Peptídeos com ação inibitória sobre a enzima conversora de angiotensina I (ECA) e com o potencial de reduzir a pressão arterial têm sido obtidos a partir de diferentes tipos de alimentos ou matérias-primas, sendo grande o interesse em aproveitar resíduos da indústria alimentícia como fontes desses peptídeos. Neste aspecto, as amêndoas de cupuaçu (Theobroma grandiflorum S.), que são em sua maioria descartadas pela indústria, apresentam um teor considerável de proteínas e poderiam ser aproveitadas como fontes de peptídeos inibidores da ECA. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar se o concentrado proteico obtido a partir de amêndoas fermentadas de cupuaçu após ser submetido à hidrólise com a enzima pepsina poderia gerar peptídeos com ação inibitória sobre a ECA in vitro. Foi observado que após a hidrólise do concentrado proteico com pepsina por 1h foi obtido um efeito de 50 % de inibição da ECA, em ensaio realizado com o substrato Abz-FRK(Dnp)-P-OH. Posteriormente, esse hidrolisado foi submetido ao fracionamento por cromatografia em fase reversa (RP-HPLC) e resultou em cinco frações (F1-F5), das quais a terceira teve uma subfração (F3.1) com quatro novos peptídeos identificados por LC-MS/ MS com potencial em inibir a ECA. Esses quatro peptídeos (FWVAM, YRLAF, LGYFK, VTTVVTGLTF) foram sintetizados e submetidos aos ensaios para a determinação do IC50 e Ki. Os peptídeos YRLAF e LGYFK, que apresentaram mecanismo de inibição do tipo competitivo e acompetitivo, respectivamente, tiveram valores de IC50 de 4.73 e 11.11µM, e de Ki de 9.14 e 8.15 µM. Dentre os peptídeos identificados merece destaque VTTVVTGLTF que demonstrou ser um inibidor do tipo acompetitivo e apresentou as menores IC50 (0.70 µM) e Ki (2.79 µM). Em contraste, FWVAM atuou como substrato da ECA e não peptídeo inibidor. A partir dos resultados obtidos neste estudo fica demonstrado que as amêndoas fermentadas de cupuaçu podem ser fonte de peptídeos com ação inibitória da ECA, com potencial efeito anti-hipertensivo a ser, futuramente, investigado a partir de estudos in vivo. / Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides with the potential to reduce blood pressure have been obtained from different types of food or raw materials, and there is a great interest in utilize residues from the food industry as sources of peptides. In this regard, cupuassu almonds (Theobroma grandiflorum S.), which are mostly discarded by the industry, has a considerable protein content and could be used as source of ACE-inhibiting peptides. Thus, the objective of this work was to verify if the protein concentrate obtained from fermented almonds of cupuassu after being submitted to the hydrolysis with the enzyme pepsin could generate peptides with inhibitory activity on ACE in vitro. In this study it was observed that after hydrolysis of the protein concentrate with pepsin for 1 h, a 50% effect of ACE inhibition was obtained in an assay performed with the Abz-FRK (Dnp) -P-OH substrate. Posteriorly, the hydrolyzate was subjected to fractionation by reverse phase chromatography (RP-HPLC) and resulted in five fractions (F1-F5), of which the third had a subfraction (F3.1) with four new peptides identified by LC-MS / MS with the potential to inhibit ACE. These four peptides (FWVAM, YRLAF, LGYFK, VTTVVTGLTF) were synthesized and assayed for IC50 and Ki. The YRLAF and LGYFK peptides, which showed a competitive and uncompetitive type inhibition mechanism respectively, presented IC50 values of 4.73 and 11.11µM, and the values for Ki were 9.14 and 8.15 µM. Among the peptides identified, it is possible to highlight VTTVVTGLTF, which was shown to be an inhibitor of the uncompetitive type and presented the lowest value for IC50 (0.70 µM) and Ki (2.79 µM). While FWVAM acted as a substrate of the ACE and not as an inhibitory peptide. From the results obtained in this study it is demonstrated that cupuassu fermented almonds can be a source of peptides with ACE inhibitory activity with potential antihypertensive effect to be further investigated from in vivo studies.

Peptídeos com ação inibitória sobre a enzima conversora de angiotensina I (ECA) e com o potencial de reduzir a pressão arterial têm sido obtidos a partir de diferentes tipos de alimentos ou matérias-primas, sendo grande o interesse em aproveitar resíduos da indústria alimentícia como fontes desses peptídeos. Neste aspecto, as amêndoas de cupuaçu (Theobroma grandiflorum S.), que são em sua maioria descartadas pela indústria, apresentam um teor considerável de proteínas e poderiam ser aproveitadas como fontes de peptídeos inibidores da ECA. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar se o concentrado proteico obtido a partir de amêndoas fermentadas de cupuaçu após ser submetido à hidrólise com a enzima pepsina poderia gerar peptídeos com ação inibitória sobre a ECA in vitro. Foi observado que após a hidrólise do concentrado proteico com pepsina por 1h foi obtido um efeito de 50 % de inibição da ECA, em ensaio realizado com o substrato Abz-FRK(Dnp)-P-OH. Posteriormente, esse hidrolisado foi submetido ao fracionamento por cromatografia em fase reversa (RP-HPLC) e resultou em cinco frações (F1-F5), das quais a terceira teve uma subfração (F3.1) com quatro novos peptídeos identificados por LC-MS/ MS com potencial em inibir a ECA. Esses quatro peptídeos (FWVAM, YRLAF, LGYFK, VTTVVTGLTF) foram sintetizados e submetidos aos ensaios para a determinação do IC50 e Ki. Os peptídeos YRLAF e LGYFK, que apresentaram mecanismo de inibição do tipo competitivo e acompetitivo, respectivamente, tiveram valores de IC50 de 4.73 e 11.11µM, e de Ki de 9.14 e 8.15 µM. Dentre os peptídeos identificados merece destaque VTTVVTGLTF que demonstrou ser um inibidor do tipo acompetitivo e apresentou as menores IC50 (0.70 µM) e Ki (2.79 µM). Em contraste, FWVAM atuou como substrato da ECA e não peptídeo inibidor. A partir dos resultados obtidos neste estudo fica demonstrado que as amêndoas fermentadas de cupuaçu podem ser fonte de peptídeos com ação inibitória da ECA, com potencial efeito anti-hipertensivo a ser, futuramente, investigado a partir de estudos in vivo. / Angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory peptides with the potential to reduce blood pressure have been obtained from different types of food or raw materials, and there is a great interest in utilize residues from the food industry as sources of peptides. In this regard, cupuassu almonds (Theobroma grandiflorum S.), which are mostly discarded by the industry, has a considerable protein content and could be used as source of ACE-inhibiting peptides. Thus, the objective of this work was to verify if the protein concentrate obtained from fermented almonds of cupuassu after being submitted to the hydrolysis with the enzyme pepsin could generate peptides with inhibitory activity on ACE in vitro. In this study it was observed that after hydrolysis of the protein concentrate with pepsin for 1 h, a 50% effect of ACE inhibition was obtained in an assay performed with the Abz-FRK (Dnp) -P-OH substrate. Posteriorly, the hydrolyzate was subjected to fractionation by reverse phase chromatography (RP-HPLC) and resulted in five fractions (F1-F5), of which the third had a subfraction (F3.1) with four new peptides identified by LC-MS / MS with the potential to inhibit ACE. These four peptides (FWVAM, YRLAF, LGYFK, VTTVVTGLTF) were synthesized and assayed for IC50 and Ki. The YRLAF and LGYFK peptides, which showed a competitive and uncompetitive type inhibition mechanism respectively, presented IC50 values of 4.73 and 11.11µM, and the values for Ki were 9.14 and 8.15 µM. Among the peptides identified, it is possible to highlight VTTVVTGLTF, which was shown to be an inhibitor of the uncompetitive type and presented the lowest value for IC50 (0.70 µM) and Ki (2.79 µM). While FWVAM acted as a substrate of the ACE and not as an inhibitory peptide. From the results obtained in this study it is demonstrated that cupuassu fermented almonds can be a source of peptides with ACE inhibitory activity with potential antihypertensive effect to be further investigated from in vivo studies.

Peptídeos com ação inibitória da enzima conversora da angiotensina I (ECA) podem ser obtidos a partir de diversos alimentos e exercer efeito anti-hipertensivo. O cupuaçu (Theobroma grandiflorum S.), fruto nativo da Amazônia, possui sementes comestíveis contendo proteína de reserva similar à do cacau (Theobroma cacao L.), as quais parecem ser fonte de peptídeos inibidores da ECA. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi investigar in vitro a ocorrência de peptídeos inibidores da ECA no hidrolisado proteico da semente de cupuaçu obtido por ação da Alcalase. O hidrolisado revelou o desaparecimento de proteínas entre 27 a 180 kDa, incluindo as globulinas, e o surgimento daquelas abaixo de 15 kDa após 2 h de hidrólise, indicando a formação de peptídeos menores. O ensaio de atividade utilizando o substrato Abz-FRK(Dnp)-P-OH revelou que o hidrolisado total promoveu 65% de inibição da ECA e esse pool peptídico foi fracionado em cinco frações (F1-F5) por cromatografia em fase reversa (RP-HPLC). Após a etapa de purificação, o monitoramento da inibição apontou, ao final, duas frações (3.2.8 e 3.4.10) com maior atividade inibitória. Oito peptídeos foram identificados por LC-MS/MS, sendo três deles já conhecidos como inibidores da ECA. Outros cinco novos peptídeos identificados (FLEK, GSGKHVSP, LDNK, MVVDKLF e MEKHS) foram sintetizados e tiveram sua ação inibitória validada por ensaios in vitro. O peptídeo GSGKHVSP apresentou a menor IC50 (3,11 µM) e Ki (0,74 µM), sendo um inibidor tipo misto quanto ao seu mecanismo de inibição revelado pelo gráfico de Lineweaver-Burk. Os resultados permitem concluir que o isolado proteico da semente de cupuaçu pode ser uma fonte para obtenção de peptídeos anti-hipertensivos, a despeito de serem necessárias investigações sobre a resistência desses peptídeos à digestão gastrointestinal e a eficácia da inibição in vivo. / Peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity may be obtained from several foods and cause antihypertensive effect. Cupuassu (Theobroma grandiflorum S.), a native fruit from Amazon, has edible seeds with a storage protein similar to that of cocoa (Theobroma cacao L.) which seems to have incrypted ACE inhibitor peptides. Thus, the aim of this project was to investigate the in vitro formation of ACE inhibitory peptides in protein hydrolysate from cupuassu seeds using Alcalase enzyme. The hydrolysate revealed the disappearance of proteins between 27 and 181 kDa after 2h hydrolysis, including the globulin, and the increase of those below 15 kDa, indicating the formation of peptides. The ACE inhibitory activity assays using the substrate Abz-FRK(Dnp)P-OH revealed the hydrolysate had 65% ACE inhibition and the pool of peptides was fractionated into five fractions (F1-F5) by reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). After the purification step, two fractions (3.2.8 e 3.4.10) exhibited the highest ACE-inhibitory activity. Eight peptides had been identified by LC-MS/MS and three of them were ACE inhibitors. The other newly identified peptides (FLEK, GSGKHVSP, LDNK, MVVDKLF and MEKHS) were synthesized and in vitro assayed for ACE inhibitory activity. The peptide GSGKHVSP had the lower IC50 (3.11 µM) and Ki (0.74 µM). Lineweaver-Burk plots suggest this peptide is a mixed-type inhibitor according to the inhibition mechanism. The results indicate that protein isolate from cupuassu seeds may be a good protein source of antihypertensive peptides and further investigation is needed in order to evaluate the resistance of these peptides to gastrointestinal digestion and the inhibitory activity in vivo.

Peptídeos com ação inibitória da enzima conversora da angiotensina I (ECA) podem ser obtidos a partir de diversos alimentos e exercer efeito anti-hipertensivo. O cupuaçu (Theobroma grandiflorum S.), fruto nativo da Amazônia, possui sementes comestíveis contendo proteína de reserva similar à do cacau (Theobroma cacao L.), as quais parecem ser fonte de peptídeos inibidores da ECA. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi investigar in vitro a ocorrência de peptídeos inibidores da ECA no hidrolisado proteico da semente de cupuaçu obtido por ação da Alcalase. O hidrolisado revelou o desaparecimento de proteínas entre 27 a 180 kDa, incluindo as globulinas, e o surgimento daquelas abaixo de 15 kDa após 2 h de hidrólise, indicando a formação de peptídeos menores. O ensaio de atividade utilizando o substrato Abz-FRK(Dnp)-P-OH revelou que o hidrolisado total promoveu 65% de inibição da ECA e esse pool peptídico foi fracionado em cinco frações (F1-F5) por cromatografia em fase reversa (RP-HPLC). Após a etapa de purificação, o monitoramento da inibição apontou, ao final, duas frações (3.2.8 e 3.4.10) com maior atividade inibitória. Oito peptídeos foram identificados por LC-MS/MS, sendo três deles já conhecidos como inibidores da ECA. Outros cinco novos peptídeos identificados (FLEK, GSGKHVSP, LDNK, MVVDKLF e MEKHS) foram sintetizados e tiveram sua ação inibitória validada por ensaios in vitro. O peptídeo GSGKHVSP apresentou a menor IC50 (3,11 µM) e Ki (0,74 µM), sendo um inibidor tipo misto quanto ao seu mecanismo de inibição revelado pelo gráfico de Lineweaver-Burk. Os resultados permitem concluir que o isolado proteico da semente de cupuaçu pode ser uma fonte para obtenção de peptídeos anti-hipertensivos, a despeito de serem necessárias investigações sobre a resistência desses peptídeos à digestão gastrointestinal e a eficácia da inibição in vivo. / Peptides with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity may be obtained from several foods and cause antihypertensive effect. Cupuassu (Theobroma grandiflorum S.), a native fruit from Amazon, has edible seeds with a storage protein similar to that of cocoa (Theobroma cacao L.) which seems to have incrypted ACE inhibitor peptides. Thus, the aim of this project was to investigate the in vitro formation of ACE inhibitory peptides in protein hydrolysate from cupuassu seeds using Alcalase enzyme. The hydrolysate revealed the disappearance of proteins between 27 and 181 kDa after 2h hydrolysis, including the globulin, and the increase of those below 15 kDa, indicating the formation of peptides. The ACE inhibitory activity assays using the substrate Abz-FRK(Dnp)P-OH revealed the hydrolysate had 65% ACE inhibition and the pool of peptides was fractionated into five fractions (F1-F5) by reversed phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). After the purification step, two fractions (3.2.8 e 3.4.10) exhibited the highest ACE-inhibitory activity. Eight peptides had been identified by LC-MS/MS and three of them were ACE inhibitors. The other newly identified peptides (FLEK, GSGKHVSP, LDNK, MVVDKLF and MEKHS) were synthesized and in vitro assayed for ACE inhibitory activity. The peptide GSGKHVSP had the lower IC50 (3.11 µM) and Ki (0.74 µM). Lineweaver-Burk plots suggest this peptide is a mixed-type inhibitor according to the inhibition mechanism. The results indicate that protein isolate from cupuassu seeds may be a good protein source of antihypertensive peptides and further investigation is needed in order to evaluate the resistance of these peptides to gastrointestinal digestion and the inhibitory activity in vivo.