Atopische Dermatitis (Atopisches Ekzem) ist die häufigste Erkrankung der Haut, und sie ist mit der Entwicklung anderer schwerwiegenden atopischen Erkrankungen wie Lebensmittelallergien, allergischer Rhinitis, Heuschnupfen und Asthma vergesellschaftet. Inaktivierende Mutationen im Filaggrin (FLG) Gen zeigten die stärkste Assoziation mit dem Krankheitsbild der atopischen Dermatitis. FLG wird fast ausschließlich in der Epidermis der Haut ausgeprägt und trägt maßgeblich zur normalen Differenzierung von Keratinozyten und zur Integrität der Hautbarriere bei. Bi-allelische inaktivierende Mutationen in dem Gen verursachen die Hauterkrankung Ichthyosis vulgaris, bei es zu Ausbildung einer übermäßig trockenen und schuppigen Hautoberfläche kommt. Etwa die Hälfte aller Ichthyosis vulgaris Patienten entwickeln ebenfalls atopische Dermatitis im Laufe Ihres Lebens. Zusätzlich treten in Ichthyosis vulgaris Patienten häufiger atopische Krankheitsbilder auf als in Gesunden. Als Modell zur Erforschung molekularer Grundlagen der Pahtologie des atopischen Ekzemes und von Pathomechanismen der Atopie eignet sich die „flaky tail“ Mauslinie. Diese Mäuse entwickeln typische Merkmale einer systemischen Atopie wie z.B. einen Barriere Defekt der Haut, ein Hautekzem, eine Entzündung der Lunge, sowie erhöhte Mengen an Immunglobulin E im Serum. In diesem Modell wird die Krankheitsentwicklung durch zwei natürlich entstandene Mutationen in den Genen Flg und Tmem79 verursacht. Die das Gen Flg betreffende Mutation bewirkt eine reduzierte Expression, welche einen Ichthyosis vulgairs ähnlichen Phänotyp auslöst, der durch Schuppenartige („flaky“) Haut am Schwanz („tail“) gekennzeichnet ist (Flgft). Die Mutation im Tmem79 Gen bewirkt eine matte Fellfarbe und wird daher als „matted“ Mutation (Tmem79ma) bezeichnet. Obwohl die Mutationen in benachbarten Regionen des Maus Chromosoms 3 zu finden sind, konnten diese genetisch getrennt werden. Dadurch gelang es zu zeigen, dass allein die Tmem79ma Mutation ausreicht, um Ekzeme und systemische Atopie in Mäusen auszulösen. Nach Rückkreuzung der Flgft Mutation auf den pro-allergischen BALB/c genetischen Hintergrund entwickelten die Flgft/ft BALB/c Mäuse eine - Erkrankung ähnlich der atopischen Dermatitis, die ebenfalls von spontanem Asthma und hohen IgE Konzentrationen im Serum gekennzeichnet war. Beides sind Hauptmerkmale des sogenannten atopischen Marsches. Diese Versuche implizierten, dass Filaggrin eine wichtige Funktion im Schutz vor der Entwicklung von Atopie in Mäusen ausübt. Im Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurden nach dem Rückkreuzen von Flg knockout (Flg-/-) Mäusen auf den BALB/c Hintergrund nur ein transienter neonataler Ichthyose Phänotyp, aber keine Hautentzündung oder Atopie beobachtet. Um diese Diskrepanz besser zu verstehen, generierten wir Flg knockout Mäuse direkt im BALB/c Hintergrund. Diese genetisch reinen Flg-/-/BALB/c Mäuse rekapitulierten den neonatalen Ichthyose Phänotyp, und sie zeigten einen Barriere Defekt, der die perkutane Sensibilisierung förderte. Spontane Entzündungen der Haut oder systemische Atopie wurden allerdings nicht beobachtet. Um die genetische Ursache der Atopie in Flgft/ft BALB/c Mäusen zu verstehen, sequenzierten wir das Genom mittels PacBio long read sequencing und verglichen es mit dem BALB/c Referenzgenom. Überraschenderweise zeigte die Analyse, dass die kongenen Flgft/ft BALB/c Mäuse ebenfalls die Atopie-verursachende Tmem79ma Mutation im homozygoten Zustand trugen. Zuvor wurde berichtet, dass die Flgft und Tmem79ma Mutationen vor dem Rückkreuzen des Flgft Allels auf den BALB/c Hintergrund voneinander getrennt werden konnten. Unsere Beobachtungen erklären nun die phänotypische Diskrepanz zwischen den Flgft/ft BALB/c und den Flg-/-/BALB/c Mäusen. Die Daten implizieren, dass der alleinige Funktionsverlust von FLG keine Atopie auslöst und werden durch Beobachtungen in einem Teil der FLG-defizienten Ichthyosis vulgaris Patienten gestützt, die ebenfalls keine Atopie zeigen. Es ist trotzdem wahrscheinlich, dass der Verlust von Filaggrin im Zusammenspiel mit weiteren genetischen Barriere Defekten, wie z.B. Mutationen im Tmem79 Gen das Krankheitsbild der Atopie qualitativ beeinflusst.:Abbreviations 6 Summary 9 Zusammenfassung 11 Introduction 13 Skin 13 Epidermis 13 The immune system 15 Adaptive immune response effector mechanisms 17 Allergic diseases 19 Atopic march 19 Atopic dermatitis 19 Metabolics of AD skin 23 Filaggrin and AD 25 Current mouse models of barrier defect and AD 29 Induced AD mouse models 29 Transgenic and knock out (KO) AD mouse models 30 Inbred mouse strains spontaneously developing AD-like disease 31 Mouse models of FLG-deficiency 32 AD and microbiome 34 Aim 37 Material and methods 38 Generation of Flg-/- mice 38 Crispr targeting strategy 38 α-FLG Western Blot 39 Protein extract preparation 39 SDS Electrophoresis 39 α-FLG Immunofluorescence staining 40 PCR Typing 40 Isolation of genomic DNA from mouse tail tips 40 PCR typing strategy 41 H&E staining of neonatal mouse ear skin 42 Ear thickness measurement 44 Quantification of transepidermal water loss (TEWL) 44 Quantification of total and antigen-specific IgE 44 Whole back skin RNA Sequencing (RNA-Seq) 44 Sorting of basal ear skin keratinocytes for RNA extraction, by fluorescence-activated cell sorting (FACS) 45 Quantitative real time PCR (qRT-PCR) 47 Flow cytometric analysis of ear skin 48 Analysis of DO11.10+/4get transgenic T cell response to epicutaneous OVA immunization 49 Skin microbiome analysis 50 S.aureus colonization of Flg mutant mice 51 Long-term epicutaneous OVA treatment 52 Mapping of reads, assembly, annotation and variant calling 53 Statistical analysis 55 Results 56 Generation and validation of Flg-/-/ BALB/c mice 56 Large sequence deletions detected in Flg-mutant mice by PCR 56 Complete loss of FLG protein expression in Flg-/- mice 57 Flg-/-/BALB/c mice show a barrier-defective skin 59 FLG-deficient skin is devoid of inflammation 61 FLG-deficient skin shows age-related inside-out barrier defect 62 Mild T cell expansion and no other changes in the epidermal compartment of the Flg-/-/BALB/c mice 62 γδ T cell expansion in the whole ear skin suspensions of FLG-deficient mice 64 Lack of systemic atopy in FLG-deficient mice, as indicated by IgE quantification 67 S. aureus colonization does not trigger eczema or atopy in FLG-deficient mice 68 Sensitization with a protein Ag does not trigger inflammation in FLG-deficient mice 69 FLG-deficient skin shows age-related outside-in barrier defect 69 Mild inflammatory signature detected in Flg-/-/BALB/c back skin by RNA sequencing 71 Type 2 immune response signalling detected in Flg-/-/BALB/c ear skin keratinocytes by RNA sequencing 72 FLG-deficient ear skin shows elevated IL-1b expression 74 Reduced cutaneous commensal microbial diversity in FLG-deficient mice 75 Presence of atopy-causing Tmem79ma mutation in Flgft/ft BALB/c mouse genome account for phenotypic differences with our Flg-/-/BALB/c mice 76 Discussion 81 FLG-deficiency in mice does not trigger spontaneous atopic disease 81 FLG-deficiency in mice causes mild immunological perturbation 82 Atopic march, observed in Flgft/ft BALB/c congenic strain, can be explained by the presence of the matted mutation 88 Relevance of filaggrin deficiency for the pathogenesis of atopy in mouse and man 89 References 92 Acknowledgments 136 Erklärung zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 137 Erklärung über die Einhaltung der gesetzlichen Vorgaben 138