Depuis la mise en cuve du raisin jusqu'à la dégustation, les interactions entre tanins et protéines jouent un rôle prépondérant en Œnologie. Elles vont influencer de nombreuses caractéristiques du vin, notamment l'astringence. La cinétique et l'équilibre de l’interaction entre la BSA, une protéine modèle, et des tanins de raisin ont été étudiés. Différentes conditions de ratio initial, de pH et d'éthanol ont permis de mettre en évidence des propriétés essentielles du mécanisme. La non-stœchiométrie de la réaction et la dépendance linéaire du ratio initial tanin-protéine de la solution avec celui du précipité est un des points clefs. Les constantes cinétiques sont également dépendantes de ce ratio. La participation conjointe des forces hydrophobes et des liaisons hydrogènes a été montrée. En parallèle, le suivi des tanins et des protéines lors de la vinification et de la dégustation a été réalisé. La disparition des protéines dans le moût au début de vinification peut être corrélée au comportement des tanins. Une méthode HPLC permettant la titration de la salive par le vin montre un comportement classique des protéines salivaires dans l'interaction. La visualisation des protéines salivaires précipitant sous l'effet des tanins par gels 2D montre globalement une non-spécificité de l’interaction avec une précipitation non sélective des protéines salivaires par les tanins du vin. / From wine making to wine tasting, interactions between tannin and protein detain a prominent role in Enology, influencing several wine characteristics like its astringency. Interaction kinetics and precipitation equilibrium between BSA, a model protein, and grape seed tannin have been studied. Variations of initial ratio, pH and ethanol conditions pointed out essential properties of the mechanism. Lack of stoichiometry of the interaction with a linear dependence between initial and final tannin/protein ratio are key points. Kinetic constants are also related to this ratio. Mutual participation of both hydrophobic forces and hydrogen bonds has been shown. Along with these investigations in model solution, tannin and proteins have been followed during wine making and tasting. Disappearance of protein in the must and tannin behaviour can be linked. An HPLC method allowing the titration of saliva with wine indicates a classical behaviour of salivary proteins. Observation of salivary proteins precipitating with tannin thanks to 2D gels shows a non selective precipitation of salivary proteins by wine.

L’astringence est une sensation de sécheresse ressentie en bouche lors de la dégustation des vins rouges, qui résulte de la complexation entre les polyphénols du vin et les protéines de la salive, provoquant une diminution de lubrification en bouche. Parmi les protéines salivaires, les protéines riches en prolines (PRP) sont connues pour leur capacité à se lier aux polyphénols et à précipiter avec eux. Une meilleure connaissance de ce phénomène au niveau moléculaire est nécessaire pour le comprendre et le maîtriser. Il a été montré qu’un peptide de quatorze acides aminés, IB714, dont la séquence est conservée au sein des protéines riches en proline, était un mime représentatif des PRP. Un travail préliminaire par spectrométrie de masse résolue en énergie a permis de caractériser les interactions entre des polyphénols et le peptide IB714. Une échelle d’affinité en phase gazeuse a ainsi été déterminée. Cependant, cette méthodologie d’analyse d’un système modèle ne permet pas de s’accommoder de la complexité du vin. C’est pourquoi nous avons conçu une nouvelle stratégie reposant sur l'utilisation de sondes moléculaires immobilisée sur des billes magnétiques. Dans un premier temps nous avons élaboré une sonde peptidique, en greffant le peptide IB714 sur des billes magnétiques portant des fonctions carboxylates. Cette sonde peptidique a ensuite été étudiée avec des polyphénols modèles. Après sédimentation des billes magnétiques, les polyphénols non captés par la sonde ont été dosés par spectrométrie de masse en utilisant un étalon interne. Une échelle d'affinité en phase liquide a été établie de cette manière. Les positions relatives des polyphénols modèles sur cette échelle sont similaires à celles qui ont été établies en phase gazeuse. Dans un second temps, nous avons construit sur le même principe une sonde polyphénolique. Pour cela, un polyphénol modifié chimiquement a été immobilisé sur des billes magnétiques portant des fonctions amines. Cette sonde polyphénolique a été utilisée pour étudier l'interaction avec le peptide IB714. Par ailleurs, pour préparer une étude des interactions entre polyphénols et protéines salivaires avec des mélanges plus complexes que les systèmes modèles, une étude de fractionnement des protéines salivaires a été entreprise, permettant notamment de d’éliminer l’amylase, protéine majoritaire de la salive humaine. De même, un fractionnement d’un vin rouge a été entrepris pour disposer de fractions de tannins caractérisées par spectrométrie de masse. La sonde peptidique est l’outil moléculaire qui offre le plus de perspectives de développement ultérieur. / Astringency is a pucker or dry mouth sensation, typically experimented with red wine tasting, that finds its origin in the complexation of polyphenols with salivary proteins, producing a reduced lubrication of the oral cavity. Among salivary proteins, proline rich proteins (PRPs) are well known for their capacity to bind and precipitate dietary polyphenols. A better knowledge of this phenomenon at the molecular level is required in order to master it. A 14 amino acid stretch from the PRP IB7 has been synthesized and shown to be a representative mimic of PRPs. Previous work by Energy Resolved Mass Spectrometry (ERMS) allowed characterizing the keys parameters of the interactions between these polyphenols and the IB714 probe. An affinity scale in the gas phase was determined in this way. However, the ERMS approach was hardly compatible with the complexity of wine polyphenols, and a validation of the affinity scale in condensed phase was required. Thus, we designed a new strategy relying on the use of molecular probes immobilized on magnetic beads. A peptidic probe was obtained by grafting the synthetic IB714 peptide on magnetic beads bearing carboxylate functions, and used to study its interaction with model polyphenols. After magnetic precipitation of the beads, unbound polyphenols left in the supernatant were quantified by mass spectrometry using an internal standard. An affinity scale in liquid phase was established in this way. Relative positions of model polyphenols on this latter scale were similar to those determined by ERMS. A polyphenolic probe was obtained by grafting a model polyphenol on beads bearing amine functions. This probe has been used to study the interaction with IB714. To prepare further work on more complex mixtures, attempts were made to fractionate human saliva; this allowed eliminating amylase, the major salivary protein. Wine tannins were also fractionated, in order to isolate condensed polyphenols that are characterized by mass spectrometry. The peptidic probe is the molecular tool that offers the best perspectives for future work.

Les tannins sont des polymères de polyphénols présents en quantité significative dans le vin rouge, et responsables de l’astringence et de l’amertume. L’astringence est une sensation de sècheresse et de rugosité en bouche résultant d’une forte interaction entre les tannins et les protéines de la salive impliquées dans la lubrification de la cavité buccale. L’amertume, quant à elle, est un goût stricto sensu résultant de l’interaction spécifique des tannins avec les récepteurs du goût situés dans les papilles linguales. Des études récentes ont montré que les tannins sont susceptibles d’interagir avec les lipides. Or les lipides sont présents lors de la dégustation d’un vin comme composants des membranes buccales ou des aliments gras. Cependant, le rôle des lipides dans les perceptions sensorielles d’un vin n’est pas bien connu d’un point de vue œnologique. L’objectif de cette thèse était d’étudier au niveau moléculaire les interactions tannin-lipide, pour mieux comprendre leur rôle dans les propriétés gustatives du vin. Le présent travail décrit l’effet de deux entités représentatives des tannins du vin : un monomère, la catéchine, et un dimère, la procyanidine B1, sur deux modèles lipidiques. Le premier modèle est un modèle membranaire représenté par des vésicules multilamellaires composées de POPC/Cholestérol (70/30), qui mime la composition lipidique des membranes buccales. Le deuxième modèle est une émulsion huile dans l’eau (H/E) stabilisée par le DMPC, qui mime les gouttelettes lipidiques présentes dans les aliments gras. L’organisation et la dynamique des lipides composant ces deux modèles ont été étudiées par la spectroscopie RMN (1H, 2H, 13C) en présence et en absence des deux entités de tannins. Leur localisation dans les membranes lipidiques a également été explorée, de même que leur affinité pour les lipides avec la détermination des constantes d’association tannin-lipide. Les résultats ont mis en évidence un effet fluidifiant des tannins à la fois sur le modèle de membranes buccales et sur le modèle de gouttelettes lipidiques. On a démontré que cet effet de désordre est lié à la nature chimique des tannins, ainsi qu’à leur position dans la membrane. De plus, les résultats sur l’affinité tannin-lipide sont en faveur d’une compétition avec les protéines salivaires. En outre, les résultats de biophysique se sont avérés conformes avec ceux d’une analyse sensorielle menée en parallèle qui a révélé que les aliments gras sont susceptibles de diminuer l’astringence du vin. Ces travaux montrent l’impact des composés phénoliques sur l’ordre membranaire et soulignent pour la première fois un rôle potentiel des lipides sur le goût du vin. D’une part, les interactions tannin-lipide, en perturbant l’environnement lipidique des récepteurs du goût enchâssés dans les membranes buccales, pourraient affecter la fonctionnalité du récepteur et son interaction avec les tannins, et donc l’amertume. D’autre part, une éventuelle compétition entre les interactions tannin-lipide et tannin-protéine de la salive pourrait diminuer l’astringence durant la dégustation d’un vin. Dans le domaine de l’œnologie, cette thèse vient étayer le ressenti des dégustateurs à savoir la modification du goût du vin due aux aliments et ouvre de nouvelles perspectives dans le cadre de l’association mets-vins. / Tannins are polyphenol polymers present in significant amounts in red wine responsible for astringency and bitterness. The former is a tactile perception involving dryness and roughness in the mouth due to the interaction between tannins and saliva proteins and the latter is a primary taste due to the interaction between tannins and taste receptors in taste buds. Tannins are now known to also interact with lipids. Although not present in wine, lipids are yet present during tasting in the oral membranes of tasters and in fatty foods when wine is consumed during a meal. However, although the influence of lipids is well known to wine tasters through food pairing, there is no scientific evidence to support this hedonic feeling. The aim of the thesis is to study tannin-lipid interactions at molecular level in order to better understand their implication in wine gustative properties. The present work describes the effect of the main representative grape tannin subunits, the catechin monomer and the B1 dimer, both on a model of oral membranes and food fat globules. They are represented by a dispersion of POPC/cholesterol multilamellar vesicles and a olive oil in water emulsion stabilized by DMPC as emulsifier, respectively. The organization and dynamics of the lipids composing these two models were investigated by solid-state NMR spectroscopy (1H, 2H, and 13C) in the absence and the presence of the two tannin subunits. The affinity of tannins for lipids was also explored by the determination of the thermodynamic association constant. The results pointed out a fluidizing effect of tannins both on the membrane model, as previously shown on a simpler membrane model, and on the emulsion lipid droplets. The disorder caused by tannins was shown to be related to their location in the lipid structure depending on the tannin chemical nature. Moreover, the strength of the interaction between tannins and membrane lipids was revealed to be in the same order of magnitude of that between tannins and saliva proteins. In addition, the biophysical results were in accordance with those of a sensory analysis led in parallel that revealed that fatty foods are prone to decrease wine astringency. These pioneering works shows the impact of phenolic compound on membrane order and highlight for the first time the potential role of the tannin-lipid interactions on wine taste. On the one hand, by disrupting the lipid environment of taste receptors embedded in oral membranes, tannin-lipid interactions could affect the receptor functionnality and therefore the interaction with tannin molecules, so bitterness. On the other hand, the existence of a possible competition between lipids and saliva proteins for interacting with tannins during tasting could reduce astringency.

Lors de l’élevage des vins avec le bois de chêne, plusieurs molécules d’intérêts organoleptiques comme les ellagitanins (vescalagine, castalagine, roburines A, B, C, D, E et grandinine), sont extraites. Leurs concentrations dans le bois et le vin sont très variables et leurs cinétiques d’extraction au cours de l’élevage ainsi que leurs propriétés organoleptiques dans les vins sont mal connues. Dans le but de classifier chaque douelle pour fabriquer des barriques avec des indices en polyphénols (IP) totaux significativement différents, un système proche infrarouge (NIRS), Oakscan®, a été mis en place par la tonnellerie Radoux. Notre objectif était d’étudier l’influence de ce mode de classifications des bois au niveau de la composition moléculaire et organoleptique des vins. Dans un premier temps, la classification NIRS des bois de chêne a été confirmée par quantification des concentrations en ellagitanins totaux et moléculaire par HPLC-UV-MS. Une forte variabilité des concentrations en ellagitanins des bois est observée entre 5,95 et 32,91 mg d’équivalent acide ellagique/g de bois. De plus, la classification NIRS des bois se corrèle avec les analyses chimiques (p < 0,02%). Cette nouvelle méthode permet donc de fabriquer des barriques avec un IP moyen différent (IP : 11 à 70). Dans un second temps, des vins de différentes origines et cépages sont élevés dans les barriques classifiées. La cinétique des teneurs en ellagitanins montre l’influence de la classification des bois de chêne (p < 5%). En effet, dès les premiers mois d’élevage, une augmentation en ellagitanins jusqu’à un maximum est obtenue. Plus les bois sont riches, plus le maximum de concentration en ellagitanins des vins est élevé et décalé dans le temps. Puis, une lente diminution des concentrations en ellagitanins est observée. Les influences du grain et de la chauffe des bois ont également été analysées. La solubilisation dans les vins des composés aromatiques des bois de chêne classifiés par Oakscan® montre dans plusieurs cas que les teneurs en aldéhydes furaniques et en syringol impliqués dans les perceptions du fumé/grillé sont corrélées avec la classification NIRS et également avec l’IP des bois. Ainsi, un vin élevé au contact de bois riches en polyphénols possède des concentrations en arômes fumé/grillé plus importantes. Néanmoins, l’intensité de la chauffe a un rôle prépondérant sur les concentrations de ces arômes boisés. Parallèlement, les propriétés organoleptiques des vins élevés avec du bois de chêne à 6, 12, 18 ou 24 mois et testées par un jury entrainé, montrent des différences significatives corrélées à l’IP des barriques. Les vins élevés au contact des IP les plus importants sont significativement décrits comme plus boisés, fumés/grillés et épicé au nez. En bouche, l’amertume et l’astringence sont significativement plus importantes pour les vins élevés dans les barriques possédant les plus fortes concentrations en ellagitanins. A contrario, le fruité des vins, au nez et en bouche, est généralement noté comme moins important pour les vins élevés avec des barriques à IP le plus haut.L’influence de la classification des bois, en fonction de leurs grains et de leurs IP, sur la consommation en oxygène des vins rouges a été suivie grâce à une méthode innovante et non invasive. Les résultats montrent que 96% de l’oxygène dans le vin à T0 est consommé huit jours après entonnage. Des différences significatives (p < 0,01%), entre les vitesses de consommation de l’oxygène et l’IP ou le grain des barriques, sont observées. La vitesse de consommation d’oxygène augmente en corrélation de l’IP des barriques ou de la taille du grain. Ces résultats permettent d’envisager l’utilisation de méthodes de sélection non empiriques et fiables des bois de chêne en fonction de leurs grains ou de leurs concentrations en ellagitanins ce qui permet de fabriquer des barriques classifiées à l’aide de nos résultats conférant, au vin, des propriétés organoleptiques maîtrisées. / During the wine aging with oak wood, some compounds with interesting organoleptic properties such as ellagitannins (i.e., vescalagin, castalagin, roburins A, B, C, D, E and grandinin) are extracted. The ellagitannins concentrations in oak wood and wine are highly variable and their extractions kinetic during the aging as well as their organoleptic impacts on wines are poorly known and still unclear. In order to classify each stave according to their polyphenolics index (IP) before making the barrels, an infrared system (NIRS), Oakscan®, was develop by the tonnellerie Radoux. Our aim was to study the influence of this wood classification on the wines molecular composition and organoleptic properties.In the first place, the NIRS oak staves classification has been confirmed by the determination of the total ellagitannins concentration as well as the specific levels of each ellagitannins molecule by HPLC-UV-MS. A high variability of the ellagitannins level in wood between 5.95 ± 0.30 and 32.91 ± 0.98 mg ellagic acid equivalent/g of dry wood was observed. Furthermore, the wood infrared classification is correlated with chemical analyzes (p < 0.02%) and allow the production of barrels with different IP (IP: 11, 12, 16, 21, 26, 30, 35, 36, 39, 40, 41, 50, 51, 53, 62, 67 et 70).In a second place, some wines were aged in the classified barrels. The ellagitannins levels show the oak wood classification influences (p < 5%). Indeed, the first months of aging, the ellagitannins concentration increased until a maximum was obtain . Indeed, this maximum concentration in wine aged in barrel manufactured with the wood richer in ellagitannins was higher and latter (2.30 ± 0.05 after 4 months and 11.56 ± 0.31 mg ellagic acid equivalent/L of wine after 12 months respectively for the IP 21 and IP 70 barrels). After this maximum, a slow decrease of the ellagitannins level was observed. The influences of grain and toasting were also analyzed. The aromatics compounds solubilization of classified oak wood by Oakscan® show that the furanic aldehydes levels (furfural, alcool furfurylique et 5-méthylfurfural) and the syringol involved in the smocked/toasted aromas were correlated with the NIRS classification and the wood IP. So, a wine aged in contact with wood richer in polyphenols compounds was describe as more smocked/toasted. Nevertheless, the toasting intensity (which formed these compounds by thermo-degradation of hemicelluloses and lignins) plays a major role on their concentrations. Moreover, organoleptic properties of the wines aged with oak wood (barrels, staves) at 6, 12, 18 or 24 month and tested by trained judges were significantly impacted by the IP barrels. In fact, wine with the highest ellagitannins level was significantly described with a higher woody, smoked/burned and spicy in nose. In mouth, the bitterness and the astringency were significantly higher in wine containing the highest ellagitannins level. Whereas, the wine fruity aroma, in nose and mouth, was generally descript as lower in wine aged with the barrel with the IP higher.The influences of wood classification, in relation with the grain and the IP, on the red wine oxygen consumption after being put into barrels were analyzed with a new no invasive method. The results show that 96% of the oxygen in wine at T0 was consumed after 8 days. Significant differences (p < 0.01%) between the oxygen consumption speed and the barrel IP or the grain were observed. The oxygen consumption speed increase with correlation of barrel IP or the size of grain. These results allows the utilization of method not empirical and reliable method to select oak wood regarding their grain or their ellagitannins concentration in order to be able to produce oak barrels classified by means of our results to give organoleptic properties controlled to the wine.

L'astringence résulte de l'interaction des tanins, polyphénols abondants dans les végétaux, avec les protéines salivaires et plus particuliÈrement les protéines salivaires riches en proline (PRP), appartenant à la famille des protéines peu structurées. Les tanins participent aux mécanismes de défense des végétaux et présentent des effets antinutritionnels dus à leur capacitè à inhiber les enzymes digestives. La synthÈse de PRP salivaires constitue un mècanisme d'adaptation à la consommation d'aliments riches en tanins. Ce travail vise à caractèriser les complexes ètablis en solution entre les PRP et les tanins, par une approche basèe sur la spectromètrie de masse (MS). Pour cela, les protèines salivaires humaines IB5, PRP basique, et II-1, PRP glycosylèe, ont ètè produites par voie hètèrologue. AprÈs purification, les deux protèines ont ètè caractèrisèes par MS avec une source d'electronèbullisation (ESI-MS) et avec une source MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation). L'ètude des interactions par ESI-MS a confirmè la prèsence en solution de complexes non-covalents IB5tanin et permis de prèciser leurs stchiomètries. Des expèriences de compètition entre diffèrents tanins et de dissociation des complexes IB5tanin ont mis en èvidence l'influence des principales caractèristiques structurales des tanins sur cette interaction. L'ètude structurale des èdifices IB5tanin, par diffèrentes techniques de MS/MS (Collision Induced Dissociation, Electron Capture Dissociation et photodissociation) et par mobilitè ionique couplèe à la MS, a mis en èvidence la prèsence de plusieurs sites d'interaction sur IB5 ainsi que des changements conformationnels liès à l'interaction / Astringency is an important organoleptic property of plant-based food. It is attributed to interactions of tannins, which are polyphenolic compounds, with salivary proteins and especially proline rich proteins (PRPs), which belong to the group of intrinsically unstructured protein (IUP). Tannins play an important part in plant defence mechanisms. Indeed, they have an antinutritional effect as they inhibit digestive enzymes. Production of salivary PRP is thus an adaptation process to tannin-rich diets. The purpose of this work is to provide a closer look at PRPtannin supramolecular edifices in solution, using a mass spectrometry (MS) approach. The human salivary proteins IB5, a basic PRP, and II-1, a glycosylated PRP, have been produced by heterologous expression. After purification, both proteins have been characterized by MS using electrospray (ESI) and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) sources. The study of the interaction between IB5 and model tannins by ESI-MS confirmed the presence of IB5tannin non covalent complexes in solution and provided new information on their stoichiometries. Competitive interaction experiments between IB5 and two tannins, along with IB5tannin complexes dissociation studies revealed the impact of the main tannin chemical features on this interaction. Structural studies performed on IB5tanin edifices by Collision induced dissociation (CID), Electron Capture Dissociation (ECD) and photodissociation MS/MS experiments and by ion mobility coupled with MS showed the presence of several interaction sites on IB5 and conformational changes arising from the interaction.

Le rôle de la salive dans la perception sensorielle est de plus en plus reconnu, notamment par le biais des interactions physico-chimiques pouvant s’établir entre protéines salivaires et constituants alimentaires. Ce travail s’intéresse à la pellicule salivaire, la couche de protéines salivaires ancrées aux cellules épithéliales, et vise à caractériser les interactions pouvant s’établir d’une part entre ces protéines et épithélium oral, et d‘autre part entre ces protéines et les molécules de la flaveur. Pour cela, un modèle in vitro de muqueuse orale a été développé. Une lignée cellulaire stable (TR146/MUC1) a été obtenue par transfection de la lignée cellulaire TR146 de manière à exprimer la mucine membranaire MUC1. Afin de former une pellicule salivaire, les cellules confluentes ont été incubées avec de la salive humaine. La rétention des mucines salivaires MUC5B par les cellules TR146/MUC1 est augmentée par rapport aux TR146, apportant ainsi un argument en faveur de l’implication de MUC1 dans l’ancrage des MUC5B aux cellules épithéliales. Le modèle développé a été appliqué à l’étude des interactions entre la muqueuse orale et les molécules d’arôme et les tanins. L’analyse des coefficients de partage par GC-FID a mis en évidence 1- l’importance de l’hydratation de la muqueuse sur la libération des composés les plus hydrophiles, 2- la capacité des cellules à métaboliser certaines molécules d’arôme, 3- l’absence d’effet de la pellicule sur la libération des molécules d’arôme à l’équilibre. En revanche, l’analyse par PTR-MS a révélé un effet de la muqueuse et de la pellicule sur la cinétique de libération des molécules d’arôme. Les interactions entre les protéines de la pellicule salivaire et les tanins modifient les caractéristiques structurales de la pellicule, en particulier le tapissage des cellules par les MUC5B. Les possibles implications sensorielles, respectivement dans les phénomènes de persistance aromatique et d’astringence, sont discutées. / The role of saliva in food sensory perception is increasingly recognized, especially through physicochemical interactions occurring between salivary proteins and food components. This work focuses on the mucosal pellicle, a layer of salivary proteins anchored onto epithelial cells, and aims at characterizing interactions that may occur between the proteins of the mucosal pellicle and flavour compounds. For that purpose, an in vitro model of oral mucosa was developed. A stable cell line (TR146/MUC1) was obtaining by transfecting the TR146 cell line in order to express the membrane bound mucin MUC1. In order to form a salivary pellicle, confluent cells were incubated with human saliva. A higher retention of salivary MUC5B by TR146/MUC1 cells was observed compared to TR146 cells, emphasising the involvement of MUC1 in MUC5B anchoring to epithelial cells. The model was applied to the investigation of interactions between the oral mucosa and aroma molecules and tannins. Measurements of partition coefficients by GC-FID revealed 1- the role of hydration of the mucosa on the release of the most hydrophilic compounds, 2- the ability of cells to metabolize some aroma compounds, 3- the absence of effect of the mucosal pellicle itself on aroma release at the thermodynamic equilibrium. Oppositely, analyses by PTR-MS evidenced an effect of the mucosa and of the pellicle on aroma release kinetic. Interactions between proteins of the mucosal pellicle and tannins modified structural characteristics of the pellicle, especially the coating of cells by salivary MUC5B. Sensory relevance for the phenomena of aroma persistence and astringency, respectively, are discussed.