ongoing research projects are being made to further characterise the binding of the chosen molecules to Hsp70 and to verify the binding to both the isolated protein and the protein inside the target cells. Furthermore, a fragment-based approach was followed based on a specific substructure that might be serving as an anchor group for a targeted binding to the interdomain interface. A molecular fragment served as query during the virtual search in several compound databases of commercial suppliers. Out of the resulting molecule collection, only members of different, most diverse structural classes were chosen for subsequent docking experiments. As a next step, the calculated binding poses were submitted to a re-scoring procedure to verify the particular binding affinities. Finally, the five most promising compounds were purchased for further experimental analyses. The results of the X-ray crystallography to determine the respective protein-ligand complexes were not finally available at the time of preparing the present thesis and related experiments are still the subject of current research work. With the performed virtual screenings it was possible for the first time to identify potential ligands of the Hsp70 interdomain interfaces as a novel class of Hsp70 inhibitors. Further on, the identified, cytotoxic active compounds might serve as lead structures in future inhibitor design studies that aim to optimise the cytoxicity of these molecules as well as to deduce structure-activity relationships from ligand series for the development of inhibitors that have more favourable biological activity profiles. Another emphasis of the thesis was on the computer-based characterisation of the protein flexibility of Hsp70 with the help of MD simulations. In this context an analysis of intrinsic protein dynamics together with the conformational space was done on the basis of different Hsp70 enzyme structures. At the time of the work, the conducted MD simulations were the first of this type which addressed Hsp70 two-domain-structures instead of structures of separated protein domains. Thus, this thesis provided initial insights into potential intrinsic protein movements. The evaluation of the generated trajectories confirmed the high flexibility of Hsp70. Thereby, at the time of the study so far unknown protein conformations could be identified that considerably expanded the spectrum of known Hsp70 protein conformations and proposed possible enzyme conformations that might be used as template structures for future structure-based drug design studies. Furthermore, the observations supported the hypothesis that the Hsp70 interdomain interface may principally be suitable as a binding site for new inhibitors. In the light of all this information, it was possible to postulate a first hypothesis about a potential mechanism of action of an enzyme inhibition by ligands of the interdomain interface. In summary, the present thesis revealed various aspects with regard to the structural biological elucidation of Hsp70. Nevertheless, structural analyses of Hsp70 will be ongoing in the future. It might be possible that in future studies enzyme structures will be identified that confirm the existence of the in silico generated protein conformers, described in the present thesis.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Giessen, Universiẗat, Diss., 2008.

Zugl.: Zürich, Univ., Diss., 2007.

This PhD thesis is dealing with the bioassay-guided fractionation of a dichloromethane extract of the aerial parts of Achillea fragrantissima with the aim of isolation and structure isolation of the antileishmanial and/or antitrypanosomal principles in the plant. / Diese Dissertation beschäftigt sich mit der aktivitätsgeleiteten Fraktionierung eines Dichlormethanextrakts aus den oberirdischen Teilen von Achillea fragrantissima mit dem Ziel der Isolierung und Strukturaufklärung der anti-leishmanialen und/oder anti-trypanosomalen Verbindungen der Pflanze.

Die humane afrikanische Trypanosomiasis (Schlafkrankheit, HAT) wird durch die Parasiten Trypanosoma brucei rhodesiense und Trypanosoma brucei gambiense ausgelöst und führt unbehandelt zum Tod. Wegen begrenzter Therapiemöglichkeiten sowie vernachlässigter Kontrollprogramme ist HAT eine gegenwärtige Bedrohung, was die Suche nach neuen Wirkstoffen notwendig macht. Ausgangspunkt für die Leitstrukturfindung war das 7-Amino-4-chinolon-3-carboxamid IV mit einem IC50-Wert (T. b. brucei) von 1.2 µM. Die 4-Chinolon-3-carboxamid-Grundstrukturen wurden unter Verwendung der Gould-Jacobs- (1-Alkyl-Derivate) bzw. der Grohe-Heitzer-Synthese (1-Aryl-Derivate) aufgebaut und anhand strukturierter Variation der Substituenten in Pos. 1, 3 und 7 die für die antitrypanosomale Wirksamkeit essenziellen Strukturelemente identifiziert: Pos.1: Die Alkylkettenverlängerung von Ethyl zu n-Butyl bewirkte eine stetige Aktivitätssteigerung, welche auch einem Aryl-Rest in dieser Position überlegen war. Pos.3: Benzylamide mit HBD-Funktionen führten zur Aktivitätsabnahme, während HBA-Funktionen und unsubstituierte Reste zur Steigerung der Wirksamkeit, teilweise in den nanomolaren Konzentrationsbereich, beitrugen. Pos.7: Neben cyclischen sek. Aminen wurden auch aliphatische prim. Amine via konventioneller oder Mikrowellen-unterstützter SNAr eingeführt. Dabei zeigten sich die sek. Amine mit einer antitrypanosomalen Aktivität im teilweise submikromolaren Bereich den acyclischen Aminen deutlich überlegen. Vor allem der Morpholin-Rest bewirkte eine sprunghafte Wirksamkeitsverbesserung. Durch Kombination der Einzelresultate konnte schließlich die den Lipinski’s „Rule of 5“ entsprechende Leitstruktur 33 mit vielversprechender antitrypanosomaler Wirksamkeit (IC50 (T. b. brucei) = 47 nM, IC50 (T. b. rhodesiense) = 9 nM) und geringer Zytotoxizität erhalten werden (SI = 19000). Erste Untersuchungen zur Identifikation des Targets der 4-Chinolon-3-carboxamide ergaben folgende Erkenntnisse: Fluoreszenzmikroskopieuntersuchungen zeigten eine deutliche Veränderung der Morphologie des Mitochondriums bei behandelten BSF-T. b. brucei-Zellen. Anhand einer Zellzyklus-Analyse wurde die Beeinträchtigung der Segregation des Kinetoplasten beobachtet, was zu einem Segregationsdefekt führte. Die Topoisomerase (TbTopoIImt) wurde durch ein „Knockdown“-Experiment als Haupt-Target ausgeschlossen. Trotz der bemerkenswerten biologischen Aktivität war eine In-vivo-Untersuchung der Leitstruktur wegen zu geringer Wasserlöslichkeit nicht möglich, welche auf eine hochgeordnete Schichtgitterstruktur zurückzuführen war. Da die Löslichkeit im Wesentlichen eine Funktion der Lipophilie und der intermolekularen Wechselwirkungen ist, wurden zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit pharmazeutisch-technische Methoden angewandt sowie chemische Strukturmodifikationen vorgenommen: Es wurde eine Lipid-basierte, selbstemulgierende Formulierung entwickelt. Durch Ausbildung stabiler Emulsionen war 33 bis zu einer Konzentration von 10 mg/ml im Wässrigen löslich und somit für die In-vivo-Untersuchung zugänglich. Nach 4-tägiger peroraler Behandlung von NMRI-Mäusen mit einer wässrigen 1:1-Verdünnung der Formulierung konnte keine In-vivo-Aktivität festgestellt werden. Die Sprühtrocknung von 33 resultierte in amorpher Modifikation, welche in Gegenwart von PVP bzw. Eudragit®L100 stabilisiert wurde. Beide Partikel ermöglichten die Übersättigung von 33 im Wässrigen, was im Fall der Eudragit®L100-Partikel zu 200-facher Löslichkeitssteigerung gegenüber der kristallinen Wirkstoffmodifikation führte und somit die In-vivo-Untersuchung ermöglichte. Zusammen mit ersten Metabolismus-Untersuchungen von 33, welche die Berechnung einer Abbau-Kinetik bzw. Clearance ermöglichte, konnte mittels der Software Simcyp® ein Plasmakonzentrationsprofil der Verbindung 33 (Eudragit®L100-Partikel) erstellt werden. Basierend auf diesem Studiendesign wurde die In-vivo-Untersuchung von 33 an mit T. b. rhodesiense infizierten Mäusen durchgeführt und zeigte nach 8-tägiger Behandlung einen deutlichen Rückgang der Parasitämie. Im Fokus der chemischen Strukturmodifikation stand das Einführen polarer und ionisierbarer Strukturelemente, um 4-Chinolon-3-carboxamid-Derivate mit erhöhter Hydrophilie (logP 1 - 3) bzw. Salz- und Co-Kristall-Strukturen zu erhalten. Sämtliche Strukturvariationen trugen zur Verbesserung der Wasserlöslichkeit und der „drug-like“ Eigenschaften im Vergleich zu Verbindung 33 bei, waren allerdings von Aktivitätsverlusten gegenüber T. b. brucei begleitet. Anhand der „ligand efficiency“- und „lipophilic ligand efficiency“-Analyse wurden schließlich die vielversprechendsten Derivate (94 und 96) für die weitere Untersuchung ausgewählt. Mit IC50 (T. b. rhodesiense)-Werten von 4 nM (94) und 33 nM (96) und geringer Zytotoxizität wurden Selektivitätsindizes bis zu 25000 gefunden, welche jene von 33 übertrafen. Aufgrund einer Löslichkeit im millimolaren Bereich, einer moderaten Membranpermeabilität und einer Plasmastabilität von > 2 h können die Verbindungen 94 und 96 somit als erste Wirkstoffkandidaten angesehen werden. Die vollständige physiko-chemische Charakterisierung wurde mittels eines Sirius-T3-Titrationssystems durchgeführt. Unter Verwendung dieser Parameter wurden für die Derivate 94 und 96 je zwei Plasmakonzentrationsprofile mit der Software Simcyp® simuliert. Basierend auf diesem Studiendesign wurde jeweils die hohe Dosis beider Derivate im Mausmodel (T. b. rhodesiense) untersucht. Während nach 5-tägiger Behandlung mit 94 und 96 bei sämtlichen Tiere keine Parasiten mehr nachweisbar waren, wurde ein leichter Rückfall in beiden Versuchsgruppen an Tag 8 beobachtet. Gegenwärtig wird die Behandlung mit beiden Derivaten fortgesetzt. / The human African trypanosomiasis (HAT, sleeping sickness) is caused by the human pathogenic subspecies Trypanosoma brucei gambiense and Trypanosoma brucei rhodesiense which are transmitted by the the bite of the tsetse fly. Without medical treatment patients fall into coma and finally die. Due to limited therapeutic options and neglected surveillance programs HAT is a current threat and makes the search for new easy accessible active compounds inescapable. The lead identification step was based on the 7-amino-4-quinolone-3-carboxamide-derivative IV showing an IC50 value of 1.2 µM against T. b. brucei. Thus, the 4-quinolone-motif was build up by either using the Gould-Jacobs-(1-alkyl-4-quinolone-derivatives) or the Grohe-Heitzer-procedure (1-aryl-4-quinolone-derivatives) followed by SAR (substituents in pos. 1, 3 and 7) to identify essential structural elements: pos.1: Prolongation of the aliphatic chain from ethyl to n-butyl led to increased antitrypanosomal activity which also surpassed the aromatic substituent. pos.3: Benzylamides with HBD-functions decreased the activity, while HBA-functions and unsubstituted benzylamides increased the antitrypanosomal potency, partially to submicromolar concentration range. pos.7: Cyclic sec. and aliphatic prim. amines were introduced in pos. 7 by conventional and microwave-assisted SNAr. In comparison, sec. amines showed higher activity, especially a morpholine residue led to an strong rise in potency. The SAR analysis on the one hand revealed lead structure 33 with promising antitrypanosomal activity (IC50 (T. b. brucei) = 47 nM, IC50 (T. b. rhodesiense) = 9 nM), drug-like properties (Lipinski’s rule of five are fulfilled), and noncritical cytotoxicity (SI = 19000). On the other hand some 1-aryl-derivatives with aliphatic, prim. or sec. amine residues and increased lipophilicity (logP 4 - 5, i. e. 49) showed growing polypharmacological properties which gave new insights in the cytotoxic potential of this molecules crucial for further lead optimization steps. To identify the target of 4-quinoline-3-carboxamide-derivatives first investigations were accomplished: Fluorescence microscopy based screening revealed significant change in the morphology of the mitochondrium for treated BSF-T. b. brucei cells. Interference of kinetoplast segregation was observed in a cell cycle analysis which resulted in a segregation defect. By means of knockdown-experiments the topoisomerase (TbTopoIImt) was excluded as main target for 4-quinolone-3-carboxamide-derivatives. Fluorescence dye labeling of 33 did not reveal further information about the target. Despite promising potency of 33, in-vivo-investigation failed due to very low water solubility caused by a highly ordered layer lattice crystal structure. Since solubility is a function of lipophilicity and intermolecular interactions, approaches from the fields of pharmaceutics and chemical structure modifications were used to overcome the problem: A lipid-based, self-emulsifying formulation was developed (SEDDS). The formation of stable emulsions enabled a drug concentration in aqueous solution of 10 mg/ml. Thus, the formulation was selected for in vivo investigation of 33 with T. b. rhodesiense infected NMRI mice. Unfortunately, the daily peroral application of a 1:1 dilution with a drug concentration of 5 mg/ml did not show any activity after four days of treatment. Spray drying of 33 in the presence of PVP and Eudragit®L100 respectively, resulted in amorphous modification confirmed by means of XRPD (ASDD). Both ASDDs enabled the supersaturation of 33 in aqueous media which in case of Eudragit®L100-ASDD contributed to a 200 fold enhanced solubility compared to the crystalline modification. Based on these results (Eudragit®L100-particle) a pharmacokinetic profile was simulated by means of the software Simcyp® (version 12.0.79.0) using a dose of 0.20 µmol/250 µl/12 h over a period of 4 d and a hepatic clearance value calculated from metabolic degradation data of compound 33. Evaluation of in vivo efficacy of 33 (ASDD-Eudragit®L100) in T. b. rhodesiense infected NMRI mice using the Simcyp® simulation revealed significant reduction of parasitaemia after 8 days of treatment. Thus, in vivo investigation is still ongoing. The main focus of the chemical modification approach was the introduction of polar and ionizable structural elements in order to decrease lipophilicity (logP 1 - 3) and to achieve 4-quinolone-3-carboxamide derivatives as salts or co-crystals. The obtained derivatives showed improved water solubility and better drug-like properties compared to 33, associated with less antitrypanosomal activity against T. b. brucei. According to ligand efficiency and lipophilic ligand efficiency analysis two promising compounds (94 and 96) were selected for further investigations. Both compounds showed IC50 values against T. b. rhodesiense in the low nanomolar concentration range (94: 4 nM, 96: 33 nM) and low in vitro cytotoxicity resulting in selectivity indices up to 25000 surpassing those of 33. Due to aqueous solubility in the millimolar range, moderate membrane permeability (Caco-2-assay) and plasma stability of > 2 h (stability-assay), both compounds were considered as potential drug candidates which were subjected to a complete physico-chemical characterization (pKa, logP, intrinsic solubility) by means of the Sirius-T3-instrument. Subsequently, these parameters were used to simulate two pharmacokinetic profiles (Simcyp®) for each compound (low dose: 0.20 µmol/250 µl/12 h, high dose: 1.00 µM/250 µl/12 h). Based on these simulations the in vivo investigations of 94 and 96 (high dose) revealed significant reduction of parasitaemia after 5 days of treatment but in both cases relapse was observed on day 8. Nevertheless in vivo investigations of 94 and 96 are currently ongoing.

Techniken des computergestützten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schlüsselrolle im strukturbasierten computergestützen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zunächst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergrößern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex beschäftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivität klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich überlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im nächsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinitäten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivität der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verfügbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repräsentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings ermöglicht. Für die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der größten, die bisher für die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datensätze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten für beide Datensätze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datensätzen zeigt - ein Phänomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datensätze ergab darüber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie über die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor für die protein-abhängigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verlässliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums möglich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' für die SFCscore-Funktionen definieren lässt. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zusätzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverlässlichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgeschätzt werden könnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren für das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur für die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Domänen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zunächst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erklärt werden. Für die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Domänen-System, dass verschiedene allostere Zustände einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilität auf die Stabilität der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen für das Protein durchgeführt. Diese zeigen, dass das Protein tatsächlich eine überdurchschnittlich hohe Flexibilität aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Domänen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgeführten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise dafür gefunden werden, dass die Mutationen, welche die für die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilität des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Domänenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilität auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verknüpft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt für die Inhibtion des Proteins darstellt. / Methods of computational drug design play a crucial role in the development of new pharmaceutical drugs. The work presented here comprises the methodological development and the practical application of structure-based techniques in computational drug design. The first part of this dissertation focuses on the development of empirical scoring functions, which play an essential part in structure-based computer-aided drug design. The basis for this work are the empirical descriptors and scoring functions of the SFCscore software package. First, the influence of the training data composition on the prediction of empirical scoring functions was analyzed. A new training data set was created to spread the prediction range of the function and thus achieve a better separation of high and low affinity binders. The resulting function indeed yielded better predictions in the low affinity area compared to the original functions. In another approach, which also addresses the issue of discriminating active and inactive compounds, the Machine Learning method RandomForest (RF) was used to derive a classification model. Different to classical empirical scoring functions, this model no longer predicts a precise value but classifies the compounds according to their potential affinity as 'active' or 'inactive'. The example of the mycobacterial enzyme InhA showed that such models are clearly superior to different classical scoring function in terms of separating active and inactive compounds. The RandomForest algorithm was also used to derive a new scoring function for the prediction of binding affinities. This new function was implemented into the SFCscore software package under the name SFCscoreRF. This new function differs from the original SFCscore functions in several essentials points. On the one hand, the RF-algorithm is a non-linear method, which - in contrast to classical methods used for the derivation of empirical scoring functions - does not assume the additivity of the single descriptors. On the other hand, the algorithm allowes for using the whole set of available SFCscore descriptors and is therefore able to utilize a more comprehensive representation of a protein ligand complex as the basis for the prediction. Additionally, the training data set used to derive SFCscoreRF comprised 1005 complexes. This training set is one of the largest data sets used to train an empirical scoring function. The evaluation against two widely-used benchmark sets confirmed that SFCscoreRF yields superior predicitons as compared to the original functions. The comparison with other functions tested for these benchmarks shows that SFCscoreRF also achieves top results on an international level. Further analyses using a leave-cluster-out validation scheme and the participation in the CSAR 2012 Benchmark Exercise revealed that - similar to other scoring functions - SFCscoreRF shows varying performances when applied to protein-specific data sets. Additionally, by analysing the results of the CSAR 2012 data sets, valuable insight were gained regarding the prediction of docking poses and the statistical significance for the evaluation and comparison of scoring functions. The fact that empirical scoring functions are trained within a certain chemical space, is an important reason for the target-dependent performance observed in this work. Reliable predictions can only be expected within the calibrated area. Different approaches for the definition of this ``applicability domain'' are presented in this work. PCA analyses have been used to create a two dimensional representation of the ``applicability domain''. Additionally, different numerical descriptors have been tested to estimate the reliability of SFCscore predicitons. The RF-proximity has been found to be a promising starting point for future research. The development of new inhibitors for the molecular chaperone Hsp70 - a promising target in the therapy of multiple myeloma - comprises the second part of this dissertation. The basis for this work was a lead structure that was found in a previous work and attacks a novel binding pocket in the interface between the two domains of the Hsp70 protein. The optimization and development of that lead structure - a tetrahydroisochinolinone - was the primary focus of the present work. Potential binding poses in the interface were elucidated by detailed docking analyses. Based on that information, a compound library was compiled, which was synthezised and biologically analyzed by cooperation partners within the CRU 216. The resulting structure activity relationships can partially be explained on the basis of the corresponding docking poses. However, some of the effects remain unexplained. For the further development of new derivatives a comprehensive experimental characterization of the current compounds is needed. This information can be used as a basis for the refinement of the existing binding models. Hsp70 is a two-domain system, which can visit different allosteric states. To further investigate the effects of the resulting flexibility on the stability of the structure and on inhibitor binding, molecular dynamics simulations were conducted. These simulations show an above-average felxibility of the protein, which is primarily dominated by the movement of the two domains NBD and SBD relatively to each other. However, the basic conformation that is observed in the crystal structure hscaz, which was used in this work, remains stable in all simulations. Furthermore, the trajectories showed no evidence that the mutations, in which hscaz differs from the wild type protein, have a significant effect on the overall protein conformation. Although, the overall conformation of the interface between NDB and SBD remains stable, the exact conformation in this area is signficantly influenced by the domain movement. As this region includes the binding pocket of the tetrahydroisochinolinones, the conformational space of this area was analyzed in detail. The analyses expectedly reveal a high flexibility in the interface area that is dominated by the SBD-NBD movement. Furthermore, it could be shown that the conformation and dynamics can be influenced by a bound ligand (apoptozole), in terms of an induced fit mechanism. It is highly probable that the binding of the tetrahydroisochinolinones trigger similar effects, influencing the binding mechanism of this compound class. Thus, molecular dynamics simulations should play a crucial role in the future development of new compounds. The analyses also show that the dynamics of the interface region have large effects on the overall structure of the protein and vice versa. Especially, the relative orientation of NBD and SBD has a large impact on the binding pocket. This underlines the hypothesis that the interface region constitutes a promising target area for the inhibition of Hsp70.

The aim of this thesis is to examine the competition patterns that exist between originators and generics by focusing on the articulations between regulation and incentives to innovate. Once the characteristics of regulation in pharmaceutical markets is reviewed in the first chapter and an analysis of some current challenges related to cost-containment measures and innovation issues is performed, then in the second chapter, an empirical study is performed to investigate substitution patterns. Based on the EC´s merger decisions in the pharmaceutical sector from 1989 to 2011, this study stresses the key criteria to define the scope of the relevant product market based on substitution patterns and shows the trend towards a narrower market in time. Chapters three and four aim to analyse in depth two widespread measures, the internal reference pricing system in off-patent markets, and risk-sharing schemes in patent-protected markets. By taking into account informational advantages of originators over generics, the third chapter shows the extent to which the implementation of a reference price for off-patent markets can contribute in promoting innovation. Finally, in the fourth chapter, the modeling of risk-sharing schemes explains how such schemes can help in solving moral hazard and adverse selection issues by continuously giving pharmaceutical companies incentives to innovate and supplying medicinal products of a higher quality. / In dieser Arbeit werden erstmals die Merkmale der Regulierung auf Pharmamärkten beschrieben und die aktuellen Fragen bezüglich der verschiedenen Marktteilnehmer (Patienten, Ärzte, Krankenkassen) vorgestellt, die im Verlauf dieser Dissertation beantwortet werden: Was sind die Substitutionsmuster auf den Pharmamärkten? Wie kann Preiswettbewerb gefördert werden ohne die Innovationsanreize zu gefährden? Wie können Patienten mit innovativen Arzneimitteln versorgt werden ohne das Haushaltsbudget zu gefährden? Um die erste Frage zu beantworten wird in dem zweiten Teil dieser Dissertation die Definition der relevanten Marktabgrenzung auf Pharmamärkten untersucht. Hierbei wird die Praxis der Europäischen Kommission zur Marktabgrenzung im Bereich Fusionen durch eine ökonometrische Analyse untersucht, um die Substitutionskriterien ausführlich zu analysieren. Der dritte Teil dieser Arbeit untersucht die Funktion sowie die Auswirkungen eines internen Referenzpreissystems auf die Innovationsanreize von Pharmaunternehmen. Zu diesem Zweck werden zunächst die existierenden Verzerrungen im Wettbewerb zwischen Originalpräparaten und Generika betrachtet. Daraufhin sollen die Auswirkungen der Implementierung eines Referenzpreissystems erläutert werden. Die abschließenden Schlussfolgerungen unterstreichen die Relevanz eines solchen Systems, um Anreize für Innovationen zu setzen. Nach der Analyse des Referenzpreissystems für Produkte, die nicht mehr unter Patentschutz stehen, um den Preiswettbewerb zu stärken, bezieht sich der vierte und letzte Teil auf die Vereinbarungen zur Risikoteilung, die eine Alternative sind, um kosteneffiziente innovative Arzneimittel verfügbar zu machen. Zu diesem Zweck werden Vereinbarungen zur Risikoteilung theoretisch in Bezug auf Fragestellungen zu moralischem Risiko und adverser Selektion untersucht. Im weiteren Verlauf der Arbeit wird gezeigt, dass Vereinbarungen zur Risikoteilung wünschenswert sind, weil sie Firmen Anreize geben, im Laufe des Lebenszyklus eines Arzneimittels zu investieren. Dazu kann bewiesen werden, dass nur eine Firma mit einem effizienten Produkt eine Vereinbarung zur Risikoteilung anbieten würde. Als Schlussbemerkungen werden weitere Forschungsaspekte, vor allem biologische Präparate, angesprochen.