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Régulation de la voie MEK/ERK par la signalisation éphrine lors du développement neural chez l'ascidie Ciona intestinalis / MEK/ERK regulation by the ephrin pathway during neural development in ascidian Ciona intestinalis

Haupaix, Nicolas 10 February 2014 (has links)
Durant ma thèse, j’ai participé à une étude fonctionnelle qui a démontré que p120-RasGAP, une protéine appartenant à la famille GAP (GTPase-activating protein), est le médiateur cytoplasmique de l’éphrine lors de l’atténuation d’ERK1/2. Pour confirmer cela, j’ai réalisé une expérience de co-immunoprécipitation et j’ai démontré que p120-RasGAP s’associe au récepteur de l’éphrine, Eph3, quand celui-ci est activé par un ligand éphrine. Ce résultat indique fortement que les signaux FGF et éphrine convergent au niveau de Ras et qu’ils contrôlent de manière antagoniste son activité. Dès lors, j’ai analysé les autres événements de spécification cellulaire impliquant l’antagonisme FGF/éphrine. Chez l’embryon d’ascidie, le signal FGF est décrit comme inducteur du destin neural dans les cellules ectodermiques qui, en absence du signal FGF, adoptent le destin épidermique. L’induction neurale des ascidies a lieu au stade 32 cellules et se traduit par la spécification de quatre précurseurs neuraux (ERK+) parmi les 16 cellules ectodermiques. J’ai démontré que le signal éphrine/Eph/RasGAP antagonise le signal FGF pour générer une activation d’ERK1/2 de type tout ou rien parmi les cellules ectodermiques. Enfin, en collaboration avec Philip Abitua, doctorant dans le laboratoire du Dr. Mike Levine (UC Berkeley), nous démontrons que l’antagonisme entre les signaux éphrine et FGF est impliqué dans la régionalisation antéro-postérieure de la plaque neurale / During my thesis study, I was involved in functional studies to demonstrate that p120-RasGAP, a GTPase-activating-protein (GAP), is a cytoplasmic mediator of the ephrin-mediated ERK attenuation. To confirm this notion, I conducted a co-immunoprecipitation experiment and demonstrated that p120-RasGAP associates with an ephrin receptor, Eph3, when the latter is activated by an ephrin ligand in ascidian embryos. These results strongly indicate that FGF and ephrin signals converge at the level of Ras and control its activity antagonistically. Following this finding, I looked for other cell fate specification events controlled by the antagonism between ephrin and FGF signals. In ascidian embryos, FGF signals are known to induce neural fates in ectodermal cells which otherwise adopt epidermal fates. Ascidian neural induction takes place at the 32-cell stage, resulting in specification of specific four cells as ERK1/2-active neural precursors among 16 ectodermal cells. I was able to demonstrate that ephrin/Eph/RasGAP signals counterbalance FGF neural inducing signals to generate the ON-OFF response of ERK activation among the ectodermal cells. Finally, in collaboration with a PhD student in Dr. Mike Levine’s lab (UC Berkeley), the antagonism between ephrin and FGF signals plays a role in regionalisation of the neural plate along the anterior-posterior axis.
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Analyse quantitative de la morphogenèse animale : de l'imagerie laser haut-débit à l'embryon virtuel chez les ascidies / Quantitative analysis of animal morphogenesis : from high-throughput laser imaging to 4D virtual embryo in ascidians

Guignard, Léo 09 December 2015 (has links)
Les embryons d'ascidies se développent avec un lignage cellulaire stéréotypé et évolutionairement conservé pour produire en quelques heures ou jours un têtard comportant un petit nombre de cellules. De ce fait, ils fournissent un cadre intéressant pour décrire avec une résolution cellulaire le programme de développement d’un organisme complet. Pendant mon doctorat, j’ai développé une approche quantitative pour décrire l’évolution morphologique embryonnaire pendant le développement de Phallusia mammillata. J’ai ensuite utilisé cette approche pour systématiquement caractériser en détail les logiques des événements de spécifications de destin cellulaire.Pour caractériser quantitativement les comportements cellulaires pendant l’embryogenèse, nous avons utilisé de la microscopie à feuille de lumière multi-angles pour imager des embryons entiers à haute résolution spatio-temporelle. Les membranes plasmiques étaient marquées pour permettre l’identification des cellules. Pour extraire les informations biologiques de ce jeu de donnés, j’ai développé une nouvelle méthode pour segmenter les cellules en 4D, ASTEC. Une fois appliquée aux embryons de Phallusia mammillata imagés pendant 6 heures entre le stade 64 cellules et le début des stades bourgeon caudal, cette méthode a permis de récupérer la forme et de suivre 1030 cellules pendant 640 divisions. L’embryon digital 4D résultant peut être formalisé par un graphe dynamique, dans lequel les cellules sont représentées par des sommets reliés par des arrêtes représentant au sein d’un point de temps leur voisinage spatial, et entre différents points de temps leur lignage cellulaire.Basé sur cette représentation digitale et quantitative, nous avons systématiquement identifié les événements de spécification cellulaire jusqu’au dernier stade de la gastrulation. Des simulations informatiques ont révélé que des règles remarquablement simples intégrant les aires de contacts cellulaires et les expressions spatio-temporelles booléennes de signaux moléculaires extracellulaires sont suffisantes pour expliquer les inductions cellulaires au cours du développement précoce. Ce travail suggère que pour les embryons établissant des contacts stéréotypés et précis entre cellules voisines, les contraintes génomiques sont relâchées, ce qui permet une évolution plus rapide du génome. / Ascidian embryos develop with stereotyped and evolutionarily conserved invariant cell lineages to produce in a few hours or days tadpole larvae with a small number of cells. They thus provide an attractive framework to describe with cellular resolution the developmental program of a whole organism. During my PhD, I developed a quantitative approach to describe the evolution of embryonic morphologies during the development of the ascidian Phallusia mammillata. I then used this approach to systematically characterize in detail the logic of cell fate induction events. To quantitatively characterize cell behaviors during embryogenesis, we used multi-angle light-sheet microscopy to image with high spatio-temporal resolution entire live embryos with fluorescently labeled plasma membranes. To extract biological information from this imaging dataset, I then developed a conceptually novel automated method for 4D cell segmentation, ASTEC. Applied to a Phallusia mammillata embryo imaged for 6 hours between the 64-cell and the initial tailbud stages, this method allows the accurate tracking and shape analysis of 1030 cells across 640 cell divisions. The resulting 4D digital embryo can be formalized as a dynamic graph, in which cells are represented by nodes, linked within a time point by edges that represent their spatial neighborhood, and between time points by temporal edges describing cell lineages.Based on this quantitative digital representation, we systematically identified cell fate specification events up to the late gastrula stage. Computational simulations revealed that remarkably simple rules integrating measured cell-cell contact areas with boolean spatio-temporal expression data for extracellular signalling molecules are sufficient to explain most early cell inductions. This work suggests that in embryos establishing precise stereotyped contacts between neighboring cells, the genomic constraints for precise gene expression levels are relaxed, thereby allowing rapid genome evolution.
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Régulation de la voie MEK/ERK par la signalisation éphrine lors du développement neural chez l'ascidie Ciona intestinalis

Haupaix, Nicolas 10 February 2014 (has links) (PDF)
Durant ma thèse, j'ai participé à une étude fonctionnelle qui a démontré que p120-RasGAP, une protéine appartenant à la famille GAP (GTPase-activating protein), est le médiateur cytoplasmique de l'éphrine lors de l'atténuation d'ERK1/2. Pour confirmer cela, j'ai réalisé une expérience de co-immunoprécipitation et j'ai démontré que p120-RasGAP s'associe au récepteur de l'éphrine, Eph3, quand celui-ci est activé par un ligand éphrine. Ce résultat indique fortement que les signaux FGF et éphrine convergent au niveau de Ras et qu'ils contrôlent de manière antagoniste son activité. Dès lors, j'ai analysé les autres événements de spécification cellulaire impliquant l'antagonisme FGF/éphrine. Chez l'embryon d'ascidie, le signal FGF est décrit comme inducteur du destin neural dans les cellules ectodermiques qui, en absence du signal FGF, adoptent le destin épidermique. L'induction neurale des ascidies a lieu au stade 32 cellules et se traduit par la spécification de quatre précurseurs neuraux (ERK+) parmi les 16 cellules ectodermiques. J'ai démontré que le signal éphrine/Eph/RasGAP antagonise le signal FGF pour générer une activation d'ERK1/2 de type tout ou rien parmi les cellules ectodermiques. Enfin, en collaboration avec Philip Abitua, doctorant dans le laboratoire du Dr. Mike Levine (UC Berkeley), nous démontrons que l'antagonisme entre les signaux éphrine et FGF est impliqué dans la régionalisation antéro-postérieure de la plaque neurale
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Evolution des programmes transcriptionnels développementaux des ascidies Ciona robusta et Phallusia mammillata / Evolution of regulation of ascidian species

Madgwick, Alicia 07 November 2017 (has links)
Comment la morphogenèse embryonnaire peut-elle être conservée malgré une divergence importante des séquences codantes et non-codantes ? Pour répondre à cette question, nous avons travaillé sur le développement précoce d’ascidies divergentes, Phallusia mammillata et Ciona intestinalis. Ces espèces partagent une morphogénèse pratiquement identique et des lignages cellulaires stéréotypés. Or, leurs génomes sont tellement divergents que leurs séquences ne peuvent pas être alignées.Nous avons choisi d’étudier les cellules précurseuses de l’endoderme au cours de deux processus développementaux conservés : spécification du destin et la gastrulation. Nous avons comparé par hybridation in situ l’expression transcriptionelle des gènes régulateurs orthologues dans Phallusia et Ciona. Nous avons trouvé que l’expression dans l’endoderme de 8 gènes régulateurs impliqués dans ces processus développementaux est qualitativement conservée entre les deux espèces.Pour étudier comment ces gènes ont conservé leur régulation malgré une divergence non-codante importante, nous avons collaboré avec l’équipe Gomez-Skarmeta pour cartographier, par ATAC-seq, la chromatine ouverte dans les deux espèces pour identifier les régions régulatrices actives à l’échelle du génome. 35 sur les 39 séquences ouvertes avoisinant les gènes de l’endoderme ont été trouvé active avant le stade larval, par éléctroporation. La plupart des séquences testées ont conservé leur activité dans les deux espèces malgré la divergence de séquence. Nous avons alors identifié des sites de fixations pour facteurs de transcription potentiels se trouvant dans les enhancers pour l’endoderme pour identifier les régulateurs dans Phallusia et Ciona.Nos résultats suggèrent des changements assez importants de l’ordre des sites de fixations sans pour autant avoir de changement dans l’architecture dans les réseaux de gènes régulateurs ; ceci explique la conservation qualitative de l’expression des gènes entre ces ascidies divergentes. En outre, nous avons trouvé que les shadow enhancers sont plus répandus qu’anticipé. / How can embryonic morphogenesis be evolutionarily conserved in spite of extensive divergence in coding and non-coding genome sequences? To address this question, we worked on the early development of two very divergent ascidians, Phallusia mammillata and Ciona intestinalis. These species share an almost identical early morphogenesis and stereotyped cell lineages. Remarkably, however, their genomes are divergent to the extent that their non-coding sequences cannot be aligned and gene order has not been conserved.We focus our attention on the behaviour of endoderm precursors throughout two important evolutionarily conserved developmental processes: initial fate specification and early gastrulation. We first compared by in situ hybridisation the transcriptional expression of orthologous regulatory genes in Phallusia and in Ciona. We found that the endodermal expression of 8 regulatory genes known to be involved in these developmental processes is qualitatively conserved between the two species.To study how these genes conserved their regulation in spite of extensive non-coding sequence divergence, we collaborated with the Gomez-Skarmeta lab to map, by ATAC-seq, open chromatin regions in both species to identify active regulatory regions genomewide. Three quarters of the 39 open chromatin regions for endodermal genes behaved as active regulatory sequences by the larval stage, when tested by electroporation in embryos. Many of the tested sequences had conserved cis-regulatory activity in both species in spite of sequence divergence. We have identifed putative transcription factor binding sites in endodermal enhancers in both species to identify conserved upstream regulators shared between Phallusia and Ciona.Taken together our results suggest that extensive transcription factor binding site turn over, without radical change in GRNs architecture, may explain the qualitative conservation of gene expression patterns between highly divergent ascidian genomes. Furthermore, we found that shadow enhancers are much more prevalent than initially anticipated.Taken together our results suggest that extensive transcription factor binding site turn over, without radical change in GRNs architecture, may explain the qualitative conservation of gene expression patterns between highly divergent ascidian genomes. Furthermore, we found that shadow enhancers are much more prevalent than initially anticipated.
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A new model to study alternative developments : asexual propagation and regeneration in the basal chordate Botryllus schlosseri / Un nouveau modèle pour l'étude des voies de développement alternatives : reproduction asexuée et régénération chez un chordé basal, Botryllus schlosseri

Ricci, Lorenzo 25 September 2015 (has links)
Chez l’ascidie coloniale Botryllus schlosseri, en plus de l’embryogénèse existent deux voies de développement aboutissant à la production de la même structure : l’organisme adulte ou zooide. Ces développements alternatifs ont lieu lors de processus biologiques distincts : le bourgeonnement palléal (BP) et le bourgeonnement vasculaire (BV). Le BP est un processus de multiplication asexuée présentant une ontogénèse stéréotypée. En revanche, le BV est un phénomène régénératif, induit dans les vaisseaux sanguins de la colonie par l’ablation de tous les zooides et bourgeons palléaux. Mes travaux de recherche ont eu pour objectif de caractériser les bases moléculaires et cellulaires régissant le BP et le BV chez B. schlosseri. L’étude de gènes marqueurs des lignées méso-, endo- et ectodermiques a révélé l’existence de territoires présomptifs pour chacune de ces lignées, dès les premiers stades du BV et du BP, et suggéré l’existence d’un programme unique aux deux processus. Les lignées neurales et musculaires ont été étudiées plus en détail lors du BP, indiquant un double rôle potentiel, neuro- et myo-génétique, au tube dorsal, une structure jusqu’à présent uniquement associée au système nerveux. Une caractérisation morphologique poussée a mené à l’identification de stades précoces stéréotypés du BV lors de la régénération. Enfin, l’analyse de transcriptomes de différents stades du BP et de la régénération ont initié l’étude non biaisée des bases moléculaires du bourgeonnement chez Botryllus. L’objectif à long terme de ces travaux est de décrypter les bases moléculaires et génétiques facilitant, chez les métazoaires, l’évolution de voies de développement alternatives. / In addition to embryogenesis, the colonial ascidians Botryllus schlosseri evolved two alternative developmental pathways leading to the same final structure: the adult body, or zooid. These non-embryonic ontogenesis occur during distinct biological processes: palleal budding (PB) and vascular budding (VB). PB is a process of asexual propagation, with a very stereotyped morphogenesis. Conversely, VB is a purely regenerative phenomenon, induced in the vascular system of the colony by the ablation of all zooids and palleal buds. My research work followed the objective to characterize the molecular and cellular basis of both PB and VB in B. schlosseri. The study of meso-, endo- and ectodermal lineage marker genes revealed the existence of presumptive territories of these lineages in the early palleal and vascular buds and that a single developmental program was launched in both VB and PB. Neural and muscle fates were studied in more detail for PB, indicating a potential double function, both neuro- and myo-genic for the dorsal tube, a structure so far associated with the nervous system only. A detailed morphological description of VB allowed to identify stereotyped stages during early regeneration. Eventually, a transcriptomic characterization of early VB and PB processes initiated an unbiased study of the molecular basis underlying the budding phenomenon in Botryllus. The overall goal of these research works is to unravel the molecular and genetic basis that facilitated, in Botryllus and globally in metazoan, the evolution of alternative developmental pathways.
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Outils d'analyse d'images et recalage d'individus pour l'étude de la morphogenèse animale et végétale / Image analysis tools and inter-individual registration for the study of animal and plant morphogenesis

Michelin, Gaël 28 October 2016 (has links)
En biologie développementale, l'étude d'organismes modèles vise à comprendreles mécanismes génétiques responsables de la morphogenèse chez le vivant. Lamicroscopie confocale à fluorescence permet aujourd'hui d'observer in vivo àl'échelle de la cellule et avec une haute fréquence temporelle le développementd'organismes. Les séquences d'images 3D+t ainsi obtenues nécessitent d'avoirdes outils de traitement d'images adaptés.Dans cette thèse, nous construisons des outils dédiés à l'étude dudéveloppement de deux organismes, l'embryon de l'ascidie Phallusiamammillata et le bouton floral d'Arabidopsis thaliana.Nous développons d'abord une méthode de comparaison de segmentationsadaptée aux images de tissus épithéliaux d'organismes en développement.Nous nous appuyons sur cet outil pour valider notre seconde contribution quiporte sur la mise en place d'un outil de détection et de reconstruction demembranes cellulaires conçu afin de procéder à la segmentation de cellulesdans les images d'ascidies et d'arabidopsis.Nous utilisons ensuite l'outil de segmentation de membranes précédemmentintroduit pour construire une stratégie de recalage spatial inter-individusappliquée aux embryons d'ascidies. Enfin, nous élaborons une stratégie derecalage spatio-temporel inter-individus appliquée à des séquences d'images 3Dde méristèmes floraux / In developmental biology, the study of model organisms aims for theunderstanding of genetic mechanisms responsible of morphogenesis. Today,fluorescent confocal microscopy is a means for in vivo imaging of developingorganisms at cell level with a high spatio-temporal resolution. To handle such3D+t image sequences, adapted computer-assisted methods are highlydesirable.In this thesis, we build dedicated tools for the study of two developingorganisms, the ascidian Phallusia mammillata's embryo and the Arabidopsisthaliana's floral meristem.We first develop a method for segmentation comparison adapted to developingorganism epithelial tissue images. This tool is then used to validate our secondcontribution that is about the development of a cell membranes detection andreconstruction tool for cell shape segmentation process applied to ascidian andarabidopsis images.We then use the previously introduced membrane detection tool to build aninter-individual spatial registration strategy applied to ascidian embryo images.Finally, we develop an inter-individual spatio-temporal registration strategyapplied to 3D image sequences of arabidopsis floral meristems

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