Peroxirredoxinas (Prxs) são enzimas que desempenham papéis centrais no metabolismo redox celular, são proteínas abundantes reduzindo peróxidos com uma velocidade extraordinária. As Prxs estão presentes em todos os grupos taxonômicos, possuem várias isoformas com diferentes funções, tais como antioxidantes, chaperonas moleculares e reguladores da transdução de sinal. São peroxidases tióis dependentes baseadas em um resíduo de cisteína catalítico podendo ser divididas em 1-Cys ou 2-Cys, dependendo do número de resíduos de cisteínas envolvidos na catálise. Inicialmente a redução das Prxs foi descrita por ser estritamente dependente de tióis, no entanto nosso grupo demonstrou que o ascorbato também poderia reduzir o sulfênico intermediário das 1-Cys Prx (1-Cys Prx-SOH) em diferentes organismos. Esses dados representam um quebra no paradigma antioxidante tiól específico, mostrando que o ascorbato pode reduzir os ácidos sulfênicos nas 1-Cys Prx. Para obter evidências que o ascorbato possa ser considerado um redutor biológico das 1-Cys Prx, foi necessário determinar a constante de segunda ordem, uma vez que em células, outros compostos podem competir com este antioxidante. Devido a problemas técnicos, este foi um desafio por muitos anos. Neste trabalho, descrevemos a caracterização cinética da redução de ácidos sulfênicos por ascorbato em diferentes proteínas. Primeiramente, a redução das 1-Cys Prx-SOH foi analisado usando a enzima de A. fumigatus (AfPrxA) que apresenta similaridade de 37% com a Prdx6 (1-Cys Prx humana) e foi considerada uma enzima bastante estável. Inicialmente, realizamos a análise bi-substrato utilizando eletrodos específicos para H2O2 (Free Radical Analyzer 4100 da World Precision Instruments Inc.), através de uma abordagem de estado estacionário. AfPrxA decompõem H2O2 em uma reação ascorbato dependente com boa eficiência (kcat/KM asc = 7.4 x 103 M-1s-1), através de um mecanismo Bi-Bi Ping-Pong. Para apoiar ainda mais esses resultados, desenvolvemos uma abordagem cinética independente, baseada na competição entre diclorofenolindofenol (DCPIP) e ácidos sulfênicos por ascorbato. DCPIP é um sensor redox, cuja a coloração azul é perdida quando reduzido. Primeiramente, confirmamos que o DCPIP foi reduzido por ascorbato com uma constante de segunda ordem de 718 M-1s-1, similar a valores descritos na literatura anteriormente. Este método validou nossas condições de ensaio, permitindo determinar a constante de segunda ordem de reação entre AfPrxA-SOH e ascorbato (1,5 x 103 M-1s-1) a pH 7,44, 25ºC através da abordagem de pseudo-primeira ordem. Portanto, por dois métodos diferentes, demonstramos que o ascorbato reduz a AfPrxA-SOH com constantes de velocidade na ordem de 103 M-1s-1. Este ensaio também nos permitiu determinar as constantes de segunda ordem para as 1-Cys Prx de diferentes organismos como bactéria, levedura, planta e mamíferos. Em todos os casos, as constantes de velocidade foram na ordem de 103 M-1s-1. Posteriormente, analisamos se a 2-Cys Prx de levedura (Tsa1), que possui uma mutação na cisteína de resolução por um resíduo de serina (Tsa1-C170S) poderia adquiri atividade ascorbato dependente. Novamente, a forma ácido sulfênico da Tsa1-C170S foi reduzida por ascorbato na mesma ordem de grandeza de 103 M-1s-1. Em adição, decidimos investigar a redução dos Cys-SOH por ascorbato em outras proteínas como Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e Papaína que também possuem um ácido sulfênico como produto da oxidação. A constante de segunda ordem obtida da reação com ascorbato foi novamente à mesma ordem de grandeza (103 M-1s-1). Em conclusão, a redução de ácidos sulfênicos presentes nas Prxs por ascorbato pode ser considerada relevante em compartimentos subcelulares em que este redutor esteja presente em grandes quantidades. Além disso, o ascorbato pode reduzir ácidos sulfênicos de outras proteínas, e esta interação pode representar uma nova via na biologia redox que ainda precisa ser explorada in vivo / Peroxiredoxins (Prxs) are enzymes that play central roles in cellular redox metabolism, since they reduce peroxides with extraordinary rates and are abundant proteins. Prxs are found in all kingdoms with multiple isoforms, performing multiple functions such as antioxidants, molecular chaperones, and regulators of signal transduction. Prxs are Cys-based, thiol-dependent peroxidases with remarkable catalytic efficiency that can be divided into 1-Cys or 2-Cys, depending on the number of Cys residues involved in catalysis. Initially, reduction of Prxs was described to be strictly dependent on thiols, but later we showed that ascorbate can also reduce the sulfenic intermediate of 1-Cys Prx (1-Cys Prx-SOH) from various organisms. These data represented a breakthrough in the thiol-specific antioxidant paradigm, as ascorbate can also reduce sulfenic acids in 1-Cys Prx. To gain evidences that ascorbate could be a biological reductant for 1-Cys Prx it was necessary to determinate the respective second order rate constant, since in cells other compounds might compete with this antioxidant. Due to technical issues, this was a challenge for many years. In this work, we describe the kinetic characterization of sulfenic acid reduction by ascorbate in several proteins. Firstly, the reduction of 1-Cys Prx-SOH by ascorbate was analyzed using an enzyme from A. fumigatus (AfPrxA) that is 37% similar to PRDX6 (human 1-Cys Prx) and was quite stable. Initially, a steady-state, bi-substrate approach was followed by means of a specific H2O2 electrode (Free Radical Analyzer 4100, World Precision Instruments Inc.). AfPrxA decomposed H2O2 in an ascorbate dependent manner with good efficiency (kcat/KM asc = 7.4 x103 M-1s-1), through a Bi-Bi Ping-Pong mechanism. To further support these findings, we developed an independent, competitive kinetic approach based on the competition between dichlorophenolindophenol (DCPIP) and sulfenic acid to ascorbate. DCPIP is a redox sensor, whose blue color is lost when reduced. Firstly, we confirmed that in our conditions DCPIP was reduced by ascorbate with a second-order rate constant of 718 M-1s-1, similar to values previously described. This procedure validated our assay conditions and allowed us to proceed in the competitive method for the determination of the second order rate constant of the reaction of AfPrxA-SOH with ascorbate (1,5 x 103M-1s-1) at pH 7.44, 25ºC by pseudo first order approach. Therefore, by two independent approaches, we showed that ascorbate reduced AfPrxA-SOH with rate constants in the 103 M-1s-1 range. It also allowed us to determine the second order rate constants for the reduction 1-Cys Prxs from other organisms such as bacteria, yeast, plant and mammal. In all cases, the rate constants were in the 103 M-1s-1 range. Subsequently, we analyzed whether a recombinant yeast 2-Cys Prx (Tsa1), whose resolving Cys (Cysr) was mutated to a serine residue (Tsa1-C170S) acquired the ascorbate dependent activity. Again, the sulfenic acid form of Tsa1-C170S was reduced by ascorbate in the same 103 M-1s-1 range. In addition, we decided to investigate the reduction of Cys-SOH by ascorbate in other proteins like glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Papain that also have a sulfenic acid as product of their oxidation. The second order rate constants obtained for the reaction with ascorbate were again in the same range (103 M-1s-1). In conclusion, the reduction of sulfenic acids present in Prx by ascorbate might be relevant in the subcellular compartments in which this reductant is present at high levels, capable to compete with other reductants. Furthermore, ascorbate can reduce sulfenic acid in other proteins, and this interaction may represent a new route in redox biology that has yet be explored in vivo