A doença de Machado-Joseph (DMJ/SCA3) é uma doença neurodegenerativa causada pela expansão de poliglutaminas na proteína ataxina-3. O número de repetições CAG presentes no gene ATXN3 é inversamente correlacionado com a idade de início da doença, mas é responsável por somente 45-60% desta variação. O objetivo deste trabalho foi testar o efeito da metilação no promotor do gene ATXN3, de polimorfismos em genes candidatos e do alelo normal ATXN3 como modificadores do fenótipo da doença. A análise do padrão de metilação em seis sítios CpG através de um ensaio de amplificação multiplex dependente de sondas – específico para metilação foi realizada em amostras de 123 pacientes de 62 famílias. Os polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) nos genes BAX, CRYAB, GRIK2, IL1B, ITPR1, NEDD8, NEDD9 e CHIP foram analisados em 273 pacientes de 119 famílias. Os volumes cerebrais foram medidos através de ressonância magnética em 30 pacientes não relacionados. A gravidade foi medida pela Escala de Exame Neurológico para Ataxia Espinocerebelar (NESSCA) dividida pelo tempo de duração da doença. Uma correlação inversa significativa foi encontrada entre a idade de início e tamanho da repetição (r=-0,76, r2=0,58, p<0,001). Houve uma tendência de correlação direta entre o grau de metilação e a idade de início para um sítio CpG (p=0,055). Uma correlação significativa foi encontrada entre a gravidade e o tamanho da repetição CAG (r=0,48, r2=0,23, p=0,001). O SNP no gene IL1B (rs16944) apresentou um efeito significativo na idade de início de pacientes com SCA3 (p=0,042). Associação significativa foi observada entre o SNP no gene NEDD9 (rs760678) e a gravidade (p=0,003). SNPs nos genes GRIK2 (rs2227281) e NEDD8 (rs2144487) se relacionaram à medida do volume do cerebelo (p=0,006) e à medida do volume da ponte (p=0,023), respectivamente. Estes resultados sugerem que o controle epigenético no sítio CpG no promotor ATXN3 e que os SNPs nos genes GRIK2, IL1B, NEDD8 e NEDD9 podem contribuir para a variação fenotípica na SCA3. Ademais, os genótipos protetores dos genes GRIK2, IL1B e NEDD8 mostraram ter um efeito aditivo no adiamento do início da doença. O mecanismo exato pelo qual a mutação no gene ATXN3 causa a SCA3 ainda não foi determinado. A expansão da repetição CAG pode conferir uma função tóxica para a proteína, como acontece em outras doenças neurodegenerativas causadas por expansões de poliglutaminas. Considerando esta hipótese, uma maior metilação do promotor do gene ATXN3 pode se relacionar a sua menor expressão e a um menor acúmulo de poliglutaminas no neurônio. Ainda considerando esta hipótese, GRIK2, IL1B, NEDD8 e NEDD9 podem desempenhar um papel protetor, possivelmente por promover a sobrevivência de células neuronais em pacientes com SCA3. SNPs nestes genes poderiam modificar a expressão das proteínas, afetando a agregação de poliglutaminas no cérebro de tal forma que os indivíduos portadores de um genótipo de risco teriam significativamente maior perda gradual de neurônios e um início mais precoce dos sintomas. / Machado-Joseph disease (MJD/SCA3) is a neurodegenerative disease caused by expansion of a polyglutamine tract in ataxin-3. The CAG repeat number of ATXN3 gene is inversely correlated with disease age at onset (AO) but is responsible for only 45-60% of this variation in SCA3. In this study, we investigate if DNA methylation status of the ATXN3 promoter, if polymorphisms in candidate genes, and if normal ATXN3 allele are related to disease phenotype. We designed a methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) assay for quantitative analysis of methylation status at 6 CpG sites, located within the promoter region of the ATXN3 gene. We have applied this MSMLPA to 123 SCA3 Brazilian patients from 62 families. We investigated single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in genes BAX, CRYAB, GRIK2, IL1B, ITPR1, NEDD8, NEDD9, and CHIP in 273 Brazilian SCA3 patients from 119 families. The brain volumetries were obtained from magnetic resonance imaging’s from 30 unrelated patients. The SCA3 severity degree was measured by Neurological Examination Score for Spinocerebellar Ataxia (NESSCA) divided by duration of disease. A significant inverse correlation was found between AO and repeat length (r=-0.76, r2=0.58, p<0.001). There was a trend toward direct correlation between methylation degree and AO for one CpG site in the SCA3 sample (p=0.055). A significant correlation was found between severity and CAG repeat length (r=0.483, r2=0.233, p=0.001). We have found significant associations between a GRIK2 SNP (rs2227281) and cerebellum volume (p=0.006), an IL1B SNP (rs16944) and AO (p=0.042), a NEDD8 SNP (rs2144487) and pons volume (p=0.023), and a NEDD9 SNP (rs760678) and disease severity (p=0.003). These results suggest that epigenetic control at ATXN3 CpG-site and that the SNPs in GRIK2, IL1B, NEDD8, and NEDD9 genes may contribute to the phenotypic expression of SCA3. Moreover, protective genotypes of GRIK2, IL1B, and NEDD8 genes shown to have an additive effect in delaying the onset of disease.The exact mechanism by which the mutation in the ATXN3 gene causes SCA3 has not been determined. The CAG repeat expansion may confer a novel toxic function onto the protein, as it does in other polyglutamine neurodegenerative disorders. Considering this hypothesis, increased methylation of ATXN3 gene promoter can relate to its lower expression and a smaller accumulation of polyglutamine in the neuron. Still considering this hypothesis, GRIK2, IL1B, NEDD8, and NEDD9 might play a protective role, possibly a survival promoting effect, for neuronal cells in SCA3 patients. These four SNPs could affect the protein expression and polyglutamine aggregation in the brain such that risk genotype carriers have a significantly higher gradual loss of neurons and an earlier onset of symptoms.

As ataxias espinocerebelares dominantes (SCAs), do inglês spinocerebellar ataxia, são um complexo grupo de doenças neurodegenerativas que afetam o cerebelo e suas principais conexões. O início das SCAs ocorre geralmente na vida adulta apresentando grande heterogeneidade clínica. Os sintomas normalmente aparecem da terceira a quarta década de vida com progressão lenta. Ao longo das gerações, os sintomas podem iniciar mais cedo com uma progressão mais severa, fenômeno chamado de antecipação. Este estudo teve como objetivos: (1) estabelecer protocolos não radioativos para detecção e caracterização de mutações dinâmicas nos genes da SCA1, SCA2, SCA6 e SCA7; (2) analisar pacientes com suspeita clínica de uma SCA; (3) determinar o tamanho da expansão trinucleotídica presente nos pacientes com resultado alterado na avaliação qualitativa, bem como o tamanho das repetições CAG nos alelos normais; (4) identificar outros portadores da mutação em questão entre os familiares do caso índice; (5) estudar um grupo de pacientes com MJD (Doença de Machado – Joseph), do inglês Machado – Joseph Disease, para os genes da SCA1, SCA2 e SCA6, analisando-os como possíveis genes modificadores e (6) estudar a freqüência e as características moleculares, clínicas e epidemiológicas das SCAs tipos 1, 2, 3, 6, 7, 10, 17 e DRPLA (atrofia dentato-rubro-pallidoluysiana ) em famílias do sul do Brasil. Neste estudo, eficientes protocolos não radioativos foram estabelecidos para verificar alelos normais e alelos expandidos nos loci associados à SCA1, SCA2, SCA6 e SCA7. Foram detectados casos positivos para as quatro SCAs estudadas. Nossos resultados confirmam a hipótese de que casos de outras SCAs, além de MJD, a ataxia mais freqüente em nossa região, ocorrem em nossa população. Em pacientes com SCA2, uma correlação inversa entre idade de início da doença e o tamanho da repetição CAG de cada paciente caracterizou o fenômeno da antecipação. Não houve correlação significativa entre o tamanho das repetições CAG nos genes SCA1, SCA2 and SCA6 e o fenótipo observado em pacientes com Machado-Joseph. Entre as SCAs, a MJD é a mais freqüente entre os pacientes brasileiros, sendo que, após esse estudo, poucas famílias permaneceram sem diagnóstico de uma SCA específica. Algumas correlações clínicas foram observadas; associação de SCA7 com uma maior antecipação, achados piramidais e atrofia óptica, e a associação de SCA6 com ataxia mais severa de membros. / Autosomal dominant spinocerebellar ataxias (SCAs) are a complex group of neurodegenerative diseases that affect the cerebellum and main connections. Onset of SCAs is generally in the adult life and shows great clinical heterogeneity. Symptoms normally appear from third to fourth decade of live and progress slowly. In successive generations, symptoms can initiate earlier with a more severe progression, a phenomenon called anticipation. The present study aimed: (1) the establishment of non-radioactives molecular protocols for detection and characterization of dinamic mutations in SCA1, SCA2, SCA6, and SCA7 genes; (2) to analyse patients who show sign and/or symptoms of a SCA; (3) to determine the trinucleotide expansion length in positive patients, and CAG repeats length in normal alleles; (4) the identification of other individuals carrying mutations within families of affected patients; (5) to establish a possible correlation between CAG expansions in SCA1, SCA2, and SCA6 genes and phenotype in MJD (Machado-Joseph disease) patients, and (6) to determine the frequency, clinical, epidemiological, and molecular features of SCA1, SCA2, SCA3, SCA6, SCA7, SCA10, SCA17, and DRPLA (dentato-rubro-pallido-luysiana atrophy) among SCA families of Southern Brazil. In this study, efficient non-radioactive protocols were established to verify normal and expanded alleles in loci associated to SCA1, SCA2, SCA6, and SCA7. We detected positive cases for four SCAs. Our results confirm the hypothesis that other SCAs, in addition to MJD, the most frequent ataxia in our region, occur in our population. In SCA2 patients, an inverse correlation between age of onset and CAG repeat length of each patient characterized the phenomenon of anticipation. There was no significative correlation between CAG repeats length in SCA1, SCA2, and SCA6 genes and phenotype observed in Machado-Joseph patients. MJD is the most frequent SCA among Brazilians. Relatively few SCA families remain undiagnosed in our population. Some clinical correlations were observed; association of SCA7 with more severe anticipation, pyramidal findings and optic atrophy, and the association of SCA6 with a more severe limb ataxia.

A ataxia espinocerebelar tipo 10 (SCA10) é uma doença neurodegenerativa rara de herança autossômica dominante caracterizada por atrofia cerebelar com alterações da marcha e, em alguns casos, convulsões. A SCA10 é causada por expansões de repetições pentanucleotídicas ATTCT no íntron 9 do gene ATXN10, o qual se localiza no locus 22q13. Alelos normais apresentam entre 10 a 29 repetições e o alelo patogênico apresenta entre 800 a 4.500 repetições. Até o momento, casos de SCA10 foram descritos apenas em pacientes miscigenados de países do continente americano como México, Brasil, Argentina, Venezuela, Colômbia, Estados Unidos e, mais recentemente, Peru. A origem ameríndia auto declarada pelos pacientes com SCA10 e a ausência de casos em países europeus e asiáticos indicam a hipótese de ocorrência de um efeito fundador da mutação nas populações nativas americanas. O objetivo deste trabalho foi investigar a hipótese de origem ancestral comum da mutação no gene ATXN10. As amostras analisadas foram proveniente de 16 famílias brasileiras e de 21 famílias peruanas com SCA10. Além do grupo de pacientes, um grupo controle composto por 48 indivíduos saudáveis da população indígena Quechua do Peru foi também incluída na análise assim como 51 controles brasileiros de um estudo anterior. Os resultados obtidos mostraram que o haplótipo 19CGGC14 associado ao alelo da expansão está presente em 46,8% das famílias de brasileiros e 62,8% das famílias de peruanos. As frequências de ambos os grupos não é estatisticamente diferente dos controles Quechua (57,3%), sendo diferente dos controles brasileiros (11,8%) (p<0,001). Entretanto, origem etnogeográfica da mutação ainda é desconhecida. O haplótipo comum mínimo foi expandido incluindo outros dois marcadores polimórficos, os quais integram dois haplótipos com alta prevalência em populações nativo americanas com o intuito de obter uma aproximação da origem da região cromossômica onde a mutação está inserida. Dois haplótipos mais frequentes 19-13-CGGC-14-10 e 19- 15-CGGC-14-10 foram identificados nos controles indígenas Quechua, com frequências relativas de 14,3% e 13,3% respectivamente. O segundo haplótipo mais frequente em Quechuas, 19-15-CGGC-14-10, é encontrado em 50,0% das famílias brasileiras e em 64,7% das famílias Peruanas com SCA10. Esses achados corroboram a hipótese de origem ameríndia da mutação. / Spinocerebellar ataxia type 10 is a rare autosomal dominant neurodegenerative disorder characterized by progressive cerebellar ataxia and epilepsy in some cases. The disease is caused by a pentanucleotide ATTCT expansion in intron 9 of the ATXN10 gene, which is located at locus 22q13.3. Normal alleles range from 10 to 29 repeats while mutant allele range from 800 to 4,500 repeats. SCA10 has only been described so far in admixed patients from American countries such as Mexico, Brazil, Argentina, Venezuela, Colombia, United States and more recently Peru. The self-declared Amerindian ancestry by patients and the absence of SCA10 in European and Asian countries leads to the hypothesis of a mutation founder effect in the Native American populations. The aim of this study was to investigate the hypothesis of a common ancestral origin of ATXN10 mutation. Samples analyzed were from 16 Brazilian families, 21 Peruvian families with SCA10. In addition to patient samples, 48 healthy individuals of Indigenous Quechua from Peru were also included in the laboratorial analyses along with 51 Brazilian controls from a previous study. Our data has shown that 19CGGC14-shared haplotype was found in 46.8% of Brazilian and in 62.8% of Peruvian families. Frequencies from both groups are not statistically different from Quechua controls (57.3%), but they are statistically different from Brazilian controls (11.8%) (p<0.001). However, the mutation ethno-geographical origin remains unclear. The minimal common haplotype was expanded by including two additional polymorphic markers that are found at high prevalence in two haplotypes in Native American populations aiming to shed light on the chromosome region ancestry where the mutation arose. Two frequent haplotypes, 19-13-CGGC-14-10 and 19-15- CGGC-14-10 were identified in Indigenous Quechua controls, with relative frequencies of 14.3% and 13.3% respectively. The second most frequent haplotype in Quechuas, 19-15- CGGC-14-10, is found in 50.0% of Brazilian and in 64.7% of Peruvian families with SCA10. These findings corroborate the hypothesis of a Native American ancestry of the mutation.

A ataxia espinocerebelar tipo 2 (SCA2) é causada por uma expansão em uma sequência repetitiva de códons CAG (CAGexp) no exon 1 do gene ATXN2. O trato expandido de poliglutaminas está associado a um ganho de função tóxica, expressa predominantemente em neurônios. A SCA2 é uma condição neurodegenerativa autossômica dominante, com início, em média, entre os 30 e os 40 anos, manifesta-se por distúrbios neurológicos progressivos que levam os afetados à cadeira de rodas e à sobrevida reduzida. Embora propensa a forças seletivas negativas como a antecipação, a freqüência da SCA2 parece ser estável nas populações onde foi observada, sugerindo a existência de mecanismos seletivos favoráveis simultâneos. Para averiguar essa hipótese, o presente estudo estimou o fitness, a segregação e o papel da antecipação em uma coorte de famílias com diagnóstico molecular de SCA2. Dados de famílias com diagnóstico molecular realizado no Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas e armazenados em banco de dados de acesso restrito aos investigadores serviram de base para identificar a população em estudo. Entre 2016 e 2017, sujeitos adultos e pertencentes a essas famílias foram convidados a participar desse estudo. Após apresentarem seu consentimento informado, esses sujeitos forneceram dados sobre todos os seus parentes ligados ao ramo familiar onde a SCA2 segregou, permitindo a construção de heredogramas completos. Os dados de ao menos dois informantes por família deveriam ser convergentes para serem estudados. As variáveis em estudo foram obtidas de todos os sujeitos: data de nascimento, sexo, relações de parentesco, ordem de nascimento, status sintomático e número de filhos. A data defalecimento e a idade de início do primeiro sintoma foram anotadas, quando adequado. O fitness genético (ou o sucesso reprodutivo) dos portadores de SCA2 foi considerado igual a w= W afetados /W não afetados, onde W corresponde à mediana do número de filhos do grupo. Como o genótipo não estava disponível para a maioria dos membros das famílias SCA2, o fenótipo foi usado para classificar os sujeitos como afetados ou não afetados. Para reduzir os efeitos de potenciais vieses de memória e de aferição, dois critérios de inclusão foram utilizados: (1) ser mais velho do que um desvio-padrão acima da média da idade de início dos sintomas do grupo total; e (2) existir a informação completa da história reprodutiva tanto o sujeito como do seu genitor transmissor. A análise de segregação comparou o número de irmãos afetados com o dos não afetados; como critério de inclusão, novamente todos os irmãos estudados deveriam ser mais velhos do que um desvio padrão da média de idade de início da coorte completa. Vinte e uma das trinta e uma famílias com diagnóstico de SCA2 foram recuperadas: os sujeitos de uma família negaram-se a participar do estudo, enquanto as demais dez famílias foram perdidas do follow-up. Os heredogramas estudados incluíram 1.017 pessoas, 164 das quais sintomáticas – e 84 delas ainda vivas. Como a idade de início média foi de 36.6 (14.9) anos, sujeitos afetados e não afetados com mais de 52 anos de idade foram utilizados para estimar padrões de fitness e segregação. Sessenta e sete sujeitos afetados e 97 sujeitos não afetados foram incluídos na análise do fitness e tiveram a mediana de 3 e 2 filhos respectivamente, o que resultou em um fitness genético igual a 1,5 (p <0,025) . Finalmente, o fitness variou de acordo com a idade de início dos sujeitos, tornando-se menor do que o fitness dos sujeitos não afetados quando a idade de início dos sintomas era menor ou igual a 20 anos de idade. 9 Entre os sujeitos incluídos na análise de segregação, havia 137 não-afetados (59,6%) e 93 afetados (40,4%) e essa proporção foi significativamente diferente da esperada em uma segregação randômica de alelos (p = 0,04). A idade de início foi inversamente proporcional ao tamanho do CAGexp em 49 indivíduos onde a informação molecular estava disponível (rho= -0.708, p< 0.0001, Spearman); cada repetição CAG adicional associou-se a uma redução de 1,57 anos na idade de início (p<0.003). A diferença média entre a idade de início dos sujeitos e a de seus genitores afetados foi de -10.77 anos, ou seja, a idade no início das gerações apontou para a antecipação como um fenômeno bastante frequente. Portanto, nossos resultados apontaram que três forças seletivas podem afetar a recorrência da SCA2. A SCA2 teve um fitness genético aumentado nos portadores com idades de início medianas ou tardias. Em contraste, nós observamos uma distorção na segregação ou favorecendo os gametas com alelos normais – em mais de 95% das vezes, portadores de alelos com 22 repetições (CAG)22 – ou desfavorecendo os gametas com alelos expandidos. Nosso resultado, inclusive, sugere que a alta frequência do alelo (CAG)22 nos cromossomos humanos seja explicada por essa vantagem seletiva. Por fim, nossos dados sugerem que a antecipação é a ocorrência mais frequente nas transmissões entre afetados na comparação entre as idades de início nas gerações subsequentes. Essa última observação propõe que a transmissão do CAGexp instável tende a expandi-lo ainda mais; isso precisa ser confirmado pela observação de irmandades completamente genotipadas, em futuros estudos. Se ela se confirmar, a tendência à antecipação deverá se associar a um fitness reduzido nesses afetados. Em conclusão, deduzimos que embora o fitness dos afetados com idades de início médias seja maior do que a dos não afetados, a frequência da SCA2 não está aumentando na população, pois outras forças seletivas agem 10 em sentido contrário (seleção negativa): a segregação distorcida e que favorece a transmissão do alelo normal e a tendência à antecipação. / Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is caused by an expansion in a repetitive sequence of CAG codons (CAGexp) in exon 1 of the ATXN2 gene. The expanded polyglutamine tract is associated with a gain in toxic function, expressed predominantly in neurons. SCA2 is an autosomal dominant neurodegenerative condition, with onset between 30 and 40 years of age, manifestations due to progressive neurological disorders that lead to those affected in the wheelchair and reduced survival. Despite being a community of companies, as an anticipation, a frequency of SCA2, which is a place for the communities where it was observed, suggesting the existence of simultaneous favorable selective mechanisms. To ascertain this hypothesis, the present study, fitness estimate, a segregation and role of anticipation in a cohort of families with molecular diagnosis of SCA2. Data from families with molecular diagnoses performed at the Medical Genetics Service of the Hospital de Clínicas and stored in databases of restricted access to the researchers served as a basis to identify the population under study. Between 2016 and 2017, adult subjects belonging to these families were invited to participate in this study. After presenting their informed consent, these subjects provided data on all their relatives related to the family branch where the SCA2 segregated, allowing the construction of complete heredograms. Data from at least two informants per family should be convergent to be studied. The study variables were obtained from all subjects: date of birth, gender, relationship, birth order, symptomatic status and number of children. The date of death and the age of onset of the first symptom were noted where appropriate. The genetic fitness (or reproductive success) of patients with SCA2 was considered equal to w = W affected / W unaffected, where W was the median number of children in the group. 12 As the genotype was not available for most members of the SCA2 families, the phenotype was used to classify the subjects as affected or unaffected. To reduce the effects of potential memory and bias biases, two inclusion criteria were used: (1) to be older than a standard deviation above the mean age of symptom onset of the total group; and (2) there is complete information on the reproductive history of both the subject and the transmitting parent. The segregation analysis compared the number of siblings affected with that of the unaffected; as inclusion criterion, again all siblings studied should be older than a standard deviation from the mean age of complete cohort start age. Twenty-one of the 31 families diagnosed with SCA2 were recovered: subjects from one family refused to participate in the study, while the remaining 9 families were lost from follow-up. The heredograms studied included 1,017 people, 164 of whom were symptomatic - and 84 of them were still alive. As the mean age at onset was 36.6 (14.9) years, affected and unaffected subjects over 52 years of age were used to estimate fitness and segregation patterns. Sixty-seven affected subjects and 97 unaffected subjects were included in the fitness analysis and had a median of 3 and 2 children respectively, which resulted in a genetic fitness equal to 1.5 (p <0.025). The vast majority of affected children were born before the onset of symptoms of these parents. Finally, the fitness varied according to the age of onset of subjects, becoming smaller than the fitness of the unaffected subjects when the age of onset of symptoms was less than or equal to 20 years of age. Among the subjects included in the segregation analysis, there were 137 unaffected (59.6%) and 93 affected (40.4%), and this proportion was significantly different from that expected in a random segregation of alleles (p = 0.04 ). The age of onset was inversely proportional to the size of CAGexp in 49 individuals where molecular information was available (rho = -0.708, p <0.0001, 13 Spearman); each additional CAG repeat was associated with a reduction of 1.57 years at the onset age (p <0.003). The mean difference between the age of onset of the subjects and that of their affected parents was -10.77 years: that is, the age at the beginning of the generations pointed to the anticipation as a frequent phenomenon. Therefore, our results indicated that three selective forces may affect the recurrence of SCA2. SCA2 had an increased genetic fitness in patients with median or late onset ages. In contrast, we observed a distortion in segregation or favoring gametes with normal alleles - more than 95% of the time, with alleles with 22 replicates (CAG) 22 - or disfavoring the gametes with expanded alleles. Our result even suggests that high frequency of the allele (CAG) 22 on human chromosomes is explained by this selective advantage. Finally, our data suggest that anticipation is the most frequent occurrence in transmissions between affected, in the comparison between the ages of onset in subsequent generations. This last observation proposes that the transmission of unstable CAGexp tends to expand it further; this needs to be confirmed by the observation of completely genotyped brotherhoods in future studies. If it is confirmed, the tendency to anticipate should be associated with a reduced fitness in this affected. In conclusion, although the fitness of the affected individuals with the mean onset ages is increased, the frequency of ACS2 is not increasing in the population because other selective forces act in the opposite direction (negative selection): distorted segregation and favors the transmission of the allele normal and the tendency to anticipate.

Resumo não disponível.

As ataxias espinocerebelares (SCAs) são doenças neurodegenerativas com herança autossômica dominante que apresentam grande heterogeneidade clínica e genética. O diagnóstico é realizado pela detecção da mutação no gene causador, que, na sua maioria, é uma expansão de repetições trinucleotídicas CAG. O objetivo deste estudo foi analisar os polimorfismos de repetições trinucleotídicas nos genes associados as SCAs tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 6 através de PCR-multiplex e eletroforese capilar, visando a melhoria do diagnóstico molecular e a determinação da distribuição das regiões polimórficas nos alelos normais. As análises foram realizadas em 124 pacientes não-aparentados que apresentavam sintomas de ataxia. Nessa amostra, foram identificados 10 pacientes com SCA2, 39 pacientes com SCA3 e 2 pacientes com SCA6. Não encontramos amostras com uma expansão CAG no gene SCA1. Os polimorfismos de cada loci foram estudados nos cromossomos normais desses pacientes (n=209-248). A freqüência dos alelos normais grandes no locus SCA1 (>32 repetições CAG) foi estabelecida em 0,05 e no locus SCA2 (>22 repetições CAG) foi 0,11, enquanto que no locus SCA3 (alelos >28 repetições) a freqüência foi 0,11. A freqüência de alelos normais grandes para o locus SCA6 (>13 repetições) foi 0,04. Concluindo, este estudo proporcionou a primeira análise detalhada da distribuição de repetições CAG nos loci SCA1, SCA2, SCA3 e SCA6 por amplificação multiplex e eletroforese capilar em pacientes brasileiros. A freqüência dos alelos normais grandes nos genes SCA3 e SCA6 nessa amostra reflete a prevalência destas duas doenças na nossa população, concordando com a hipótese que alelos patogênicos podem ser originados pela expansão de alelos normais grandes. / Spinocerebellar ataxias (SCAs) are neurodegenerative disorders inherited as an autosomal dominant trait that present large genetic and clinical heterogeneity. An accurate diagnosis relies on mutation detection in a specific causative gene, which is typically an abnormal number of CAG trinucleotide repeats. The aim of this study was to analyze polymorphic regions of trinucleotide repeats in SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 associated genes through multiplex PCR and capillary electrophoresis, aiming the improvement of molecular diagnosis and distribution of CAG repeats number in normal alleles. Analyses were carried out in 124 unrelated Brazilian patients who presented symptoms of progressive ataxia. To date, we identified 10 patients with SCA2, 39 patients with SCA3, and 2 patients with SCA6. No alleles were identified with a CAG expansion tract in the SCA1 gene. Normal CAG repeats length range was established using data from normal chromosomes (n=209-248). Frequency of large normal alleles in SCA1 locus (>32 CAG repeats) was determined to be 0.05. Frequency of large normal alleles at the SCA2 locus (>22 CAG repeats) was shown to be 0.11 while at the SCA3 locus (>28 CAG repeats) frequency of large normal alleles was 0.11. At the SCA6 locus, frequency of large normal alleles (>13 CAG repeats) was found to be 0.04. Moreover, this study provides the first detailed analysis, to our knowledge, of the distribution of CAG repeats at the SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 loci by multiplex-PCR and automated capillary electrophoresis in Brazilian patients. Frequency of large normal alleles in SCA3 and SCA6 genes established in this sample reflects the prevalence of these two diseases in our population, supporting the hypothesis that disease alleles emerge from expansion of large normal alleles.

As ataxias espinocerebelares (SCAs) são doenças neurodegenerativas com herança autossômica dominante que apresentam grande heterogeneidade clínica e genética. O diagnóstico é realizado pela detecção da mutação no gene causador, que, na sua maioria, é uma expansão de repetições trinucleotídicas CAG. O objetivo deste estudo foi analisar os polimorfismos de repetições trinucleotídicas nos genes associados as SCAs tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 6 através de PCR-multiplex e eletroforese capilar, visando a melhoria do diagnóstico molecular e a determinação da distribuição das regiões polimórficas nos alelos normais. As análises foram realizadas em 124 pacientes não-aparentados que apresentavam sintomas de ataxia. Nessa amostra, foram identificados 10 pacientes com SCA2, 39 pacientes com SCA3 e 2 pacientes com SCA6. Não encontramos amostras com uma expansão CAG no gene SCA1. Os polimorfismos de cada loci foram estudados nos cromossomos normais desses pacientes (n=209-248). A freqüência dos alelos normais grandes no locus SCA1 (>32 repetições CAG) foi estabelecida em 0,05 e no locus SCA2 (>22 repetições CAG) foi 0,11, enquanto que no locus SCA3 (alelos >28 repetições) a freqüência foi 0,11. A freqüência de alelos normais grandes para o locus SCA6 (>13 repetições) foi 0,04. Concluindo, este estudo proporcionou a primeira análise detalhada da distribuição de repetições CAG nos loci SCA1, SCA2, SCA3 e SCA6 por amplificação multiplex e eletroforese capilar em pacientes brasileiros. A freqüência dos alelos normais grandes nos genes SCA3 e SCA6 nessa amostra reflete a prevalência destas duas doenças na nossa população, concordando com a hipótese que alelos patogênicos podem ser originados pela expansão de alelos normais grandes. / Spinocerebellar ataxias (SCAs) are neurodegenerative disorders inherited as an autosomal dominant trait that present large genetic and clinical heterogeneity. An accurate diagnosis relies on mutation detection in a specific causative gene, which is typically an abnormal number of CAG trinucleotide repeats. The aim of this study was to analyze polymorphic regions of trinucleotide repeats in SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 associated genes through multiplex PCR and capillary electrophoresis, aiming the improvement of molecular diagnosis and distribution of CAG repeats number in normal alleles. Analyses were carried out in 124 unrelated Brazilian patients who presented symptoms of progressive ataxia. To date, we identified 10 patients with SCA2, 39 patients with SCA3, and 2 patients with SCA6. No alleles were identified with a CAG expansion tract in the SCA1 gene. Normal CAG repeats length range was established using data from normal chromosomes (n=209-248). Frequency of large normal alleles in SCA1 locus (>32 CAG repeats) was determined to be 0.05. Frequency of large normal alleles at the SCA2 locus (>22 CAG repeats) was shown to be 0.11 while at the SCA3 locus (>28 CAG repeats) frequency of large normal alleles was 0.11. At the SCA6 locus, frequency of large normal alleles (>13 CAG repeats) was found to be 0.04. Moreover, this study provides the first detailed analysis, to our knowledge, of the distribution of CAG repeats at the SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 loci by multiplex-PCR and automated capillary electrophoresis in Brazilian patients. Frequency of large normal alleles in SCA3 and SCA6 genes established in this sample reflects the prevalence of these two diseases in our population, supporting the hypothesis that disease alleles emerge from expansion of large normal alleles.

Resumo não disponível.

A doença de Machado-Joseph (MJD – Machado-Joseph disease), também conhecida como ataxia espinocerebelar tipo 3 (SCA3 – spinocerebellar ataxia type 3), é uma doença neurodegenerativa, com padrão de herança autossômica dominante, causada por uma expansão do trato de repetições CAG no gene ATXN3. Estudos prévios mostram que a idade de início (ii) da doença apresenta uma correlação inversa ao número de repetições CAG no alelo expandido, mas que somente entre 40 e 68% da variação da ii pode ser explicado pelo tamanho da expansão. Considerando que um mecanismo molecular comum para todas as doenças neurodegenerativas foi proposto anteriormente, o restante da variação da correlação pode estar associado ao mecanismo molecular de outras doenças. Expansão da repetição hexanucleotídica (GGGGCC ou G4C2) no gene C9orf72 foi identificado como a etiologia em uma proporção significante dos pacientes de esclerose lateral amiotrófica (ALS – amyotrophic lateral sclerosis), demência frontotemporal (FTD – frontotemporal dementia) e os afetados da comorbidade ALS-FTD. O presente estudo teve como objetivo investigar o tamanho do trato de hexanucleotídeo no gene C9orf72 em pacientes com MJD/SCA3 como um potencial modificador de ii. A genotipagem dos alelos do C9orf72 foi realizada por PCR com primers fluorescentes, seguida de eletroforese capilar, e avaliada no grupo teste e no grupo controle. Foram genotipados 83 pacientes com MJD/SCA3 e 102 controles saudáveis sem história de ataxia. Todos os pacientes e controles foram recrutados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. A expansão patogênica do C9orf72 foi definida como trato contendo mais de 30 repetições hexanucleotídicas. Os indivíduos foram divididos em duas categorias para fins de análises estatísticas: grupo 1) indivíduos com ambos alelos contendo até 6 repetições, inclusive (alelo “pequeno”) e grupo 2) os indivíduos com pelo menos um alelo de 7 até 30 repetições, inclusive (alelo “intermediário”). Nenhum indivíduo com expansão patogênica foi detectado. A frequência alélica de G4C2 foi estabelecida e nenhuma diferença foi observada entre elas. Além disso, não foi encontrada correlação do tamanho do alelo com pacientes de ii precoce e nem com os pacientes de ii tardia. Portanto, nossos resultados indicam que o tamanho do alelo do C9orf72 não atua como fator modificador da idade de início da doença em pacientes com MJD/SCA3. / Machado-Joseph disease (MJD), also known as spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3) is a neurodegenerative disorder of an autosomal dominant trait caused by an expansion of a CAG repeat tract in the ATXN3 gene. Previous studies show that age of onset (AO) of the disease is inversely correlated with CAG repeat length in the expanded allele that can explain from 40 to 68% of variation in AO. Considering that a common molecular mechanism for all neurodegenerative diseases has been previously suggested, the key to describing this variation could lie in the molecular biology of other diseases. Hexanucleotide repeat (GGGGCC or G4C2) expansions in C9orf72 were identified as the etiology in a significant portion of patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS), patients with frontotemporal dementia (FTD), and those affected by comorbid ALS-FTD. Taking this into consideration, our aim was to investigate C9orf72 hexanucleotide tract length in MJD/SCA3 patients as a potential modifier of AO. After establishing a reliable protocol to genotype C9orf72 alleles using PCR with fluorescent primers followed by capillary electrophoresis, 83 MJD/SCA patients and 102 healthy controls with no history of ataxia were genotyped. All individuals were recruited from the Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Pathogenic expansions were defined as alleles containing more than 30 hexanucleotide repeats. Individuals were divided into two categories for statistical analysis: group 1) those with both alleles containing up to 6 repeats (“small” alleles) and group 2) those with one or both alleles of 7 up to 30 repeats (“intermediate” alleles). No pathogenic expansions were detected. Allelic distribution was established, and no difference was observed between groups. In addition, neither early-onset nor late-onset MJD/SCA3 patients have shown to be correlated with neither the small nor the intermediary C9orf72 genotype so far. Therefore, results obtained in this study indicate that C9orf72 allele length is not a modifier of age of onset in MJD/SCA3 patients.

As ataxias espinocerebelares (SCAs) são doenças neurodegenerativas com herança autossômica dominante que apresentam grande heterogeneidade clínica e genética. O diagnóstico é realizado pela detecção da mutação no gene causador, que, na sua maioria, é uma expansão de repetições trinucleotídicas CAG. O objetivo deste estudo foi analisar os polimorfismos de repetições trinucleotídicas nos genes associados as SCAs tipo 1, tipo 2, tipo 3 e tipo 6 através de PCR-multiplex e eletroforese capilar, visando a melhoria do diagnóstico molecular e a determinação da distribuição das regiões polimórficas nos alelos normais. As análises foram realizadas em 124 pacientes não-aparentados que apresentavam sintomas de ataxia. Nessa amostra, foram identificados 10 pacientes com SCA2, 39 pacientes com SCA3 e 2 pacientes com SCA6. Não encontramos amostras com uma expansão CAG no gene SCA1. Os polimorfismos de cada loci foram estudados nos cromossomos normais desses pacientes (n=209-248). A freqüência dos alelos normais grandes no locus SCA1 (>32 repetições CAG) foi estabelecida em 0,05 e no locus SCA2 (>22 repetições CAG) foi 0,11, enquanto que no locus SCA3 (alelos >28 repetições) a freqüência foi 0,11. A freqüência de alelos normais grandes para o locus SCA6 (>13 repetições) foi 0,04. Concluindo, este estudo proporcionou a primeira análise detalhada da distribuição de repetições CAG nos loci SCA1, SCA2, SCA3 e SCA6 por amplificação multiplex e eletroforese capilar em pacientes brasileiros. A freqüência dos alelos normais grandes nos genes SCA3 e SCA6 nessa amostra reflete a prevalência destas duas doenças na nossa população, concordando com a hipótese que alelos patogênicos podem ser originados pela expansão de alelos normais grandes. / Spinocerebellar ataxias (SCAs) are neurodegenerative disorders inherited as an autosomal dominant trait that present large genetic and clinical heterogeneity. An accurate diagnosis relies on mutation detection in a specific causative gene, which is typically an abnormal number of CAG trinucleotide repeats. The aim of this study was to analyze polymorphic regions of trinucleotide repeats in SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 associated genes through multiplex PCR and capillary electrophoresis, aiming the improvement of molecular diagnosis and distribution of CAG repeats number in normal alleles. Analyses were carried out in 124 unrelated Brazilian patients who presented symptoms of progressive ataxia. To date, we identified 10 patients with SCA2, 39 patients with SCA3, and 2 patients with SCA6. No alleles were identified with a CAG expansion tract in the SCA1 gene. Normal CAG repeats length range was established using data from normal chromosomes (n=209-248). Frequency of large normal alleles in SCA1 locus (>32 CAG repeats) was determined to be 0.05. Frequency of large normal alleles at the SCA2 locus (>22 CAG repeats) was shown to be 0.11 while at the SCA3 locus (>28 CAG repeats) frequency of large normal alleles was 0.11. At the SCA6 locus, frequency of large normal alleles (>13 CAG repeats) was found to be 0.04. Moreover, this study provides the first detailed analysis, to our knowledge, of the distribution of CAG repeats at the SCA1, SCA2, SCA3, and SCA6 loci by multiplex-PCR and automated capillary electrophoresis in Brazilian patients. Frequency of large normal alleles in SCA3 and SCA6 genes established in this sample reflects the prevalence of these two diseases in our population, supporting the hypothesis that disease alleles emerge from expansion of large normal alleles.