Dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), l’activation anormale de nombreuses voies de signalisation intracellulaires favorise la croissance et la survie des cellules tumorales. L’amélioration des connaissances biologiques de ces pathologies hétérogènes, dont le pronostic est réservé, devrait permettre le développement de thérapies ciblées. La kinase oncogénique mTOR est présente au sein de deux complexes, parmi lesquels mTORC1, activé constitutivement dans la majorité des blastes primaires de patients porteurs de LAM, qui contrôle la synthèse protéique, et mTORC2 activé constitutivement dans 50% des LAM. Les inhibiteurs allostériques de mTORC1 (la rapamycine et ses dérivés) n’inhibent pas la phosphorylation du répresseur traductionnel 4E-BP1, ne diminuent pas la traduction et induisent peu d’apoptose in vitro dans les LAM. Utilisés en monothérapie, leur effet est décevant. De plus ces inhibiteurs n’agissent pas sur le complexe mTORC2. J’ai étudié l’effet d’un inhibiteur catalytique de mTOR, l’AZD8055, actif sur les deux complexes. In vitro, l’AZD8055 inhibe efficacement la signalisation en aval de mTORC1 et de mTORC2, dont les sites de phosphorylation de 4E-BP1 résistants à la rapamycine, ainsi que la synthèse protéique. Il diminue la prolifération, bloque le cycle cellulaire en phase G0G1 et induit une apoptose caspase-dépendante dans les blastes primaires de LAM. Il diminue également la clonogénicité des progéniteurs leucémiques, sans affecter celle des cellules CD34+ normales. Dans un modèle murin de xéno-transplantation, l’AZD8055 inhibe la croissance tumorale et améliore la survie des souris traitées. Je me suis également intéressée à la régulation de l’activité de mTORC1 par les acides aminés. Dans les cellules de mammifères, l’activation de mTORC1 nécessite la présence de glutamine et de leucine qui agissent en coopération via deux transporteurs membranaires, SLC1A5 et SLC7A5/SLC3A2. J’ai montré que la privation en glutamine, obtenue par l’activité glutaminase de la drogue L-asparaginase ou par l’utilisation de milieux de culture spécifiques dépourvus sélectivement en acides aminés, inhibe l’activation de mTORC1 et induit de l’apoptose dans diverses lignées leucémiques et dans les blastes primaires de LAM. La L-asparaginase inhibe la synthèse protéique et ses effets fonctionnels sont liés à son activité glutaminase. J’ai pu également constater une augmentation de l’expression protéique de la glutamine synthase induite par la Lasparaginase, dont l’inhibition majore l’apoptose induite par la L-asparaginase dans certaines lignées leucémiques. J’ai également étudié l’effet de l’inhibition spécifique par un shARN inductible du transporteur SLC1A5, qui permet l’import de glutamine. L’inhibition de SLC1A5 bloque la réactivation de mTORC1 par l’association leucine/glutamine après privation et induit de l’apoptose dans la lignée leucémique MOLM14. Cette inhibition diminue la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe / Acute myeloid leukaemias (AML) are heterogeneous diseases associated with poor prognosis. In AML, aberrant activation of many signaling pathways enhances proliferation and survival of leukemic blast cells. Understanding the mechanisms underlying survival of tumoral cells should allow the development of targeted therapies. The oncogenic kinase mTOR belongs to two distinct multimeric complexes. MTORC1 that controls protein translation, is constitutively activated in most of primary blast cells at AML diagnosis, while mTORC2 is constitutively activated in about half of AML samples. In AML, some phosphorylation events of the translational repressor 4E-BP1, are resistant to allosteric inhibitors of mTORC1 including rapamycin and its analogs. These first generation inhibitors of mTORC1 have only few effects on AML and do not induce significant apoptosis in vitro. I have tested a second generation mTOR kinase inhibitor active on both mTORC1 and mTORC2 complexes. In vitro, AZD8055 blocked mTORC1 and mTORC2 signaling, including 4E-BP1 rapamycin resistant phosphorylation events and protein synthesis. This compound decreased AML blast cells proliferation and cell cycle progression, reduced the clonogenic growth of leukemic progenitors and induced caspase-dependant apoptosis in leukemic cells but not in normal immature CD34+ cells. Finally, AZD8055 reduced tumor growth and improved survival in xenografted mouse model. In the second part of this work, I have studied the regulation of mTORC1 by amino acids in AML. In mammalian cells, activation of mTORC1 requires the presence of glutamine and leucine acting together via two membrane transporters, SLC1A5 and SLC7A5/SLC3A2. I showed that glutamine deprivation, obtained by L-asparaginase glutaminase activity or specific alpha-MEM use, inhibited mTORC1 and induced apoptosis in AML cell lines and primary AML blasts. L-asparaginase also inhibited protein synthesis and I have observed a correlation between the functional effects of L-asparaginase and its glutaminase activity. L-asparaginase induced an up-regulation of glutamine synthase (GS) protein and shRNA-induced GS inhibition increased L-asparaginase-dependant apoptosis in the MV4-11 AML cell line. I have also studied the effects of SLC1A5 inhibition with an inducible shRNA expressed in MOLM14 cells. Inhibition of this high afffinity transporter for glutamine blocked mTORC1 stimulation by leucine and glutamine after deprivation and induced apoptosis in MOLM-14 cell line. SLC1A5 inhibition reduced tumor growth and improved survival in transplanted mice

Les triacylglycérol (TAG) est un métabolite hautement énergétique qui peut être facilement converti en biodiesel. Les TAG peuvent être produits à partir de plantes et de microalgues. L'étude des voies de signalisation de l'énergie peut offrir de nouvelles stratégies pour améliorer l'accumulation de biomasse et de TAG sans compromettre la croissance. Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle de deux voies principales de signalisation énergétique: la voie du de guanosine ppGpp (guanosine penta(tétra) phosphate) dans le chloroplaste et la voie de TOR (Target of rapamycin) dans le cytosol. J'ai choisi de travailler sur la mousse Physcomitrella patens, un modèle d'eucaryote photosynthétique en raison de sa position évolutive entre les algues et les plantes vasculaires. Pour étudier le rôle du ppGpp, nous avons créé des lignées transgéniques exprimant de manière inductible une ppGpp synthase et sur-accumulant le ppGpp. J'ai trouvé que l'induction de SYN provoque une forte inhibition de la capacité photosynthétique en raison de l'inhibition de l'expression des protéines clés codées par les chloroplastes et aussi une réorganisation des membranes thylakoïdes. Pour l’étude de TOR nous avons traité la mousse avec des inhibiteurs de TOR et montré que cela provoque l’inhibition de la croissance de manière dose dépendante et l’accumulation de TAG. L’utilisation des marqueurs lipidiques a révélé la perte de petites vésicules associées à la croissance et l'accumulation de plus grandes structures de corps lipidiques. Des études supplémentaires permettront de développer des stratégies pour améliorer la production de biocarburants chez les organismes photosynthétiques. / Triacylglycerol (TAG) is a highly energetic metabolite that can be easily converted into biodiesel. TAG can be produced from both plants and microalgae. However, plants have low TAG yields in their dominant vegetative tissues. Microalgae can accumulate high amounts of TAG, but only under stress, leading to growth inhibition and limiting yield. The study and manipulation of stress and energy signaling pathways can offer new strategies to improve biomass and TAG accumulation without compromising growth. In this thesis, I studied the role of two major energy signaling pathways: the guanosine penta(tetra) phosphate (ppGpp) pathway in the chloroplast and the target of rapamycin (TOR) pathway in the cytosol. I chose to work on the moss Physcomitrella patens which is an interesting model of photosynthetic eukaryote because of its evolutionary position between algae and vascular plants. To study the role of ppGpp we created transgenic lines that inducibly express a ppGpp synthase and over-accumulate ppGpp. I found that ppGpp accumulation causes a strong inhibition of photosynthetic capacity due to the inhibition of the expression of key chloroplast encoded proteins, and also reorganization of the thylakoid membrane system into super grana. For the TOR pathway, we treated P. patens protonema with active site TOR inhibitors and showed that this cause growth inhibition in a dose dependent manner and is accompanied by TAG accumulation. The use of lipid dyes reveals a shift from small growth associated vesicles to a larger oil body structures after treatment. Further studies will allow the development of new strategies for improving biofuel production in photosynthetic organisms.

Pemetrexed (PTX), an antifolate drug, has been approved by the US FDA for first line therapy of mesothelioma and non-small cell lung cancer. In addition to its primary site of action on thymidylate synthase (TS), PTX also inhibits the second folate-dependent enzyme of purine biosynthesis aminoimidazolecarboxamide ribonucleotide formyltransferase (AICART). The accumulation of the substrate for AICART, ZMP, in PTX-inhibited cancer cells leads to activation of AMP-activated protein kinase (AMPK) with subsequent inhibition of mammalian target of rapamycin (mTOR) and hypophosphorylation of its downstream targets responsible for protein synthesis and cell proliferation. Inhibitors of mTORC1 like Rapamycin and its analogs (rapalogs) have only partial effects on tumor cells as they do not inhibit mTORC2, which phosphorylates Akt subsequently relieving the inhibition of mTORC1, thus leading to poor cytotoxicity by rapalogs. AMPK exerts control on mTORC1 kinase activity and PTX mediated activation of AMPK leads to its subsequent downregulation and hence, would be expected to have a therapeutic interaction with direct mTOR inhibitors. AZD8055, an ATP-competitive inhibitor of mTOR kinase, potently inhibits both mTORC1 and mTORC2 and therefore, can overcome the feedback mechanism(s) limiting the action of rapalogs to cytostatic effects. To study the effects of AMPK activation and mTOR inhibition pharmacologically, we performed growth suppression assays using pemetrexed, AICAR, RAD001, and AZD8055. The effect of inhibition of mTOR with these drugs was assessed by examining the dephosphorylation of mTORC1 substrates S6K1 and 4E-BP1, as single agents and in combination, at their 50% inhibitory concentrations (IC50) by western blotting. Our data suggested that AMPK activation via PTX mediated AICART inhibition in combination with direct mTOR inhibition by AZD8055 has a synergistic interaction on the proliferation of NSCLC cells in culture. Inhibition of mTOR endogenously by pemetrexed, along with direct pharmacological inhibition of mTOR prevents the feedback circuit which may compromise the therapeutic efficacy of rapamycin analogs. Pemetrexed and AZD8055, as single agents, demonstrated inhibitory activity on phosphorylation events of mTORC1 substrates. This activity was markedly increased by combining both the drugs. Our findings suggest that direct inhibitors of mTOR enhance the effects of activators of AMPK. These effects appear to be mediated via combined effects on mTORC1. Taken together, the combination of catalytic site mTOR inhibitors and pemetrexed is a promising therapeutic strategy and calls for further preclinical and clinical investigations.

Dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), l'activation anormale de nombreuses voies de signalisation intracellulaires favorise la croissance et la survie des cellules tumorales. L'amélioration des connaissances biologiques de ces pathologies hétérogènes, dont le pronostic est réservé, devrait permettre le développement de thérapies ciblées. La kinase oncogénique mTOR est présente au sein de deux complexes, parmi lesquels mTORC1, activé constitutivement dans la majorité des blastes primaires de patients porteurs de LAM, qui contrôle la synthèse protéique, et mTORC2 activé constitutivement dans 50% des LAM. Les inhibiteurs allostériques de mTORC1 (la rapamycine et ses dérivés) n'inhibent pas la phosphorylation du répresseur traductionnel 4E-BP1, ne diminuent pas la traduction et induisent peu d'apoptose in vitro dans les LAM. Utilisés en monothérapie, leur effet est décevant. De plus ces inhibiteurs n'agissent pas sur le complexe mTORC2. J'ai étudié l'effet d'un inhibiteur catalytique de mTOR, l'AZD8055, actif sur les deux complexes. In vitro, l'AZD8055 inhibe efficacement la signalisation en aval de mTORC1 et de mTORC2, dont les sites de phosphorylation de 4E-BP1 résistants à la rapamycine, ainsi que la synthèse protéique. Il diminue la prolifération, bloque le cycle cellulaire en phase G0G1 et induit une apoptose caspase-dépendante dans les blastes primaires de LAM. Il diminue également la clonogénicité des progéniteurs leucémiques, sans affecter celle des cellules CD34+ normales. Dans un modèle murin de xéno-transplantation, l'AZD8055 inhibe la croissance tumorale et améliore la survie des souris traitées. Je me suis également intéressée à la régulation de l'activité de mTORC1 par les acides aminés. Dans les cellules de mammifères, l'activation de mTORC1 nécessite la présence de glutamine et de leucine qui agissent en coopération via deux transporteurs membranaires, SLC1A5 et SLC7A5/SLC3A2. J'ai montré que la privation en glutamine, obtenue par l'activité glutaminase de la drogue L-asparaginase ou par l'utilisation de milieux de culture spécifiques dépourvus sélectivement en acides aminés, inhibe l'activation de mTORC1 et induit de l'apoptose dans diverses lignées leucémiques et dans les blastes primaires de LAM. La L-asparaginase inhibe la synthèse protéique et ses effets fonctionnels sont liés à son activité glutaminase. J'ai pu également constater une augmentation de l'expression protéique de la glutamine synthase induite par la Lasparaginase, dont l'inhibition majore l'apoptose induite par la L-asparaginase dans certaines lignées leucémiques. J'ai également étudié l'effet de l'inhibition spécifique par un shARN inductible du transporteur SLC1A5, qui permet l'import de glutamine. L'inhibition de SLC1A5 bloque la réactivation de mTORC1 par l'association leucine/glutamine après privation et induit de l'apoptose dans la lignée leucémique MOLM14. Cette inhibition diminue la croissance tumorale dans un modèle de xénogreffe