Orientador: Hélio José Montassier / Banca: José Moacir Marin / Banca: Liana Brentano / Resumo: Um método de diagnóstico baseado na associação entre as técnicas de RT-PCR e ELISA foi desenvolvido para a detecção do vírus da bronquite infecciosa das aves (VBI). Inicialmente, a especificidade e a sensibilidade analíticas dessa técnica, bem como dos métodos de RT-PCR e Nested-RT-PCR, foram determinadas, tendo-se demonstrado, para o primeiro parâmetro, apenas a detecção do VBI, enquanto que outros vírus heterólogos aviários testados, tais como pneumovírus aviário (APV / estirpe do grupo B), vírus da doença de Newcastle (NDV / estirpe La Sota) e vírus da doença de Gumboro (GDV - estirpe Lukert), não foram detectados. Quanto à avaliação da sensibilidade analítica dos métodos empregados neste estudo foi constatado que o RT-PCR-ELISA demonstrou ser 10 vezes mais sensível do que a RT-PCR, enquanto que a reação de Nested-PCR foi 100 vezes mais sensível que a RT-PCR e 10 vezes mais sensível que o RT-PCR-ELISA. A técnica de RT-PCR-ELISA, juntamente com os outros dois métodos de biologia molecular, foram aplicadas para a detecção das estirpes H-120 e A034 do VBI, em amostras de pulmão e traquéia obtidas de aves experimentalmente infectadas com essas duas estirpes virais. Os resultados obtidos nos diferentes métodos de biologia molecular foram comparados entre si e com a técnica padrão de isolamento viral em ovos embrionados, verificando-se que o RT-PCR-ELISA revelou-se tão específico quanto as técnicas de isolamento viral e Nested-PCR, porém foi menos sensível do que esses mesmos métodos na detecção do VBI. A técnica de RT-PCR-ELISA, utilizada pela primeira vez para o VBI, demonstrou o potencial de se constituir uma alternativa viável para um diagnóstico direto mais rápido e específico do VBI. / Abstract: A molecular biology method for the detection of avian infectious bronchitis virus (IBV) was developed combining the reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Firstly, the analytical specificity and sensitivity of RT-PCR-ELISA, RT-PCR and Nested-RT-PCR were assessed. The specificity of these methods were confirmed since only IBV was detected, while other heterologous avian viral pathogens such as pneumovirus (Group B), Newcastle disease virus (LaSota strain) and gumboro disease virus (Lukert strain) were not detected by these techniques. The sensitivity of these methods was established, indicating that the RT-PCR-ELISA was about ten times more sensitive than conventional RT-PCR, while Nested-PCR was a hundred more sensitive than RT-PCR and ten times more sensitive than PCR-ELISA. The RT-PCR-ELISA and the two molecular biology methods were also applied for the detection of IBV strains H-120 and A034, in lung and tracheal tissue samples collected from experimentally infected chickens. The results of these different methods were also compared with the standard diagnostic technique, the virus isolation in chicken embryonated eggs, showing that RT-PCR-ELISA was as specific as virus isolation and Nested-PCR, however it was less sensitive than these methods for the IBV detection. The RT-PCR-ELISA, applied for the first time for IBV detection and direct diagnosis in tissue samples, can be potentially applied as an useful alternative for the rapid and specific diagnosis of IBV. / Mestre

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho / Banca: Clarice Weins Arns / Banca: Geraldo Aleixo da Silva Passos Júnior / Banca: Liana Brentano / Resumo: As respostas imunes inatas e adquiridas, incluindo-se aí tanto as mediadas por fatores humorais como celulares normalmente induzidas após a infecção ou vacinação com o vírus da BI (VBI), são caracterizadas por sua grande complexidade e por aspectos relevantes que ainda são pouco conhecidos, no que tange aos elementos capazes de exercer uma ou mais ações efetoras contra esse patógeno e que culminassem na restrição da replicação viral, seguido de sua eliminação do organismo hospedeiro e também no impedimento de lesões mais severas. Isso posto, foi formulado o presente estudo com o fito principal de fazer a avaliação das respostas imunes humorais e celulares em diferentes intervalos pós-desafio com o VBI de aves previamente vacinadas ou não, realizando-se a mensuração de anticorpos no soro e na lágrima, e a quantificação da expressão de genes relacionados às respostas imunes na superfície traqueal, a fim de correlacionar tais parâmetros com o estado de proteção ao desafio. Os resultados demonstraram que os aumentos significativos nos níveis de anticorpos lacrimais dos isótipos IgG e IgA nas aves previamente vacinadas e também na expressão dos genes relacionados às respostas imunes, sobretudo o CD8, a Granzima A e o IFNg foram correlacionados negativamente com um ou mais parâmetros de alterações patológicas traqueais. Constatou-se também, que a memória das respostas imunes humorais e cito-mediadas conferida por uma única vacinação contra a BI no primeiro dia de idade é dependente da dose vacinal administrada / Abstract: Avian infectious bronchitis virus (IB) is a worldwide infectious disease which causes significant economic losses in poultry industry. The innate and acquired immune responses, including whether there mediated by both cellular and humoral factors that are induced after infection or vaccination with IB virus (IBV) are characterized by their higher complexity and for the relevant aspects that are still poorly known, with respect to the elements able to exercise one or more actions against the pathogen and that culminate in the restriction of its propagation and also on your clearance of the host organism. So, this project was formulated with the main done to make the evaluation of cellular and humoral immune responses at different intervals post-immunization or postchallenge with IBV poultry previously vaccinated or not, performing the measurement of antibodies in serum or tears and quantitation of the expression of genes related to immune responses in tracheal surface, correlating these parameters with the protection against IBV. The results showed that both significative increase of IgG and IgA isotypes in tears of previously vaccinated chickens and the expression levels of genes related to immune responses, especially CD8, Granzyme A and IFN g were negatively correlated with one or more parameters of pathological lesions at trachea. Moreover, we found that the immune memory conferred by vaccination against BI on the first day of age is dependent on vaccine dose administered / Doutor