O arranjo oligomérico e as mudanças na estrutura polipeptídica podem influenciar fortemente na velocidade de auto-oxidação das hemoproteínas, assim como os diferentes nucleófilos que atuam neste processo em função do pH. No presente trabalho, a velocidade de auto-oxidação da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) em seu estado íntegro e do monômero d isolado é estudada em função do pH e na presença do ligante cianeto. O comportamento da curva cinética é dependente do pH, apresentando-se monofásico ou bifásico dependendo do estado de oligomerização da proteína. Assim, nos valores de pH que geram a dissociação oligomérica, a curva cinética foi bifásica. Na faixa de pH 5,9-7,3, que apresenta a proteína íntegra, foi verificado um comportamento cinético mono-exponencial. Em meio alcalino, a auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença dos ligantes hidroxila e/ou cianeto apresenta comportamento complexo, descrito pela combinação de duas cinéticas de primeira-ordem. O processo lento ocorre devido à auto-oxidação do monômero d e o processo rápido é atribuído ao trímero abc. Em pH 7,0, a cinética é mono-exponencial, indicando uma estrutura oligomérica altamente preservada. Em meio ácido, tanto a hemoglobina íntegra como o monômero d apresentam a auto-oxidação catalisada por próton. É observada, através das constantes de velocidade de auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença de cianeto, uma cooperatividade no processo rápido devido ao trímero da HbGp. Além disso, a influência do surfactante dodecil sulfato de sódio na auto-oxidação da HbGp é avaliada. Uma influência mais efetiva do SDS é constatada em pH 7,0, enquanto que, em pH 9,0, a dissociação oligomérica é a influência predominante. Provavelmente, esta diferença está relacionada ao ponto isoelétrico ácido da HbGp, que favorece a interação entre SDS e HbGp em pH 7,0, quando comparado ao pH 9,0. O mecanismo de auto-oxidação e as correlações entre a cinética e o arranjo oligomérico são discutidos em detalhes no presente trabalho. / The oligomeric assembly and the changes in the polypeptidic structure can to influence in the autoxidation rate of the heme proteins, as well as the different nucleophiles, which act in this process as a function of pH. In the present work, the autoxidation rate of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in integral state and of the isolated d monomer is studied as a function of pH and in the presence of the cyanide ligand. The kinetic decay behavior is dependent of pH, presenting mono-exponential or biexponential character, depending of the oligomeric state of the protein. Thus, in the pH values that originated the oligomeric dissociation, the kinetic decay was i-exponential. In the pH range 5.9 - 7.3, which show the whole protein, a monoexponential kinetic behavior was verified. In alkaline medium, the whole hemoglobin autoxidation in the presence of the hydroxyl and/or cyanide presents complex behavior described by the combination of two first order kinetics. The slow process occurs due to the d monomer autoxidation and the fast process is attributed to abc trimer. At pH 7.0, the kinetic is monoexponential,indicating a highly conserved oligomeric structure. In acid medium, both, the whole hemoglobin and the d monomer presented the proton-catalyzed autoxidation. A cooperativity in the fast process due to trimer of the HbGp can be observed, through the autoxidation rate constants of the whole hemoglobin in the presence of cyanide. Furthermore, the influence of the anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) in the HbGp autoxidation was evaluated. At pH 7.0, it was verified a more effective influence for SDS, while at pH 9.0, the oligomeric dissociation was the main influence. Probably, this difference is related to the acid isoelectric point of the HbGp, which favors the interaction between SDS and HbGp at pH 7.0, as compared with the pH 9.0. The autoxidation mechanism and the correlation between the kinetic and the oligomeric arrangement are discussed in details in the present work.

O arranjo oligomérico e as mudanças na estrutura polipeptídica podem influenciar fortemente na velocidade de auto-oxidação das hemoproteínas, assim como os diferentes nucleófilos que atuam neste processo em função do pH. No presente trabalho, a velocidade de auto-oxidação da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) em seu estado íntegro e do monômero d isolado é estudada em função do pH e na presença do ligante cianeto. O comportamento da curva cinética é dependente do pH, apresentando-se monofásico ou bifásico dependendo do estado de oligomerização da proteína. Assim, nos valores de pH que geram a dissociação oligomérica, a curva cinética foi bifásica. Na faixa de pH 5,9-7,3, que apresenta a proteína íntegra, foi verificado um comportamento cinético mono-exponencial. Em meio alcalino, a auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença dos ligantes hidroxila e/ou cianeto apresenta comportamento complexo, descrito pela combinação de duas cinéticas de primeira-ordem. O processo lento ocorre devido à auto-oxidação do monômero d e o processo rápido é atribuído ao trímero abc. Em pH 7,0, a cinética é mono-exponencial, indicando uma estrutura oligomérica altamente preservada. Em meio ácido, tanto a hemoglobina íntegra como o monômero d apresentam a auto-oxidação catalisada por próton. É observada, através das constantes de velocidade de auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença de cianeto, uma cooperatividade no processo rápido devido ao trímero da HbGp. Além disso, a influência do surfactante dodecil sulfato de sódio na auto-oxidação da HbGp é avaliada. Uma influência mais efetiva do SDS é constatada em pH 7,0, enquanto que, em pH 9,0, a dissociação oligomérica é a influência predominante. Provavelmente, esta diferença está relacionada ao ponto isoelétrico ácido da HbGp, que favorece a interação entre SDS e HbGp em pH 7,0, quando comparado ao pH 9,0. O mecanismo de auto-oxidação e as correlações entre a cinética e o arranjo oligomérico são discutidos em detalhes no presente trabalho. / The oligomeric assembly and the changes in the polypeptidic structure can to influence in the autoxidation rate of the heme proteins, as well as the different nucleophiles, which act in this process as a function of pH. In the present work, the autoxidation rate of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in integral state and of the isolated d monomer is studied as a function of pH and in the presence of the cyanide ligand. The kinetic decay behavior is dependent of pH, presenting mono-exponential or biexponential character, depending of the oligomeric state of the protein. Thus, in the pH values that originated the oligomeric dissociation, the kinetic decay was i-exponential. In the pH range 5.9 - 7.3, which show the whole protein, a monoexponential kinetic behavior was verified. In alkaline medium, the whole hemoglobin autoxidation in the presence of the hydroxyl and/or cyanide presents complex behavior described by the combination of two first order kinetics. The slow process occurs due to the d monomer autoxidation and the fast process is attributed to abc trimer. At pH 7.0, the kinetic is monoexponential,indicating a highly conserved oligomeric structure. In acid medium, both, the whole hemoglobin and the d monomer presented the proton-catalyzed autoxidation. A cooperativity in the fast process due to trimer of the HbGp can be observed, through the autoxidation rate constants of the whole hemoglobin in the presence of cyanide. Furthermore, the influence of the anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) in the HbGp autoxidation was evaluated. At pH 7.0, it was verified a more effective influence for SDS, while at pH 9.0, the oligomeric dissociation was the main influence. Probably, this difference is related to the acid isoelectric point of the HbGp, which favors the interaction between SDS and HbGp at pH 7.0, as compared with the pH 9.0. The autoxidation mechanism and the correlation between the kinetic and the oligomeric arrangement are discussed in details in the present work.

No presente trabalho, métodos analíticos empregando a eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato CE - C4D foram desenvolvidos para a determinação de diversas espécies no biodiesel e etanol combustível. A concentração das espécies inorgânicas (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, SO4 2- e PO4 3-) e glicerol no biodiesel são de interesse das agências reguladoras devido à capacidade dessas espécies em formar compostos indesejáveis no motor. A separação dos cátions foi realizada utilizando eletrólito de corrida (BGE) contendo 30 mmol L-1 de Ácido 2-N-morfolino-etanosulfônico (MES) / L-histidina, pH 6. A separação das espécies aniônicas foi realizada em BGE semelhante contendo 0,2 mmol L-1 brometo de cetiltrimetilamônio. Para a determinação do glicerol, que é uma espécie neutra, foi empregada uma etapa de oxidação utilizando periodato. Esta reação é específica para polióis e tem como um dos produtos o iodato. A quantidade de iodato produzida pela reação foi determinada por CE. A separação foi realizada em aproximadamente 1 min, utilizando BGE contendo 30 mmol L-1 de ácido acético, pH 3. Este trabalho também apresenta estudos sobre a formação de ácidos orgânicos de baixo PM durante a etapa de auto-oxidação do biodiesel, uma vez que esta etapa acarreta no aumento da viscosidade e acidez, ocasionando a formação de gomas e sedimentos e, conseqüentemente, o entupimento de filtros de combustíveis. As amostras foram oxidadas utilizando equipamento para teste de oxidação acelerada (Método Rancimat) e CE - C4D foi utilizada para a análise dos produtos iônicos formados. As principais espécies ácidas encontradas foram os ácidos acético e fórmico. Porém, outras espécies são formadas durante esta etapa, tais como os ácidos acrílico, glicólico, glioxílico, láctico e propiônico. Em particular, o ácido glicólico se mostrou uma espécie de grande importância prática, atuando como um marcador do estágio de oxidação do biodiesel, uma vez que este ácido somente é formado após o desencadeamento da auto-oxidação e, além do mais, esta espécie foi observada em amostras de biodiesel de diferentes origens (algodão, soja, palma e sebo bovido). Adicionalmente, métodos para a determinação de Cl-, SO4 2-, formiato, acetato, formaldeído e acetaldeído em etanol combustível são descritos. A separação foi realizada em BGE contendo 20 mmol L-1 de MES / L-histidina e 0,1 mmol L-1 hidróxido de cetiltrimetilamônio, pH 6. Para a separação dos aldeídos por CE, foi realizada a derivatização com bissulfito. O presente trabalho também apresenta um método alternativo para a determinação do teor de água e de álcool em amostras de etanol combustível. A estratégia descrita é baseada na formação de monoalquil carbonatos (MAC) produzidos pela reação de um álcool e o bicarbonato em meio aquoso. / In this work, methods employing capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection (CE - C4D) are introduced for the determination of several species in biodiesel and ethanol fuel. The concentrations of inorganic species (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, SO4 2-, and PO43-) and glycerol are of interest for the regulatory authorities due to their ability to form undesirable compounds in the engines. The separation of the cations was done in BGE composed of 30 mmol L-1 of 2-N-morpholino-ethanesulfonic acid (MES)/L-histidine, pH 6. The separation of anionic species was carried out in similar BGE including cetyltrimethylammonium bromide (0.2 mmol L-1). For glycerol, a neutral species, its oxidation with periodate was employed. This well-known reaction is specific to polyols and generates iodate. The amount of iodate produced by the reaction was determined by CE. The separation was carried out in ca. 1 min using BGE composed of 30 mmol L-1 of acetic acid, pH 3. This work also presents studies on the formation of low molecular organic acids during the biodiesel autoxidation step. Since the implications of the biodiesel oxidation are the increased viscosity and acidity, causing formation of insoluble gums and sediments that induce the clogging of the fuel filters. The samples were oxidized using equipment for accelerated oxidation test (Rancimat Method) and CE-C4D was used to analyze the ionic products. The main acid species were acetic and formic acids. However, acrylic, glyoxylic, glycolic, lactic, and propionic acids were also observed only after the oxidation step. Thus, these species are candidates for quality markers for biodiesel. In particular, glycolic acid seems to be a good marker, because it is produced only after auto-oxidation started. Moreover, it was found out in biodiesel of different origins (cotton, soy, palm, and animal fat). In addition, alternative methods to determination of Cl-, SO42-, formate, acetate, formaldehyde and acetaldehyde in ethanol fuel are described. The separation was done in BGE composed of 20 mmol L-1 of MES / L-histidine, and 0.1 mmol L-1 cetyltrimethylammonium hydroxide, pH 6. For aldehydes, a neutral species, a derivatization step with bisulfite was employed. The present work also shows an alternative method for analysis of alcohol and water percentage in fuel samples employing CE - C4D in order to achieve the limits established by regulatory authorities. The strategy is based on the formation of monoalkyl carbonates (MAC) produced by the reaction of an alcohol and bicarbonate in aqueous medium.

No presente trabalho, métodos analíticos empregando a eletroforese capilar com detecção condutométrica sem contato CE - C4D foram desenvolvidos para a determinação de diversas espécies no biodiesel e etanol combustível. A concentração das espécies inorgânicas (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, SO4 2- e PO4 3-) e glicerol no biodiesel são de interesse das agências reguladoras devido à capacidade dessas espécies em formar compostos indesejáveis no motor. A separação dos cátions foi realizada utilizando eletrólito de corrida (BGE) contendo 30 mmol L-1 de Ácido 2-N-morfolino-etanosulfônico (MES) / L-histidina, pH 6. A separação das espécies aniônicas foi realizada em BGE semelhante contendo 0,2 mmol L-1 brometo de cetiltrimetilamônio. Para a determinação do glicerol, que é uma espécie neutra, foi empregada uma etapa de oxidação utilizando periodato. Esta reação é específica para polióis e tem como um dos produtos o iodato. A quantidade de iodato produzida pela reação foi determinada por CE. A separação foi realizada em aproximadamente 1 min, utilizando BGE contendo 30 mmol L-1 de ácido acético, pH 3. Este trabalho também apresenta estudos sobre a formação de ácidos orgânicos de baixo PM durante a etapa de auto-oxidação do biodiesel, uma vez que esta etapa acarreta no aumento da viscosidade e acidez, ocasionando a formação de gomas e sedimentos e, conseqüentemente, o entupimento de filtros de combustíveis. As amostras foram oxidadas utilizando equipamento para teste de oxidação acelerada (Método Rancimat) e CE - C4D foi utilizada para a análise dos produtos iônicos formados. As principais espécies ácidas encontradas foram os ácidos acético e fórmico. Porém, outras espécies são formadas durante esta etapa, tais como os ácidos acrílico, glicólico, glioxílico, láctico e propiônico. Em particular, o ácido glicólico se mostrou uma espécie de grande importância prática, atuando como um marcador do estágio de oxidação do biodiesel, uma vez que este ácido somente é formado após o desencadeamento da auto-oxidação e, além do mais, esta espécie foi observada em amostras de biodiesel de diferentes origens (algodão, soja, palma e sebo bovido). Adicionalmente, métodos para a determinação de Cl-, SO4 2-, formiato, acetato, formaldeído e acetaldeído em etanol combustível são descritos. A separação foi realizada em BGE contendo 20 mmol L-1 de MES / L-histidina e 0,1 mmol L-1 hidróxido de cetiltrimetilamônio, pH 6. Para a separação dos aldeídos por CE, foi realizada a derivatização com bissulfito. O presente trabalho também apresenta um método alternativo para a determinação do teor de água e de álcool em amostras de etanol combustível. A estratégia descrita é baseada na formação de monoalquil carbonatos (MAC) produzidos pela reação de um álcool e o bicarbonato em meio aquoso. / In this work, methods employing capillary electrophoresis with capacitively coupled contactless conductivity detection (CE - C4D) are introduced for the determination of several species in biodiesel and ethanol fuel. The concentrations of inorganic species (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, SO4 2-, and PO43-) and glycerol are of interest for the regulatory authorities due to their ability to form undesirable compounds in the engines. The separation of the cations was done in BGE composed of 30 mmol L-1 of 2-N-morpholino-ethanesulfonic acid (MES)/L-histidine, pH 6. The separation of anionic species was carried out in similar BGE including cetyltrimethylammonium bromide (0.2 mmol L-1). For glycerol, a neutral species, its oxidation with periodate was employed. This well-known reaction is specific to polyols and generates iodate. The amount of iodate produced by the reaction was determined by CE. The separation was carried out in ca. 1 min using BGE composed of 30 mmol L-1 of acetic acid, pH 3. This work also presents studies on the formation of low molecular organic acids during the biodiesel autoxidation step. Since the implications of the biodiesel oxidation are the increased viscosity and acidity, causing formation of insoluble gums and sediments that induce the clogging of the fuel filters. The samples were oxidized using equipment for accelerated oxidation test (Rancimat Method) and CE-C4D was used to analyze the ionic products. The main acid species were acetic and formic acids. However, acrylic, glyoxylic, glycolic, lactic, and propionic acids were also observed only after the oxidation step. Thus, these species are candidates for quality markers for biodiesel. In particular, glycolic acid seems to be a good marker, because it is produced only after auto-oxidation started. Moreover, it was found out in biodiesel of different origins (cotton, soy, palm, and animal fat). In addition, alternative methods to determination of Cl-, SO42-, formate, acetate, formaldehyde and acetaldehyde in ethanol fuel are described. The separation was done in BGE composed of 20 mmol L-1 of MES / L-histidine, and 0.1 mmol L-1 cetyltrimethylammonium hydroxide, pH 6. For aldehydes, a neutral species, a derivatization step with bisulfite was employed. The present work also shows an alternative method for analysis of alcohol and water percentage in fuel samples employing CE - C4D in order to achieve the limits established by regulatory authorities. The strategy is based on the formation of monoalkyl carbonates (MAC) produced by the reaction of an alcohol and bicarbonate in aqueous medium.