Orientadores: Renata de Oliveira Mattos Graner, Flávia Sammartino Mariano Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T11:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ThaisRossinide_M.pdf: 1438459 bytes, checksum: a127a667898930e41649ac3faebb8d1a (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Streptococcus sanguinis é uma espécie pioneira comensal das superfícies dos dentes, que também está envolvida na endocardite infecciosa. Sua alta prevalência na cavidade oral indica capacidade de adaptar-se e sobreviver a diversos fatores de defesa presentes nesse nicho. Para se adaptar ao ambiente e a fatores do hospedeiro, as bactérias utilizam-se de sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC), que modulam a regulação de genes em respostas a diferentes estímulos. Neste estudo avaliou-se o papel do SDC VicRK e CovR, na susceptibilidade de S. sanguinis a opsonização pelo sistema complemento. Para isso, foram analisados os níveis de deposição de C3b / iC3b na presença de soro em um total de sete cepas clínicas de S. sanguinis, e as frequências de fagocitose por polimorfonucleares (PMNs) do sangue humano foram comparados entre as cepas S. sanguinis SK36 e mutantes knockout de vicK (SKvic) e covR (SKcov), genes estes que codificam componentes VicK e CovR, respectivamente. A cepa de S. mutans U159 foi utilizada como referência. Resumidamente, as cepas foram incubadas com soro humano a 2 ou 20% por 30 min (37 ° C, 10% de CO2), lavadas, e a presença de C3b associada à superfície foi detectado utilizando anticorpos anti-C3b humano (conjugado com FITC), sendo quantificadas por citometria de fluxo. Para avaliar as frequências de fagocitose por PMNs, as cepas foram incubadas com sangue humano durante tempos de 5, 15, 30 e 60 min (37 ° C, 10% de CO2), fixadas e coradas com Giemsa. PMNs com bactérias intracelulares, foram contados utilizando um microscópio de luz (1000 x) e os resultados expressos em relação a análise de um total de 200 PMNs. Resultados: As percentagens de deposição de C3b em SKvic, SKcov e SK36 foram de 11,3 (± 2,61), 40,2 (± 1,46) e 37,9% (± 3,97), respectivamente. Percentagem de superfície C3b foi significativamente menor em cepas de S. sanguinis em comparação a cepa de S.mutans (Kruskal Wallis, p <0,05), e em SKvic em comparação a cepa SK36 (Kruskal Wallis, p <0,05). As frequências médias de fagocitose por PMNs não foram afetadas, e foram 88, 99,3 e 99% em SKvic, SKcov e SK36, respectivamente. Conclusão: a inativação do VicK, mas não de CovR, reduz a deposição de C3b em S. sanguinis SK36. Cepas de S. sanguinis também são menos suscetíveis a deposição de C3b em comparação a S. mutans / Abstract: Streptococcus sanguinis is a commensal pioneer species of the tooth surfaces, which is also involved in infectious endocarditis. Its high prevalence in the oral cavity indicates ability to survive to several host defense factors present in the oral niches. To sense and respond to environmental and host factors, bacteria apply regulatory two-component systems (TCSs), which modulate gene transcription in response to different stimuli. This study evaluated the role of TCS VicRK and CovR in S. sanguinis susceptibility to opsonization by the complement system. To this aim, a total of seven S. sanguinis strains were analyzed, and levels of deposition of C3b/iC3b on the present of serum, and the frequencies of phagocytosis by polymorphonuclear (PMNs) in human blood were compared between parent S. sanguinis strain SK36 and knockout mutants of vicK (SKvic) and covR (SKcov) (genes encoding VicK and CovR components, respectively). S. mutans strain U159 was used as reference. Briefly, strains were incubated with 2 or 20% of human serum during 30 min (37°C, 10%CO2), washed, and the presence of surface-associated C3b was detected using anti-human C3b antibodies (FITC conjugated), which were quantified by flow cytometry. To assess the frequencies of phagocytosis by PMN, strains were incubated with human blood during 5, 15, 30 and 60 min (37°C, 10% CO2), fixed and stained with Giemsa. PMN with intracellular bacteria were counted using a light microscope (1000 x) and expressed in relation to a total of 200 PMN analyzed. Results: The percentages of C3b deposition on SKvic, SKcov and SK36 were 11.3 (± 2.61), 40.2 (± 1.46) and 37.9% (± 3.97), respectively. Percentage of surface C3b was significantly lower in S. sanguinis strains compared to S. mutans (Kruskal Wallis, p < 0.05), and in SKvic compared to SK36 (Kruskal Wallis, p < 0.05). The mean frequencies of phagocytosis by PMN was not affected, and were 88, 99.3 and 99% in SKvic, SKcov and SK36, respectively. Conclusion: the inactivation of the vicK, but not of covR, reduces the deposition of C3b in S. sanguinis SK36. S. sanguinis strains are also less susceptible to C3b deposition compared to S. mutans / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestra em Biologia Buco-Dental

Made available in DSpace on 2016-04-12T12:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 cintia_marinho_ioc_dout_2015.pdf: 2296721 bytes, checksum: 160c0c4d020b49fe043c76c8f20136ad (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O Sistema Complemento (SC) desempenha papel importante no controle de infecções atuando na eliminação do patógeno e na regulação da resposta imune. Contudo, uma ativação desregulada do SC gera efeitos deletérios ao hospedeiro, contribuindo para a patogênese de diversas doenças, como na Dengue. Entretanto, o envolvimento do SC na infecção pelo vírus Dengue (DENV) ainda tem vários aspectos a serem investigados. Assim, avaliamos a contribuição do SC na infecção in vitro de monócitos pelo DENV; o perfil de expressão dos Receptores de Complemento (CR) CR1, CR2, CR3, CR4, CD46, CD55 e CD59, e de moléculas de ativação nos monócitos e linfócitos T circulantes de pacientes infectados pelos DENV-1,-2 ou -4 por citometria de fluxo. Dosamos os níveis de SC5b-9 e citocinas em pacientes por ELISA. Avaliamos ainda, a contribuição da ativação do SC na permeabilidade e viabilidade endotelial, utilizando modelo in vitro de células endoteliais (CEs) pela medida da resistência elétrica transendotelial (TEER) e liberação de LDH sobrenadante de culturas. Por fim investigamos a interação DENV-2 com componentes purificados do SC por eletroforese das proteínas. Como achados principais, observamos diminuição na frequência de monócitos CD14+ expressando CR3, CR4 e CD59 em pacientes comparado aos controles saudáveis. De forma interessante, o bloqueio do CR3 levou à diminuição em cerca de 30% da infecção in vitro pelo DENV-2 em monócitos, sem alterar o fenótipo de ativação ou a ativação da caspase-1 destas células. No entanto, com o bloqueio de CR3, detectamos diminuição na produção de TNF-alfa e IFN-alfa. Não observamos diferença significativa na frequência de linfócitos T expressando CR3, CD46, CD55 e CD59 de em pacientes-Dengue-4 Apesar disso, os linfócitos T CR+ apresentaram um perfil ativado coexpressando CD29, CCR5 e CD107a. Na infecção pelo DENV, independente do sorotipo viral, detectamos elevados níveis circulantes de SC5b-9. Na infecção pelo DENV-1/-2 os níveis mais elevados de SC5b-9 foram observados em pacientes que apresentaram sangramentos e extravasamento plasmático, enquanto nos pacientes-DENV-4, os níveis de SC5b-9 foram correlacionados diretamente com a manutenção da integridade vascular. Entretanto, o SC5b-9 parece estar associado com a liberação de LDH intracelular. Finalmente, vimos que DENV-2 promove a clivagem de C3 na ausência de fator D. Nossos dados sugerem que uma frequência diminuída de monócitos expressando CR3 em pacientes poderia ser uma tentativa de controle da infecção, uma vez que detectamos diminuição da infecção, com o bloqueio de CR3 in vitro e ainda, vimos que o DENV-2 modula a clivagem de C3. O aumento da frequência de linfócitos T CR+ coexpressando moléculas de ativação sugere que células de perfil ativado, capazes de controlar a infecção, estariam protegidas da lise via SC. Confirmamos que o SC está ativado na Dengue, pelos altos níveis de SC5b-9. Entretanto, os níveis de SC5b-9 foram associados com a gravidade nos pacientes-DENV-1/-2 enquanto, nos pacientes-DENV-4 foram correlacionados com a manutenção da integridade vascular. Esses dados sugerem que a ativação do SC estaria relacionada diferencialmente com a patogênese de acordo com o sorotipo da infecção / The complement system (CS) develops an important role in the infection control, by direct elimination of pathogens and regulation o f the immune response. However, a deregulated CS activation is responsible to induce deleterious effects to the host, contributing to the pathogenesis of several diseases, including Dengue. Besides this, the involvement of the CS on Dengue virus (DENV) inf ection still has many aspects to be investigated. So, we evaluated the CS contribution during in vitro infection of monocytes by DENV; the profile of complement receptors (CR) CR1, CR2, CR3, CR4, CD46,CD55 and CD59 expression on circulating monocytes and T cells from DENV - 1, - 2 or - 4 infected patients by flow cytometry. We assessed the levels of SC5b - 9 and cytokines in patients by ELISA. We evaluated the contribution of the CS activation on endothelial permeability and viability by using an in vitro model wi th endothelial cells by accessing the transendothelial electric resistence (TEER) and LDH release on culture supernatants. Finally, the interaction of DENV - 2 and purified components was evaluated by electrophoresis of proteins. As principal findings, we ob served decreased frequencies of CD14 monocytes expressing CR3, CR4 and CD59 in patients compared to healthy controls. Interestingly, the blockage of CR3 resulted in around 30% reduction of the DENV - 2 infection in monocytes in vitro , without alteration on activation phenotype neither on caspase - 1 activation, of these cells. However, with CR3 - blocking we detected decreased production of TNF - alpha and IFN - alpha. Unaltered frequencies of T cells expressing CR3, CD46, CD55 and CD59 were found in DENV - 4. Beside s, T cells CR+ presented an activated profile, by the coexpression of CD29, CCR5 e CD107a. In DENV infection, regardless the viral serotype, we detected increased levels of circulating SC5b - 9. However among the two groups of patients we saw controversial r esults. In the DENV - 1/ - 2 infection higher levels of SC5b - 9 were detected in patients with bleeding and vascular leakage, while in DENV - 4 patients, the levels of SC5b - 9 were directly correlated with the maintenance of the vascular integrity. Although, the SC5b - 9 levels is associated to release of intracellular LDH. Finally, we saw that DENV - 2 promotes C3 cleavage in the absence of factor D. Our data suggest that a decreased frequency of CR3 - expressing monocytes in DENV - patients would aim to control the infe ction, since in vitro , we detected decreased infection when CR3 was blocked e also, DENV - 2 seems to modulate the cleavage of C3. The increased frequency of T cells CR+ coexpressing activation molecules suggest that cells with activated profile, able to con trol the infection, would be protected of CS mediated lysis. We confirmed that CS is activated during Dengue, by the high levels of SC5b - 9. However, the levels of SC5b - 9 were associated with to severity in DENV - 1/ - 2 patients, while in DENV - 4 it was directl y correlated with the maintenance of the vascular integrity. These data suggest that CS activation would be differentially related to the disease pathogenesis in accordance to the serotype of the infection

Orientador: Renata de Oliveira Mattos Graner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alves_LiviaAraujo_M.pdf: 2021430 bytes, checksum: 07a84279508cd84bfef41550d34e6ca7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Streptococcus mutans (SM) é um patógeno oral da cárie dentária e endocardite infecciosa. Para se estabelecer no hospedeiro, SM precisa se adaptar às condições biofísicas e aos fatores de defesa do hospedeiro. Para isto, SM utiliza sistemas reguladores de transcrição de dois componentes (SDC). Dois SDCs, VicRK e CovR, são associados à virulência de SM. O objetivo deste trabalho foi investigar a participação dos reguladores de transcrição gênica VicRK e CovR na evasão de SM ao sistema complemento e fagocitose. Dessa forma, a marcação pelo complemento foi comparada entre os mutantes vicK- e covR- obtidos da cepa SM UA159 (UAvic e UAcov, respectivamente) e UA159, através da incubação com soro humano a 20% ou soro humano livre de C1q (30 min, 37 ?C, 10% CO2). A deposição de C3b sobre a superfície de SM foi analisada também nas cepas cultivadas em meio com 0,1% de sacarose. A quantidade de C3b nas superfícies bacterianas foi determinada através de reações com anticorpos IgG de cabra anti-C3 humano conjugado com FITC e análise de citometria. Bactérias incubadas com PBS foram usadas como controle negativo. O reconhecimento das cepas de SM por anticorpos séricos opsonizantes foi realizado com anticorpos anti-IgG humano conjugado com FITC e anti-IgM humano conjugado com APC. Para análise da fagocitose, as mesmas cepas coradas com FITC foram incubadas com neutrófilos (PMN) por 5 e 30 min. na presença ou ausência de soro humano a 20%; o número de PMN com bactérias fagocitadas foi determinado por citometria de fluxo. A deposição de C3b foi menor em UAcov (10,86%) e em UAvic (7,6%), comparado à UA159 (23,5%). Na presença de sacarose, a marcação por C3b caiu para 10,86% em UA159, e para os mutantes UAcov e UAvic foi reduzida a 6,6 e 3,96%, respectivamente (ANOVA p<0,001). Os mutantes UAcov e UAvic foram menos reativos contra anticorpos IgG e IgM. A fagocitose por PMN foi reduzida em UAcov e UAvic em cerca de 50 a 60% em relação à UA159 nos tempos de 5 e 30 min. (ANOVA p< 0,005). Assim, a inativação dos sistemas VicRK e CovR reduz significativamente a deposição de C3b do complemento e a frequência de fagocitose de SM, indicando que estes SDC regulam genes envolvidos no escape à opsonização pelo complemento / Abstract: Streptococcus mutans (SM) is an oral pathogen of dental caries and infective endocarditis. To get established in host sites, SM needs to adapt to biophysical conditions and host defense factors. To this purpose, SM applies transcriptional regulatory systems of two components (SDC). Two SDCs, VicRK and CovR, have been implicated in SM virulence. The aim of this study was to investigate the role of VicRK and CovR on SM evasion from complement system and phagocytosis by neutrophils (PMN). Thus, complement deposition was compared between vicK- and covR- mutants obtained strain UA159 (UAvic and UAcov, respectively) and the parent UA159 exposed to 20% human serum or human serum depleted of C1q (30 min, 37ºC, 10% CO2). Deposition of C3b on SM surfaces was also analyzed in strains cultivates in the presence of 0.1% sucrose. The amount of C3b on the bacterial surface was determined by reactivity with goat IgG antibody anti-C3 conjugated FITC and flow cytometry analysis. Bacteria incubated with PBS were used as negative control. The reactiveness of SM strains with human serum antibodies was quantified by flow citometry with anti- human IgG- FITC and anti- human IgM-APC antibodies. For analysis of phagocytosis, the strains stained with FITC were incubated with PMN during 5 and 30 min. in the presence or absence of 20% human serum; the number of internalized bacteria by PMN was determined by flow cytometry. The deposition of C3b on UAcov (10.86 %) and UAvic (7.6%) was lower, compared to UA159 (23.5%) (ANOVA p<0,001). In the presence of sucrose, C3b deposition decreased to 10.86 % in UA159, and to 6.6 and 3.96% in UAcov and UAvic , respectively (ANOVA p < 0.001). The UAcov and UAvic mutants were less reactive with IgG and IgM antibodies. The phagocytosis by PMN was 50 to 60% reduced in UAcov and UAvic compared to UA159, respectively at times 5 and 30 min. (ANOVA p < 0.005). Thus, inactivation of CovR and VicRK TCS systems significantly reduces deposition of complement C3b and phagocytosis by PMN in a serum-dependent way, indicating that these SDC regulate genes involved in the evasion of complement to opsonization / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestra em Biologia Buco-Dental

Submitted by Irene Nascimento (irene.kessia@ufpe.br) on 2016-10-06T17:20:04Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Denise Maria do Nascimento Costa.pdf: 2568349 bytes, checksum: 97687424c47175731885cd254c815ad4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T17:20:04Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação Denise Maria do Nascimento Costa.pdf: 2568349 bytes, checksum: 97687424c47175731885cd254c815ad4 (MD5) Previous issue date: 2016-07-21 / Introdução: Glomerulopatia membranosa (GM) é uma causa de síndrome nefrótica cuja etiologia pode ser primária (GMP) ou secundária, dentre estas é frequente o Lúpus eritematoso sistêmico (LES). Trata-se de uma doença imunologicamente mediada, caracterizada pela deposição de imunocomplexos no espaço subepitelial glomerular. A maioria dos antígenos envolvidos identificados são alvos da imunoglobulina G4 (IgG4), subclasse predominante em imunofluorescências renais na GMP, em contraste com a GM secundária a LES (GMS) na qual IgG1, IgG2 e IgG3 prevalecem. Apesar da IgG4 ser um subtipo de imunoglobulina com baixa capacidade de ativação do complemento, há várias evidências deste envolvimento na GMP. Esses dados, em conjunto com achados de depósitos glomerulares de lectina ligadora de manose (MBL), um dos principais componentes da via das lectinas do complemento, podem sugerir que tanto a via da lectina como a IgG4 estão envolvidas nesta patologia. Sabe-se ainda que o desenvolvimento de GMP também está associado a alterações genéticas. Entretanto, a etiopatogenia da GMP ainda não é totalmente conhecida e estudos para avaliação gênica do MBL2 e dosagem sérica de IgG em GM são escassos. Assim, foi realizado este estudo com o objetivo de avaliar a frequência de polimorfismos do gene MBL2 em portadores de GM, comparados a indivíduos saudáveis. Um segundo objetivo foi comparar pacientes com GMP e GMS quanto a diferenças do percentual de IgG4 sérico em relação a IgG (%IgG4) e da frequência de polimorfismos do MBL2. Métodos: Estudo realizado entre 2014 e 2015, em Pernambuco - Brasil. A amostra incluiu 60 pacientes adultos com diagnóstico histopatológico de GMP ou GMS. Outras causas de GM secundárias foram excluídas. Foram avaliados 35 pacientes com GMP e 24 com GMS, e um grupo controle (GC), formado por 101 indivíduos saudáveis. Resultados: O alelo mutante O do gene MBL2 foi mais frequente no grupo com GM comparados aos GC (42% x 22%; p < 0,001). A heterozigose A/O, em relação ao genótipo A/A, predominou entre os pacientes comparados ao GC, associando-se a GM com OR = 11,16 (95% IC = 4,77 - 28,41). À análise comparativa entre os pacientes com GMP e GMS, não houve diferença das frequências dos polimorfismos genéticos entre os grupos. O grupo GMP apresentou menor mediana de IgG sérica total (p = 0,008) e maior %IgG4 (p = 0,016), comparado ao grupo GMS. Nível sérico de IgG4 não diferiu significativamente entre os grupos GMP e GMS (p = 0,289). Conclusão: O polimorfismo do éxon 1 do gene MBL2 associou-se à GM, comparado a indivíduos saudáveis, porém sem diferença entre as etiologias avaliadas. Já o %IgG4 sérico foi maior na GMP em relação a GMS. Estes resultados sugerem que esta mutação genética possa conferir maior vulnerabilidade a GMP e que o %IgG4 sérico possa ser utilizado como marcador adicional para diagnóstico diferencial entre as duas etiologias da GM. / Introduction: Membranous glomerulopathy (MG) is a cause of nephrotic syndrome whose etiology may be primary (PMG) or secondary, wich is frequent systemic lupus erythematosus (SLE). It is an immune-mediated disease characterized by the deposition of immune complexes in the glomerular subepithelial space. Most of the identified antigens are targets to immunoglobulin IgG4, most common subclass in renal immunofluorescence in GMP, in contrast to the SLE secondary MG (SMG) in which IgG1, IgG2 and IgG3 prevail. Although IgG4 is a immunoglobulin subtype with low complement activation capacity, there is abundant evidence of this involvement in PMG. These data, together with glomerular deposits of mannose-binding lectin (MBL), a major component of the lectin pathway of complement, may suggest that both the lectin pathway and IgG4 are involved in this pathology. It is also known that the development of PMG is associated with genetic alterations. As the pathogenesis of PMG is not yet fully known, and studies for genetic evaluation of MBL2 and serum IgG in MG are scarce, this study was conducted to evaluate the frequency of MBL2 gene polymorphisms in patients with MG, compared to healthy subjects. A second objective was to compare patients with PMG and SMG with respect to the percentage of serum IgG4 (IgG4%) and frequency MBL2 polymorphisms. Methods: This study was conducted between 2014 and 2015 in Pernambuco - Brazil. The sample included 60 adult patients with histopathologic diagnosis of PMG or SMG. Other causes of secondary MG were excluded. Thity five patients with PMG and 24 with SMG were evaluated, compared to a control group (CG) of 101 healthy subjects. Results: The mutant allele O was more frequent in the MG population compared to CG (42% vs. 22%; p <0.001). The heterozygous A/O, compared to genotype A/A, predominated among patients compared to the control group, and was associated with MG (OR = 11.16; 95% CI = 4.77 to 28.41). In the comparative analysis between patients with PMG and SMG, there was no difference in the frequency of genetic polymorphisms between groups. The PMG group had lower median total serum IgG (p = 0.008) and higher IgG4% (p = 0.016) compared to the SMG group. Serum IgG4 did not differ significantly between the groups PMG and SMG (p = 0,289). Conclusion: The polymorphism of exon 1 MBL2 gene was associated with MG, compared to healthy subjects, but no difference between the assessed etiologies. Serum IgG4% was higher in PMG relative to SMG. These results suggest that this gene mutation can confer increased vulnerability to PMG and the serum IgG4% may be used as an additional marker for the differential diagnosis between the two etiologies MG.