Neurogene Entzündung ist charakterisiert durch Vasodilatation, Plasmaextravasation und Leukozytenmigration. Im Zuge dieser Dissertationsarbeit konnte ein in vivo Versuchsmodell zur Quantifizierung neurogener Entzündungsreaktionen in den Atemwegen etabliert werden. Der bakterielle Bitterstoff Cycloheximid ist in der Lage, eine Erhöhung der Plasmaextravasation und Migration neutrophiler Granulozyten zu bewirken. Somit kann Cycloheximid nicht nur protektive Schutzreflexe auslösen, sondern führt auch lokal zu einer neurogenen Entzündungsreaktion. Das carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1) ist an der Regulierung der endothelialen Barrierefunktion beteiligt. Die Versuche zeigen bei CC1-/--Mäusen eine Verminderung der basalen Permeabilität in trachealen postkapillären Venolen. Nach Stimulation mit Cycloheximid zeigen CC1-/--Mäuse im Vergleich mit WT-Mäusen eine verminderte Plasmaextravasation in bronchialen postkapillären Venolen. Auch die Permeabilität des Endothels für neutrophile Granulozyten scheint durch CEACAM1-Defizienz in trachealen und bronchialen Venolen herabgesetzt zu werden. Die Anwesenheit des CEACAM1-Moleküls verursacht offenbar eine verminderte Stabilität der endothelialen Barriere in postkapillären Venolen der Atemwege. Diese Ergebnisse zeigen eine gegenteilige Funktion von CEACAM1 in postkapillären Venolen der Atemwege im Vergleich mit großen, herznahen Blutgefäßen. Des Weiteren scheint sich die Rolle von CEACAM1 in der Entstehung von akuten und chronischen Entzündungsreaktionen zu unterscheiden. Das in dieser Arbeit etablierte Versuchsmodell stellt eine Möglichkeit dar, neurogene Entzündungsreaktionen als Reaktion auf verschiedene gustatorische Stimulanzien zu testen und zu quantifizieren. / Neurogenic inflammation is characterized by vasodilatation, plasma extravasation and leukocyte recruitment. This thesis presents an in vivo model for quantification of neurogenic inflammatory reactions in the airways. Application of the bacterial bitter substance Cycloheximide results in an increased plasma extravasation and migration of neutrophil granulocytes. Cycloheximide not only triggers protective reflexes as it has been previously shown but it also causes local neurogenic inflammatory responses. The carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule-1 (CEACAM1) is known to regulate endothelial barrier function. Experiments show a decrease in basal vascular permeability in CEACAM1 knock-out mice (CC1-/-) in tracheal postcapillary venules. After stimulation with Cycloheximide CC1-/--mice exhibit a decreased plasma extravasation in bronchial postcapillary venules compared to wild-type mice. The permeability of the endothelium to neutrophil granulocytes is also decreased in tracheal and bronchial postcapillary venules of CC1-/--mice. Expression of the CEACAM1 molecule leads to a reduced stability of the endothelial barrier in postcapillary venules of the respiratory tract. These results show an opposite function of CEACAM1 in postcapillary airway venules compared to larger vessels. Furthermore, the role of CEACAM1 appears to be different in the development of acute and chronic inflammatory reactions. The established in vivo model offers a possibility to quantify neurogenic inflammation in response to various gustatory stimuli.

Respiratory infections are a significant health concern worldwide, and the airway epithelium plays a crucial role in regulating airway function and modulating inflammatory processes. However, most studies on respiratory infections have used cell lines or animal models, which may not accurately reflect native physiological conditions, especially regarding human pathogens. We generated human nasal mucosa (hNM) and tracheobronchial mucosa (hTM) models to address this issue using primary human airway epithelial cells and fibroblasts. We characterised these human airway tissue models (hAM) using high speed video microscopy, single cell RNA sequencing, immunofluorescence staining, and ultrastructural analyses that revealed their complexity and cellular heterogeneity. We demonstrated that Bordetella pertussis virulence factor adenylate cyclase toxin (CyaA) elevated the intracellular production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and secretion of interleukin (IL) 6, IL 8, and human beta defensin 2 (HBD2). In addition, we compared the responses of the tissue models from two different anatomical sites (the upper and lower respiratory mucosa) and are the first to report such differential susceptibility towards CyaA using 3D primary airway cell derivedmodels. The effect of toxin treatment on the epithelial barrier integrity of the tissue models was assessed by measuring the flux of fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated dextran across the models. Though we observed a cell type specific response with respect to intracellular cAMP production and IL 6, IL 8, and HBD2 secretion in the models treated with CyaA on the apical side, the epithelial membrane barrier integrity was not compromised. In addition to toxin studies, using these characterised models, we established viral infection studies for Influenza A (IAV), Respiratory Syncytial Virus subtype B (RSV), and severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. We visualised the morphological consequences of the viral infection using ultrastructural analysis and immunofluorescence. We verified the effective infection in hAM by measuring the viral RNA using RTqPCR and detected elevated cytokine levels in response to infection using biochemical assays. In contrast to cell lines, studies on viral infection using hAM demonstrated that infected areas were localized to specific regions. This led to the formation of infection hotspots, which were more likely to occur when models derived from different donors were infected separately with all three viruses. IAV infected tissue models replicate the clinical findings of H1N1 infection, such as mucus hypersecretion, cytokine release, and infection-associated epithelial cell damage.Finally, we paved the steps towards understanding the impact of IAV infection on disease models. We generated hTM from biopsies obtained from chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients. As a model to study the impact of COPD on respiratory infections, considering the increase in COPD cases in the past decade and the continued predicted increase in the future. We established the IAV infection protocol to capture the early infection signatures in non-COPD and COPD conditions using scRNA-seq. We investigated the infection kinetics of IAV (H1N1-clinical isolate) in hTM and found that viruses were actively released approximately 24 hours post infection. The scRNA-seq data from the hTM derived from non-COPD and COPD patients, revealed lower levels of SCGB1A1 (club cell marker) gene expression in the COPD-control group compared to the non-COPD control group, consistent with previous clinical studies. Furthermore, we observed that IAV infection elevated SCGB1A1 gene expression especially in secretory cells of both the COPD and non COPD groups. This may imply the role of club cells as early responders during IAV infection providing epithelial repair, regeneration, and resistance to spread of infection. This is the first study to address the molecular diversity in COPD and non-COPD disease models infected with IAV investigating the early response (6 h) of specific cell types in the human lower airways towards infection using scRNA-seq. These findings highlight the potential interplay between COPD, IAV infection, and altered vulnerability to other viral infections and respiratory illnesses making the hAM applicable for addressing more specific research questions and validating potential targets, such as SCGB1A1 targeted therapy for chronic lung diseases. Our findings demonstrate the potential of the hNM and hTM for investigating respiratory infections, innate immune responses, and trained immunity in non-immune cells. Our experiments show that hAM may represent a more accurate representation of the native physiological condition and improve our understanding of the disease mechanisms. Furthermore, these models promote non-animal research as they replicate clinical findings. We can further increase their complexity by incorporating dynamic flow systems and immune cells catered to the research question. / Infektionen der Atemwege stellen weltweit ein erhebliches Gesundheitsproblem dar, und das Epithel der Atemwege spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Atemwegsfunktion und der Steuerung von Entzündungsprozessen. In den meisten Studien zu Atemwegsinfektionen wurden jedoch Zelllinien oder Tiermodelle verwendet, die die natürlichen physiologischen Bedingungen nicht genau widerspiegeln, insbesondere im Hinblick auf menschliche Krankheitserreger. Wir haben Modelle der menschlichen Nasenschleimhaut (hNM) und der Tracheobronchialschleimhaut (hTM) entwickelt, um dieses Problem mit primären menschlichen Epithelzellen und Fibroblasten der Atemwege zu lösen. Wir charakterisierten diese humanen Atemwegsgewebemodelle (hAM) mithilfe von Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie, Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA- seq), Immunfluoreszenzfärbung und ultrastrukturellen Analysen, die ihre Komplexität und zelluläre Heterogenität offenlegten. Wir konnten zeigen, dass der Virulenzfaktor Adenylatzyklasetoxin (CyaA) von Bordetella pertussis die intrazelluläre Produktion von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und die Sekretion von Interleukin (IL)-6, IL-8 und humanem Beta-Defensin-2 (HBD-2) erhöht. Darüber hinaus verglichen wir die Reaktionen der Gewebemodelle aus zwei verschiedenen anatomischen Bereichen (obere und untere Atemwegsschleimhaut) und sind die ersten, die eine solche unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber CyaA anhand von 3D-Modellen aus Atemwegsprimärzellen berichten. Die Auswirkung der Toxinbehandlung auf die epitheliale Barriereintegrität der Gewebemodelle wurde durch Messung des Flusses von Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Dextran durch die Modelle ermittelt. Obwohl wir eine zelltypspezifische Reaktion in Bezug auf die intrazelluläre cAMP-Produktion und die Sekretion von IL-6, IL-8 und HBD-2 in den mit CyaA behandelten Modellen auf der apikalen Seite beobachteten, war die Integrität der Epithelmembranbarriere nicht beeinträchtigt. Anhand dieser gut charakterisierten Modelle haben wir Virusinfektionsstudien für Influenza A (IAV), das respiratorische Synzytialvirus Subtyp B (RSV) und das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) durchgeführt. Wir haben die morphologischen Folgen der Virusinfektion mithilfe von Ultrastrukturanalysen und Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Wir verifizierten die effektive Infektion in hAM durch Messung der viralen RNA mittels RT-qPCR und wiesen erhöhte IL-6- und IL-8- Spiegel als Reaktion auf die Infektion mittels biochemischer Assays nach. Im Gegensatz zu Zelllinien zeigten die Virusinfektionsstudien mit hAM, dass die infizierten Bereiche auf bestimmte Regionen beschränkt waren, was zu Infektions-Hotspots führte, die eher bei Modellen auftraten, die von verschiedenen Spendern stammten und mit allen drei Viren separat infiziert waren. IAV-infizierte Gewebemodelle replizieren die klinischen Befunde einer H1N1-Infektion, wie beispielsweise Schleimhypersekretion, Zytokinfreisetzung und infektionsassoziierte Epithelzellschäden. Schließlich haben wir die Auswirkungen einer IAV-Infektion auf Krankheitsmodelle untersucht. Dazu haben wir hTM aus Biopsien von Patienten mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) isoliert. In Anbetracht der Zunahme an COPD-Fällen in den letzten zehn Jahren und der prognostizierten weiteren Zunahme in der Zukunft dient dies als Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von COPD auf Atemwegsinfektionen. Wir erstellten ein IAV-Infektionsprotokoll, um die frühen Infektionssignaturen bei nicht-COPD- und COPD-Patienten mit Hilfe von scRNA-seq zu erfassen. Bei der untersuchten der Infektionskinetiken von IAV (klinisches H1N1- Isolat) in hTM stellten wir fest, dass die Viren etwa 24 Stunden nach der Infektion aktiv freigesetzt wurden. Die scRNA-seq-Daten von hTM, zeigten eine geringere Genexpression von SCGB1A1 (Clubzellmarker) in der COPD-Kontrollgruppe verglichen mit der nicht-COPD-Kontrollgruppe, was mit früheren klinischen Studien übereinstimmt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass eine IAV-Infektion die SCGB1A1- Genexpression insbesondere in den sekretorischen Zellen beider Gruppen erhöhte. Dies könnte darauf hindeuten, dass Keimzellen während einer IAV-Infektion früh aktiviert werden und damit eventuell für die Reparatur und Regeneration des Epithels sorgen sowie der Ausbreitung der Infektion entgegenwirken. Hierbei handelt es sich um die erste Studie, die sich mit der molekularen Vielfalt in mit IAV infizierten COPD- und nicht-COPD-Modellen befasst und dabei ein besonderes Augenmerk auf die frühe Reaktion (6 Stunden) spezifischer Zelltypen der unteren Atemwege legt und diese mittels scRNA-seq untersucht. Diese Ergebnisse unterstreichen das potenzielle Zusammenspiel zwischen COPD, IAV-Infektion und der Anfälligkeit für andere Virusinfektionen sowie anderer Atemwegserkrankungen. Das zeight, dass die hAM für die Beantwortung spezifischerer Forschungsfragen und die Validierung potenzieller Zielstrukturen, wie z. B. einer gezielten SCGB1A1-Therapie für chronische Lungenerkrankungen, geeignet sind. Unsere Ergebnisse zeigen das Potenzial von hNM und hTM für die Untersuchung von Atemwegsinfektionen, angeborenen Immunreaktionen und ausgebildeter Immunität in nicht-immunen Zellen. Mit unseren Experimenten haben wir gezeigt, dass hAM eine genauere Darstellung des natürlichen physiologischen Zustands darstellen und unser Verständnis der Krankheitsmechanismen verbessern kann. Darüber hinaus könnten diese Modelle die Forschung ohne Tierversuche fördern, da sie dazu neigen, klinische Befunde zu replizieren. Wir können ihre Komplexität weiter erhöhen, indem wir dynamische Strömungssysteme und auf die Forschungsfrage abgestimmte Immunzellen einbeziehen.

The aim of this thesis was to develop an in vitro model (IVR) of the rat lung for the purpose of investigating the deposition of drug particles in the rat airways. The model attempted to account for the affect of drug product characteristics and physiological parameters on deposition in the lungs. In addition, the model outputs were compared with in vivo lung deposition results from live rats and in silico predictions using published computer model of lung deposition in pre-clinical species. Initial work focussed on developing an aerosol exposure system capable of dosing small rodent to a range of airborne test materials. The system consists of two main parts; a fluidised bed aerosol generator and connection of the generator output to a nose only exposure chamber capable of accommodating 12 small animals in a single layer. In addition, an aerodynamic particle spectrometer (APS) was installed for continuously measuring the size distribution and airborne concentration of aerosol particles generated in the exposure chamber. System validation showed acceptable degree of variation of the test material tested, Fluorescent Microspheres (FMS) throughout the exposure chamber (CV < 15.0%). Particle size (MMAD ± GSD) using the APS was shown to be stable throughout the exposure periods. The IVR model developed in this project was based on a number of euthanased (n=7), female Sprague-Dawley rats (weight: 372 ± 56 g), which underwent high-resolution micro-CT scans. The physical model consisted of five sub sections; Extra-Thoracic region containing the snout and nasophyarynx, trachea-bronchial region containing the trachea, bronchi, and bronchioles. All sections of the model were attached to one another in numerical order and housed within a containment unit. At the rear end of the cast, a flexible diaphragm was attached in order to collect the fraction of inhaled particles exiting the TB section and possibly reaching the lung, referred to as the Post-TB section. A study was conducted to assess the influence of inhalation parameters such as the breathing frequency and tidal volume on total and regional dose distribution using FMS as test material. The major finding of this study was the demonstration of the model sensitivity to changes in breathing parameters especially respiratory frequency, where the data showed increased deposition in the peripheral regions of the model with decreased respiratory frequency. Other studies assessed the effect of particle characteristics on deposition on the IVR model, such as particle size, dose increase and formulation changes. The results assessing particle size effect showed a slightly higher deposition levels for the 4µm sized particles versus 2µm sized particles in the head region; 90.8 ± 3.6% and 88.2 ± 6.6%. However, this difference did not reach statistical significance (P> 0.05) probably due to the polydispersity of aerosolised FMS particles. In addition, the regional deposition analysis showed an increased lung peripheral deposition with the smaller particles. In addition, the model was shown to be sensitive to changes in formulation composition mediated by inclusion of MgSt. The next stage of work was to validate the model in terms of comparison with lung deposition for in vivo rats. For lung deposition comparison, the absolute amount deposited in the IVR lung model (expressed as µg/kg) was shown to have a reasonably strong correlation with in vivo lung concentration measures (µg/kg); R2= 0.66, P < 0.05. Compounds were predicted well and within 2-folds of the measured lung deposition values. However, knowing the variability in biological systems and the multiple components required to estimate lung doses, predictions within 2-fold of the measured values would seem reasonable In terms of comparison with in silico model predictions using MPPD, similar deposition levels were noted between the two models, particularly when the data was expressed as percentage of total particles inhaled. The data showed the highest deposition levels were noted in the head region (> 80%) and less than 5.0% deposition for the peripheral lung fractions. With regards to using the IVR model to assess the relationship between dose, particle size and efficacy, an in vivo study using FP with different particle sizes (2.0 and 4.0 µm) but same doses ( 100 and 1000 µg/kg). This study demonstrated that exposure of rat to FP powder resulted in a dose-dependent inhibition of neutrophils in BAL fluids. However, a clear difference in neutrophils suppression was demonstrated for equivalent doses but different particle sizes of FP, where the smaller FP particles (2.0 µm) induced a greater level of neutrophils suppression in comparison with larger FP particles (4.0 µm). In addition, a reasonably good correlation for the relationship between lung deposition in the IVR model and a neutrophils suppression level was demonstrated. Furthermore this data support the hypothesis that regional deposition is an important determinant in efficacy. Therefore, this suggests that the IVR model may be a useful as a tool to describe in vivo efficacy with in vitro data. However, further studies should be conducted to evaluate the validity of this model and relationship. The IVR model has a number of important limitations. First, the model is based on scans up to generation four of the rat respiratory tract as this represented the limits of the micro-CT scanning technology at the time of this study. Therefore deposition in the deeper region of the lung may not be reflected precisely in the IVR model. Second, the regional deposition data generated using the model tended to show an overestimation of deposition in head region and an underestimation of deposition in the peripheral regions of the lung, in comparison with in vivo lung deposition data. Third, the current model does not take into account lung clearance. However, the amount of the drug present in the in vivo lungs is dependent on numerous physiological processes such as dissolution, passive or active absorption into the systemic circulation, binding to lung tissue and mucociliary clearance. Consequently, the results generated using this IVR model for drug molecules with high lung clearance rate should be treated with some caution. Future work extending this research could go in a number of directions. In this research, a representative model of the rat respiratory tract was constructed from analysis of imaging data from a number of euthanised Sprague-Dawley rats. This model represented the “average respiratory tract” in terms of dimensions of Sprague-Dawley rats. However, there is considerable variability in the airway dimensions between rats. This variability encompasses a number of factors such as the strains of rats, sex and age, and disease state. Thus, it may be possible to produce a small number of airway models to represent small and large rats and scaled to represent the extrathoracic and peripheral regions based on literature reports of their dimensions in different rat populations. This approach will then enable the effect of intersubject airway dimensions for different rat populations on aerosol deposition to be thoroughly examined. In addition, due to the limitation of the micro-CT technology used to construct the physical IVR model, detailed morphology only up to generation 4 were captured. However, recent advances in MRI technology, such as the use of in situ-MRI based scanning technology have enabled rat airway morphometry to be extended to 16 airway generation. This coupled with improvements in the resolutions of rapid-prototyping process means it may be possible to construct a rat model that reflects the in vivo lung morphology more accurately, and thus enable greater understanding of the link between aerosol deposition and airway geometry. In conclusion, a model cast of the rat lung was developed and validated to allow the deposition of inhaled particles in the rat lung to be investigated. The model may be used to estimate the lung concentration in vivo rats in preference to exposure concentration measurements based on filter samples which have been shown to be a poor indicator of the lung concentration immediately after exposure. In addition, the model has the potential to be used along with live rats in an inhalation rig in pulmonary pharmaceutics research and may facilitate in development of inhaled formulations to target specific regions within the lung as well as screening of inhaled drugs in preclinical setting. / Das Ziel dieser Arbeit war es, ein in vitro Modell (IVR) der Rattenlunge für die Untersuchung der Deposition von Wirkstoffpartikeln in den Atemwegen der Ratte zu entwickeln. Das Modell sollte dabei den Einfluss der Arzneistoffeigenschaften und physiologischer Parameter auf die pulmonale Deposition berücksichtigen. Darüber hinaus wurden die Modellergebnisse mit in vivo Daten aus Versuchen mit Ratten und in silico Vorhersagen eines etablierten Computermodells der Partikeldeposition in präklinischen Spezies verglichen. Erste Arbeiten konzentrierten sich auf die Entwicklung eines Aerosol-Expositionssystems, das in der Lage war, kleine Nagetiere einer Reihe von inhalativ verabreichten Testmaterialien auszusetzen. Das System bestand aus zwei Hauptteilen, einem Wirbelbett-Aerosolgenerator und einer Verabreichungskammer, die eine nasale Partikelexposition und –inhalation („Nose only Inhalation“) bei 12 Kleintieren auf einer Etage ermöglichte. Darüber hinaus wurde ein aerodynamisches Partikelspektrometer (APS) zur kontinuierlichen Messung der Größenverteilung und Konzentration der erzeugten Aerosolpartikel eingebaut. Die Systemvalidierung zeigte einen akzeptablen Grad der Variabilität des Testmaterials, Fluoreszenz-Mikrosphären (FMS), in der gesamten Expositionskammer (VK < 15,0%). Es konnte gezeigt werden, dass die aerodynamische Partikelgröße (MMAD ± GSD) der APS über die Expositionszeiten konstant blieb. Das IVR-Modell, das in diesem Projekt entwickelt wurde, basierte auf einer Anzahl euthanasierter, weiblicher Sprague-Dawley-Ratten (Gewicht: 372 ± 56 g), die hochauf¬lösenden Mikro-CT-Scans unterzogen wurden. Das physikalische Modell gliederte sich in fünf Teilabschnitte, dem extrathorakalen Bereich bestehend aus der Schnauze und dem Nasopharynx, und dem tracheo-bronchialen Bereich (TB), der die Luftröhre, Bronchien und Bronchiolen umfasste. Alle Abschnitte des Modells wurden miteinander in numerische Reihenfolge gebracht und innerhalb einer Behältereinheit untergebracht. Am hinteren Ende des Gusses wurde eine flexible Membran angebracht, um den Anteil der inhalierten Partikel, der den TB-Abschnitt verlässt und möglicherweise die Lunge erreicht, zu sammeln. Dieses wurde als Post-TB-Anteil bezeichnet. Eine Untersuchung sollte zeigen, welchen Einfluss Inhalationsparameter wie die Atem¬frequenz und –volumen auf die gesamte und regionale Dosisverteilung der FMS als Test¬material hatten. Das wichtigste Ergebnis dieser Studie war der Nachweis, dass das Modell empfindlich gegenüber Änderungen in der Respirationsparameter, vor allem der Atem¬frequenz, war. Die Daten zeigten, dass es unter verminderter Atemfrequenz zu einer verstärkten Partikeldeposition in den peripheren Modellbereichen kam. In weiteren Versuchsansätzen wurden die Wirkung von Partikeleigenschaften, wie Partikelgröße, Dosiserhöhung und Formulierungsänderungen auf die Deposition in dem IVR-Modell ermittelt. Die Ergebnisse der Untersuchung des Partikelgrößeneffektes zeigten eine etwas höhere Deposition der 4 µm großen Partikel, verglichen mit den 2 µm Partikeln, im Kopfbereich, 90,8 ± 3,6% bzw. 88,2 ± 6,6%. Allerdings war dieser Unterschied statistisch nicht signifikant (P > 0,05), wahrscheinlich aufgrund der Polydispersität der FMS-Aerosolpartikel. Darüber hinaus zeigte die Analyse der regionalen Verteilung eine erhöhte periphere Lungendeposition bei kleineren Partikeln. Zudem war das Modell empfindlich gegenüber Veränderungen in der Formulierungszusammensetzung durch Zugabe von Magnesium¬stearat. In nächsten Schritt sollte das Modell in Bezug auf den Vergleich mit der Lungendeposition bei Ratten in vivo validiert werden. Es zeigte sich, dass die absolut im IVR-Lungenmodell deponierte Menge (ausgedrückt in µg/kg) eine annehmbar starke Korrelation mit in vivo Daten (µg/kg) aufwies; R2 = 0,66, p < 0,05. Substanzen konnten gut innerhalb des 2-fachen Bereiches der gemessenen Lungendepositionsrate vorhergesagt werden. Angesichts der bekannt hohen Variabilität in biologischen Systemen und der Komplexität der Schätzung der Lungendeposition erscheinen Schwankungen der Vorhersagen innerhalb des 2-fachen Bereiches der tatsächlichen Werte akzeptabel. Der Vergleich der in silico Vorhersagen mit den IVR-Resultaten zeigte ähnliche Depositions¬raten in beiden Modellen, insbesondere dann, wenn die Daten als Prozentsatz der insgesamt inhalierten Partikel ausgedrückt wurden. Die höchste Deposition fand im Kopfbereich (> 80%) statt und weniger als 5,0 % der Partikel erreichte den peripheren Lungenbereich. Das IVR-Modell wurde nachfolgend auch in einer in vivo Studie mit Fluticasonpropionat (FP) eingesetzt, um die Beziehung zwischen der Dosis, Partikelgröße und Wirksamkeit unterschiedlicher Teilchengrößen (2,0 und 4,0 µm) bei gleichen Dosen (100 und 1000 µg/kg) zu beurteilen. Diese Studie zeigte eine dosisabhängige Hemmung der Neutrophilen in der bronchoalveolären Lavage. Es wurde jedoch ein deutlicher Unterschied in der Neutrophilensuppression unter äquivalenten Dosen unterschiedlicher Partikelgrößen beobachtet. Kleinere Partikel (2,0 µm) von FP hemmten die Neutrophilen stärker als die größeren FP-Partikel (4,0 µm). Darüber hinaus konnte eine recht gute Korrelation zwischen der Lungendepositionsrate im IVR-Modell und der Neutrophilensuppression gezeigt werden. Diese Daten unterstützen die Hypothese, dass die regionale Deposition eine wichtige Determinante der Wirksamkeit ist. Die Ergebnisse legen die mögliche Eignung des IVR-Modells als Hilfsmittel zur Beschreibung der in vivo Effektivität, ausgehend von in vitro Daten, nahe. Allerdings sollten weitere Studien durchgeführt werden, um die Valididtät dieses Modells und der gefundenen Beziehung zu bestätigen. Das IVR-Modell hat eine Reihe von wichtigen Einschränkungen. Erstens basiert das Modell auf Scans lediglich bis zu vierten Generation der Atemwege, was zum Zeitpunkt dieser Studie die Grenze der Mikro-CT-Scan-Technik darstellte. Daher wird in dem IVR-Modell eine Deposition in tieferen Bereichen der Lunge nicht präzise beschrieben. Zweitens zeigten die regionalen Depositionsdaten, die unter Verwendung des Modells ermittelt wurden, im Vergleich zu in vivo Ergebnissen eine Überschätzung der Deposition im Kopfbereich und eine Unterschätzung der Deposition in den peripheren Regionen der Lunge. Drittens berücksichtigt das Modell nicht die Clearance des Arzneistoffes. Die Arzneistoffkonzentration in der Lunge hängt in vivo von zahlreichen physiologischen Prozessen ab, wie Auflösung, aktive und passive Absorption in den systemischen Kreislauf, die Bindung an das Lungengewebe und mukoziliäre Clearance. Daher sollten die Ergebnisse, die unter Verwendung dieses IVR-Modells gewonnen werden, für Wirkstoff¬moleküle mit hoher Clearance-Rate mit einer gewissen Vorsicht behandelt werden. Zukünftige weiterführende Arbeiten könnten in eine Reihe von Richtungen gehen. In der vorliegenden Untersuchung wurde ein repräsentatives Modell des Rattenrespirationstraktes aus der Analyse der Bilddaten mehrerer anästhesierter Sprague-Dawley-Ratten erstellt. Dieses Modell repräsentiert die "durchschnittlichen Atemwege " in Bezug auf Abmessungen der Sprague-Dawley-Ratten. Es gibt jedoch eine beträchtliche Variabilität basierend auf einer Reihe von Faktoren wie den Rattenstamm, Geschlecht, Alter und Krankheitszustand. Es wäre möglich, mehrere verschiedene Atemwegsmodelle zu erstellen, um kleine und große Ratten zu repräsentieren. Es könnten, basierend auf Literaturangaben, die extra¬thorakalen und peripheren Regionen in ihren Abmessungen skaliert werden, um verschiedenen Rattenpopulationen zu repräsentieren. Dieser Ansatz würde dann die detaillierte Untersuchung des Einflusses interindividueller Unterschiede der Atemwegs¬dimensionen verschiedener Rattenpopulationen auf die Aerosoldeposition ermöglichen. Aufgrund der Beschränkung der Mikro-CT-Technologie, die eingesetzt wurde, um das IVR-Modell zu erstellen, konnte eine detaillierte Morphologie nur bis zur vierten Atemwegs¬generation abgebildet werden. Jüngste Fortschritte in der MRI-Technologie, wie die in situ MRI-Scan-Technologie, ermöglichen die Erfassung der Atemwegsmorphometrie bis zu 16 Atemwegsgenerationen. Dieser Ansatz, in Verbindung mit Verbesserungen in den räumlichen Auflösungen der „Rapid-Prototyping“-Verfahren, könnte die Konstruktion eines Rattenmodells ermöglichen, das die in vivo Lungenmorphologie genauer widerspiegelt, und so zu einem besseren Verständnis für den Zusammenhang zwischen Aerosoldeposition und Atemwegsgeometrie führen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit ein Modellguss der Rattenlunge entwickelt und validiert wurde, um die Untersuchung der Deposition von inhalierten Partikel in der Rattenlunge zu ermöglichen. Das Modell kann verwendet werden, um die in vivo Lungenkonzentrationen von Arzneistoffen in Ratten abzuschätzen. Es bietet Vorteile gegenüber der Expositionsabschätzung auf der Basis von Filterproben, die ein schlechter Indikator der Lungenkonzentrationen unmittelbar nach der Exposition sind. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, zusammen mit lebenden Ratten in einer Inhalationskammer in der Forschung verwendet zu werden und könnte in der Entwicklung von inhalativen Formulierungen erleichtern, die in bestimmten Regionen innerhalb der Lunge deponiert werden sollen. Darüber hinaus ermöglicht das Modell ein Screening inhalativ verabreichter Arzneistoffe in der präklinischen Phase.

Muskarin-cholinerge und adrenerge Rezeptoren des autonomen Nervensystems im Respirationstrakt spielen sowohl bei der physiologischen Regulation der Atemwegsfunktion als auch bei der Entstehung und Behandlung wiederkehrender obstruktiver Atemwegserkrankungen (RAO) des Pferdes eine wichtige Rolle. Im Wesentlichen sorgen diese Rezeptorsysteme für eine Relaxation und bzw. oder Kontraktion der glatten Atemwegsmuskulatur. Bei einer Erkrankung der Atemwege wird eine Störung der Balance beider Rezeptorsysteme vermutet. Neuere Forschungsergebnisse belegen, dass zum einen der β–adrenerge Rezeptor-Gs-Protein-Adenylatzyklase-Signalweg im Respirationstrakt RAO-erkrankter Pferde beeinträchtigt ist. Gleichzeitig war die Verteilung und Dichte der muskarin-cholinergen Rezeptoren unverändert. Die Signaltransduktionswege, insbesondere die des muskarin-cholinergen Rezeptorsystems, wurden jedoch bisher noch nicht ausreichend untersucht. Membranen des Lungenparenchyms sowie des Tracheal- und Bronchialepithels mit der darunter liegenden glatten Muskulatur gesunder und RAO-erkrankter Pferde wurden hinsichtlich der Funktionalität der M2- Rezeptor-Gi-Protein-AC-Kopplungsmechanismen mittels 35S-GTPγS-Bindungsstudien untersucht. Mit verschiedenen muskarin-cholinergen Agonisten und den Substanzen N-Ethylmaleimid (NEM) und Pertussistoxin (PTX) wurde die M2-Rezeptor-Gi-Protein-Kopplung überprüft. Vorher war die Ermittlung der Konzentrationen von Na+ (200 mmol/l), Mg2+ (10 mmol/l) und GDP (10 μmol/l) zur Etablierung einer optimierten 35S-GTPγS-Bindung notwendig. Es konnte gezeigt werden, dass die Basalbindung und die Agonisten-stimulierte 35S-GTPγS-Bindung zeitabhängig ist und eine Inkubationszeit festgelegt werden musste, bei der eine hohe relative Stimulation gemessen werden konnte. Diese Inkubationszeit lag bei 120 min bei einer Temperatur von 30°C. Bis zu diesem Zeitpunkt stieg die relative Stimulation der 35S-GTPγS-Bindung. Die muskarin-cholinergen Agonisten Oxotremorin M, Carbachol und Acetylcholin waren in der Lage die 35S-GTPγS-Bindung in allen untersuchten Segmenten bei gesunden und bei an RAO-erkrankten Pferden zu stimulieren, wobei Oxotremorin M die 35S-GTPγS-Bindung stärker als Carbachol und Acetylcholin stimulierte. Die maximale relative Stimulation lag in den Bronchien bei 126 %, in der Trachea bei 104 % und in der Lunge bei 41 %. Diese segmentabhängige Stimulierbarkeit der 35S-GTPγS-Bindung entspricht der Dichte der M2-muskarin-cholinergen Rezeptoren, die an Gi-Proteine gekoppelt sind. Bei an RAO-erkrankten Pferden konnte eine tendenziell stärkere Agonisten-stimulierte Interaktion zwischen den M2-muskarincholinergen Rezeptoren und Gi-Proteinen gemessen werden (Bronchien 141 % und Lunge 78 %) als bei gesunden Pferden. Dies könnte mit einer erhöhten Anzahl an Bindungsstellen für 35S-GTPγS begründet sein, was eine erhöhte Menge an Gi-Proteinen im erkrankten Gewebe bedeuten würde. Hierfür spricht die Hemmung der 35S-GTPγS-Bindung mit NEM und PTX, die die Agonisten-vermittelte 35S-GTPγS-Bindung im Gewebe von an RAO-erkrankten Pferden schwächer hemmte als im Gewebe von gesunden Pferden. Die indirekte Messung der AC-Aktivität zeigte eine segmentabhängige Reduzierung der cAMP-Produktion von Trachea über Bronchien bis hin zur Lunge. Oxotremorin M hemmte die Forskolin-vermittelte cAMPProduktion, und PTX war in der Lage diese durch Entkopplung der Gi-Proteine vom M2-Rezeptor zu hemmen. Ein weiterer Hinweis auf die erhöhte Menge von Gi-Proteinen im Gewebe RAO-erkrankter Pferde war die gemessene Reduzierung der Forskolin-induzierten cAMP-Produktion. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Methode zur Messung der Rezeptorinteraktion mit korrespondierenden G-Proteinen - die 35S-GTPγS-Bindung - in Geweben des Respirationstrakts von Pferden etabliert. Die Stimulation mit muskarin-cholinergen Agonisten führte zu einer erhöhten 35S-GTPγS-Bindung bei an RAO-erkrankten Pferden. Außerdem konnte bei RAO eine Reduzierung der Forskolin-induzierten cAMP-Produktion beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine erhöhte Gi-Proteinmenge hin. Somit verschiebt sich bei RAO das Gi/Gs-Gleichgewicht auf Seite des Gi-Protein-vermittelten Signalwegs. Diese Veränderung des M2-Rezeptor-Gi-Protein-Signalwegs trägt, wie auch die Verschiebung des muskarincholinergen/ adrenergen Gleichgewichts durch β-Adrenozeptor-Downregulation, letztendlich zur bronchokonstriktorischen Aktivität bei RAO bei. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern somit die Grundlage für ein Evidenz-basiertes Konzept der Pharmakotherapie der RAO des Pferdes mit Muskarin-M2-selektiven Antagonisten zusätzlich zur etablierten Basistherapie mit β2-Sympathomimetika, insbesondere wenn gegenüber diesen bereits eine Toleranz besteht.

Objectives: Optical and technical characteristics usually do not allow objective endoscopic distance measurements. So far no standardized method for endoscopic distance measurement is available. The aim of this study was to evaluate the feasibility and accuracy of transoral airway measurements with a multipoint-laser endoscope. Methods: The semirigid endoscope includes a multipoint laser measurement system that projects 49 laser points (wavelength 639 nm, power < 5mW) into the optical axis of the endoscopic view. Distances, areas, and depths can be measured in real-time. Transoral endoscopic airway measurements were performed on nine human cadavers, which were correlated with CT measurements. Results: The preliminary experiment showed an optimum distance between the endoscope tip and the object of 5 to 6 cm. There was a mean measurement error of 3.26% ± 2.53%. A Spearman correlation coefficient of 0.95 (

Zugl.: Berlin, Freie Universiẗat, Diss., 2009.

Background: Airway fibroblasts have become a critical addition to all facets of structural lung tissue changes such as in human asthma and chronic obstructive pulmonary disease, but little is known about their role in the equine recurrent airway obstruction, a disease that resembles to the human asthma. Since the equine bronchial fibroblasts (EBF) have not been isolated and characterized yet, the use of defined medium was investigated. Results: Primary EBF were cultured on non-collagen coated flasks without serum or in the presence of feta bovine serum (FBS) or horse serum (HS) or in serum depleted medium. EBF cultured in serum-free basal media and those serum deprived were not able to proliferate and even exhibited considerable cell death. In media containing FBS or HS, proliferation of the cells was reproducible between different primary cultures and cells demonstrated expression of vimentin. Large variations were found in the ability of FBS and HS to support growth and differentiation of EBF in monolayer culture. Indications of growth-promoting actions, increasing passage number as well as maintaining fibroblast morphology were found rather in FBS than in HS. EBF culturing in HS needed longer doubling and confluence time. The protein content of the cell pellets was higher in EBF cultured in medium containing HS than FBS. Alpha-smooth muscle actin seemed to be less expressed in EBF cultured in medium containing FBS than those in HS. Conclusions: In sum, serum addition to basal EBF medium enhanced EBF differentiation into myofibroblasts, and these findings are useful to develop in vitro fibroblast culture models that mimic in vivo physiological processes and to study airway disease mechanisms and remodeling.

Zusammenfassung der Habilitationsschrift von Dr. rer. nat. Julia Hentschel mit dem Titel: „Die Bedeutung der oberen Atemwege bei zystischer Fibrose – Pathomechanismen, Monitoring und Therapie“, Universität Leipzig Lange Jahre standen rezidivierende Infekte der Lunge und Gedeihstörung durch Maldigestion als lebensbegrenzende Symptome eines Patienten mit Mukoviszidose (Cystische Fibrose/CF) im Vordergrund. Das Hauptaugenmerk in der Diagnostik und Therapie von CF-Patienten lag daher zumeist auf den unteren Atemwegen bzw. dem Verdauungstrakt. Verbesserte Therapiemöglichkeiten und eine erhebliche Steigerung der Lebenserwartung brachten andere Symptome in den klinischen und wissenschaftlichen Fokus. Seit 2005 untersuchen wir systematisch die Rolle der oberen Atemwege bei Patienten mit CF, indem wir bei jeder Routinevorstellung Material der oberen Atemwege nicht-invasiv gewinnen, analysieren und asservieren. Wir konnten Methoden etablieren, um nasale Lavagen mit wenig Aufwand auch für große Studien einfach und schnell zu gewinnen und zu asservieren. Wir konnten zeigen, dass sich diese nasalen Lavagen eignen, um eine Besiedlung mit Pathogenen zu erfassen und die resultierende inflammatorische Wirtsantwort zu untersuchen. Wir konnten erstmals beweisen, dass die oberen Atemwege ein Keimreservoir darstellen und von dort aus Keime die Lunge (wieder) besiedeln können. Dies fand Eingang in aktuelle Leitlinien zur Mukoviszidosebetreuung und Lungentransplantation und hat Einfluss auf den Erfolg dieses ohnehin schon stark risikobehafteten Eingriffs. CF ist eine Erkrankung, bei der häufig eine überschießende Entzündungsreaktion beobachtet wird. Unsere Studien legten dabei den Schluss nahe, dass in den oberen Atemwegen andere Imbalancen eine Rolle spielen als in den unteren Atemwegen und sich daraus auch unterschiedliche therapeutische Ansätze ergeben könnten. Weiterhin konnten wir verdeutlichen, dass sich auch der Einfluss therapeutischer Interventionen in den Inflammationsmediatoren der oberen Atemwege widerspiegelt. Eine wichtige Erkenntnis daraus war, dass v.a. systemische Antibiosen deutlich langsamer und/oder schlechter in den Nasennebenhöhlen und den oberen Atemwegen wirken als auf die unteren und dass hier ein Umdenken in der antibiotischen Therapie der oberen Atemwege erfolgen muss. Unsere Studien beweisen einmal mehr das Kontinuum der Atemwege von der Nasenspitze über die paranasalen Sinus bis in die distalen Alveolen und dass ein gutes Therapiekonzept immer das große Ganze im Blick haben sollte. Schlussendlich stellt die CF hier ein Modellsystem dar. Viele unserer Erkenntnisse können auch Nicht-CF-Patienten mit Erkrankungen der oberen Atemwege zugutekommen.

Objectives: Optical and technical characteristics usually do not allow objective endoscopic distance measurements. So far no standardized method for endoscopic distance measurement is available. The aim of this study was to evaluate the feasibility and accuracy of transoral airway measurements with a multipoint-laser endoscope. Methods: The semirigid endoscope includes a multipoint laser measurement system that projects 49 laser points (wavelength 639 nm, power < 5mW) into the optical axis of the endoscopic view. Distances, areas, and depths can be measured in real-time. Transoral endoscopic airway measurements were performed on nine human cadavers, which were correlated with CT measurements. Results: The preliminary experiment showed an optimum distance between the endoscope tip and the object of 5 to 6 cm. There was a mean measurement error of 3.26% ± 2.53%. A Spearman correlation coefficient of 0.95 (

Muskarin-cholinerge und adrenerge Rezeptoren des autonomen Nervensystems im Respirationstrakt spielen sowohl bei der physiologischen Regulation der Atemwegsfunktion als auch bei der Entstehung und Behandlung wiederkehrender obstruktiver Atemwegserkrankungen (RAO) des Pferdes eine wichtige Rolle. Im Wesentlichen sorgen diese Rezeptorsysteme für eine Relaxation und bzw. oder Kontraktion der glatten Atemwegsmuskulatur. Bei einer Erkrankung der Atemwege wird eine Störung der Balance beider Rezeptorsysteme vermutet. Neuere Forschungsergebnisse belegen, dass zum einen der β–adrenerge Rezeptor-Gs-Protein-Adenylatzyklase-Signalweg im Respirationstrakt RAO-erkrankter Pferde beeinträchtigt ist. Gleichzeitig war die Verteilung und Dichte der muskarin-cholinergen Rezeptoren unverändert. Die Signaltransduktionswege, insbesondere die des muskarin-cholinergen Rezeptorsystems, wurden jedoch bisher noch nicht ausreichend untersucht. Membranen des Lungenparenchyms sowie des Tracheal- und Bronchialepithels mit der darunter liegenden glatten Muskulatur gesunder und RAO-erkrankter Pferde wurden hinsichtlich der Funktionalität der M2- Rezeptor-Gi-Protein-AC-Kopplungsmechanismen mittels 35S-GTPγS-Bindungsstudien untersucht. Mit verschiedenen muskarin-cholinergen Agonisten und den Substanzen N-Ethylmaleimid (NEM) und Pertussistoxin (PTX) wurde die M2-Rezeptor-Gi-Protein-Kopplung überprüft. Vorher war die Ermittlung der Konzentrationen von Na+ (200 mmol/l), Mg2+ (10 mmol/l) und GDP (10 μmol/l) zur Etablierung einer optimierten 35S-GTPγS-Bindung notwendig. Es konnte gezeigt werden, dass die Basalbindung und die Agonisten-stimulierte 35S-GTPγS-Bindung zeitabhängig ist und eine Inkubationszeit festgelegt werden musste, bei der eine hohe relative Stimulation gemessen werden konnte. Diese Inkubationszeit lag bei 120 min bei einer Temperatur von 30°C. Bis zu diesem Zeitpunkt stieg die relative Stimulation der 35S-GTPγS-Bindung. Die muskarin-cholinergen Agonisten Oxotremorin M, Carbachol und Acetylcholin waren in der Lage die 35S-GTPγS-Bindung in allen untersuchten Segmenten bei gesunden und bei an RAO-erkrankten Pferden zu stimulieren, wobei Oxotremorin M die 35S-GTPγS-Bindung stärker als Carbachol und Acetylcholin stimulierte. Die maximale relative Stimulation lag in den Bronchien bei 126 %, in der Trachea bei 104 % und in der Lunge bei 41 %. Diese segmentabhängige Stimulierbarkeit der 35S-GTPγS-Bindung entspricht der Dichte der M2-muskarin-cholinergen Rezeptoren, die an Gi-Proteine gekoppelt sind. Bei an RAO-erkrankten Pferden konnte eine tendenziell stärkere Agonisten-stimulierte Interaktion zwischen den M2-muskarincholinergen Rezeptoren und Gi-Proteinen gemessen werden (Bronchien 141 % und Lunge 78 %) als bei gesunden Pferden. Dies könnte mit einer erhöhten Anzahl an Bindungsstellen für 35S-GTPγS begründet sein, was eine erhöhte Menge an Gi-Proteinen im erkrankten Gewebe bedeuten würde. Hierfür spricht die Hemmung der 35S-GTPγS-Bindung mit NEM und PTX, die die Agonisten-vermittelte 35S-GTPγS-Bindung im Gewebe von an RAO-erkrankten Pferden schwächer hemmte als im Gewebe von gesunden Pferden. Die indirekte Messung der AC-Aktivität zeigte eine segmentabhängige Reduzierung der cAMP-Produktion von Trachea über Bronchien bis hin zur Lunge. Oxotremorin M hemmte die Forskolin-vermittelte cAMPProduktion, und PTX war in der Lage diese durch Entkopplung der Gi-Proteine vom M2-Rezeptor zu hemmen. Ein weiterer Hinweis auf die erhöhte Menge von Gi-Proteinen im Gewebe RAO-erkrankter Pferde war die gemessene Reduzierung der Forskolin-induzierten cAMP-Produktion. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig die Methode zur Messung der Rezeptorinteraktion mit korrespondierenden G-Proteinen - die 35S-GTPγS-Bindung - in Geweben des Respirationstrakts von Pferden etabliert. Die Stimulation mit muskarin-cholinergen Agonisten führte zu einer erhöhten 35S-GTPγS-Bindung bei an RAO-erkrankten Pferden. Außerdem konnte bei RAO eine Reduzierung der Forskolin-induzierten cAMP-Produktion beobachtet werden. Diese Ergebnisse deuten auf eine erhöhte Gi-Proteinmenge hin. Somit verschiebt sich bei RAO das Gi/Gs-Gleichgewicht auf Seite des Gi-Protein-vermittelten Signalwegs. Diese Veränderung des M2-Rezeptor-Gi-Protein-Signalwegs trägt, wie auch die Verschiebung des muskarincholinergen/ adrenergen Gleichgewichts durch β-Adrenozeptor-Downregulation, letztendlich zur bronchokonstriktorischen Aktivität bei RAO bei. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern somit die Grundlage für ein Evidenz-basiertes Konzept der Pharmakotherapie der RAO des Pferdes mit Muskarin-M2-selektiven Antagonisten zusätzlich zur etablierten Basistherapie mit β2-Sympathomimetika, insbesondere wenn gegenüber diesen bereits eine Toleranz besteht.