O surgimento e conseqüente acúmulo de O2 livre na atmosfera a partir do início da atividade fotossintética foi um evento que causou extinções em massa no nosso planeta. Apesar do grande aumento da quantidade de energia disponibilizado pela utilização do O2 na oxidação dos alimentos em comparação com a fermentação, a toxicidade do mesmo causou uma pressão seletiva nos organismos e o desenvolvimento de atividades de proteção contra o ataque do oxigênio e seus radicais aos clusters metálicos de enzimas de atividades essenciais como a nitrogenase e outras biomoléculas. Trabalhos demonstraram que o microrganismo diazotrófico Azospirillum amazonense, apesar de pouco estudado, está presente em grande quantidade no solo de pastagens e culturas de arroz, trigo, milho e cana-de-açúcar no Brasil, e além de estar adaptado à acidez do solo, produz importantes hormônios vegetais em associação com as mesmas. O presente estudo tem o objetivo de contribuir pa ra o entendimento da alta tolerância de A. amazonense ao estresse por oxigênio e seus radicais. A utilização do herbicida Gramoxone (Singenta) como indutor da resposta bacteriana resultou na resistência pelo microrganismo a concentrações maiores do que 100μM de paraquat. A metodologia de Representational Difference Analysis (cDNARDA) como forma de identificar genes diferencialmente expressos pela bactéria nessa condição resultou no isolamento de seis genes envolvidos direta e indiretamente no processo sendo um regulador transcricional da família GntR; uma alcanosulfonato monooxigenase; uma epimerase/desidratase dependente de NAD e uma serina protease. Este é o primeiro trabalho que utiliza emulsão fenólica em ciclos oscilatórios de temperatura (OSPERT) associada a cDNA-RDA. A metodologia utilizada mostrou ser funcional para as condições testadas sendo uma grande ferramenta para o estudo de expressão diferencial em organismos cujo genoma não é conhecido. / The emergence and consequent accumulation of free O2 in the atmosphere from the beginning of the photosynthetic activity was an event that caused mass extinctions on our planet. Despite of the large increase in the amount of energy available by the use of O2 in the oxidation of nutrients compared to the fermentation, the toxicity of the same caused a selective pressure on live organisms and the development of activities to protect against the attack of oxygen radicals in essential clusters of metallo-enzymes as nitrogenase and other biomolecules. Previous works showed that the diazotrophic microorganism Azospirillum amazonense, is present in large quantities in the soil, pasture, rice, wheat and sugarcane in Brazil, and besides being adapted to the acidity of the soil, is able to produce important phytormones in association with them. This study is intended to contribute to the understanding of the high tolerance of A. amazonense to stress by oxygen and their radicals. The use of the herbicide Gramoxone (Singenta) as inducer of bacterial response resulted in resistance greater then 100μM of paraquat by the microorganism. The methodology of Representational Difference Analysis (cDNA-RDA) as a way to identify genes expressed by bacteria in this specific conditions resulted in the isolation of six genes involved directly and indirectly in the process being a transcriptional regulator of the GntR family; an alcanosulfonato monooxigenase; a NAD dependent epimerase/desidratase and one serine protease. This is the first work that uses Oscillating Phenol Emulsion Reassociation Technique (OSPERT) in association with cDNA-RDA. The methodology used was shown to be functional for the conditions tested and it’s a powerful tool for the study of differential expression in organisms whose genome is unknown.

O gênero Azospirillum é conhecido pela capacidade de promover o crescimento vegetal, principalmente através da fixação biológica do nitrogênio e metabolismo de fitormônios. Apesar de muitos anos de estudos com esses microrganismos, apenas em 2010 o primeiro genoma completo foi disponibilizado, tendo sido selecionada Azospirillum sp. B510 devido a capacidade de atuar endofiticamente. A espécie A. amazonense, isolada de gramíneas de importância econômica como arroz e cana-de-açúcar, possui características que possibilitam sua utilização em solos mais ácidos, além de atuar na metabolização de xenobióticos, onde tem se destacado seu potencial em biorremediação. Com a colaboração do Projeto Genoma Sul nosso grupo realizou um sequenciamento parcial do genoma de A. amazonense. Genes vinculados a fixação de nitrogênio e carbono, quorum sensing, quimiotaxia e resistência bacteriana foram inicialmente caracterizado em um total de 3.319 ORFs anotadas. O presente trabalho realizou uma predição e anotação para a sequência completa dos contigs já depositados para este genoma, onde 5.496 proteínas foram caracterizadas em diferentes bancos de dados de sequências curadas, visando a identificação de características de importância biotecnológica. Devido a recente disponibilização de três outros genomas de Azospirillum, uma análise comparativa foi realizada para identificar e caracterizar sequências conservadas e diferenciais entre as espécies. Por meio da genômica comparativa entre essas bactérias e os vegetais associados foi identificado proteínas possivelmente relacionadas com o metabolismo de fitormônios. Análises detalhadas são apresentadas para proteínas do sistema de secreção do tipo IV e transportadores em geral, elementos genéticos móveis e sistema imune bacteriano. Estudos in vitro utilizando a técnica de RDA foram realizados para a comparação entre os genomas de A. amazonense e A. brasilense, sendo 46 proteínas exclusivas da primeira espécie identificadas e caracterizadas. Os resultados demonstraram que A. amazonense é a espécie mais afastada filogeneticamente entre essas bactérias, possuindo maior similaridade com A. brasilense entre os genomas já sequenciados neste gênero. Foram identificadas proteínas exclusivas de A. amazonense relacionadas ao sistema de secreção do tipo IV, envolvidas na troca de material genético. Essa espécie também apresentou duas regiões com proteínas exclusivas associadas ao sistema imune CRISPR, vinculado ao controle de entrada de DNA/RNA exógeno. Os resultados obtidos auxiliam no entendimento da genética desses microrganismos, servindo como base para experimentos futuros dirigidos à sua utilização como inoculante e na compreensão do seu papel no ambiente em que vive. / The genus Azospirillum is known for its ability to promote plant growth, mainly through biological nitrogen fixation and metabolism of plant hormones. Despite many years of studies with these microorganisms, the first complete genome became available only in 2010, and Azospirillum sp. B510 has been selected due to its ability to act as an endophyte. The A. amazonense specie, isolated from grasses of economic importance such as rice and sugar cane, possesses characteristics that allow its use in acidic soils, besides acting in xenobiotics metabolism, which has highlighted its potential for bioremediation. With the collaboration of Projeto Integrado Genoma Sul, our group conducted a partial sequencing of A. amazonense genome. Genes linked to nitrogen and carbon fixation, quorum sensing, chemotaxis and bacterial resistance were initially characterized in a total of 3,319 annotated ORFs. In the present work, we performed the prediction and annotation for the complete sequence of the contigs already deposited for A. amazonense genome, from which 5,496 proteins were characterized in different curated sequence databases, with the aim to identify characteristics of biotechnological importance. Due to the recent availability of three other genomes of Azospirillum, we performed a comparative analysis to identify conserved sequences and differences between these species. A comparative genomics study between these bacteria and associated plants has been conducted, and proteins possibly associated to plant hormones metabolism were identified. Detailed analyzes are presented for protein secretion system type IV and for transporters in general, for mobile genetic elements and for bacterial immune system. A comparison between A. amazonense and A. brasilense was performed by in vitro studies applying the RDA technique, and 46 proteins unique to the former specie were identified and characterized. The results obtained showed that A. amazonense is the specie more distant phylogenetically among these bacteria, and presenting highest similarity to A. brasilense among the genomes already sequenced in this genus. We identified several unique A. amazonense proteins related to type IV secretion system, which involves exchange of genetic material. This specie also presented two regions with unique proteins associated with the immune system CRISPR, associated to the input control of exogenous DNA/RNA. The results obtained in this study help in understanding the genetics of these microorganisms, serving as a basis for future experiments concerning its use as an inoculant, or in the comprehension of their role in the environment in which they live.

O surgimento e conseqüente acúmulo de O2 livre na atmosfera a partir do início da atividade fotossintética foi um evento que causou extinções em massa no nosso planeta. Apesar do grande aumento da quantidade de energia disponibilizado pela utilização do O2 na oxidação dos alimentos em comparação com a fermentação, a toxicidade do mesmo causou uma pressão seletiva nos organismos e o desenvolvimento de atividades de proteção contra o ataque do oxigênio e seus radicais aos clusters metálicos de enzimas de atividades essenciais como a nitrogenase e outras biomoléculas. Trabalhos demonstraram que o microrganismo diazotrófico Azospirillum amazonense, apesar de pouco estudado, está presente em grande quantidade no solo de pastagens e culturas de arroz, trigo, milho e cana-de-açúcar no Brasil, e além de estar adaptado à acidez do solo, produz importantes hormônios vegetais em associação com as mesmas. O presente estudo tem o objetivo de contribuir pa ra o entendimento da alta tolerância de A. amazonense ao estresse por oxigênio e seus radicais. A utilização do herbicida Gramoxone (Singenta) como indutor da resposta bacteriana resultou na resistência pelo microrganismo a concentrações maiores do que 100μM de paraquat. A metodologia de Representational Difference Analysis (cDNARDA) como forma de identificar genes diferencialmente expressos pela bactéria nessa condição resultou no isolamento de seis genes envolvidos direta e indiretamente no processo sendo um regulador transcricional da família GntR; uma alcanosulfonato monooxigenase; uma epimerase/desidratase dependente de NAD e uma serina protease. Este é o primeiro trabalho que utiliza emulsão fenólica em ciclos oscilatórios de temperatura (OSPERT) associada a cDNA-RDA. A metodologia utilizada mostrou ser funcional para as condições testadas sendo uma grande ferramenta para o estudo de expressão diferencial em organismos cujo genoma não é conhecido. / The emergence and consequent accumulation of free O2 in the atmosphere from the beginning of the photosynthetic activity was an event that caused mass extinctions on our planet. Despite of the large increase in the amount of energy available by the use of O2 in the oxidation of nutrients compared to the fermentation, the toxicity of the same caused a selective pressure on live organisms and the development of activities to protect against the attack of oxygen radicals in essential clusters of metallo-enzymes as nitrogenase and other biomolecules. Previous works showed that the diazotrophic microorganism Azospirillum amazonense, is present in large quantities in the soil, pasture, rice, wheat and sugarcane in Brazil, and besides being adapted to the acidity of the soil, is able to produce important phytormones in association with them. This study is intended to contribute to the understanding of the high tolerance of A. amazonense to stress by oxygen and their radicals. The use of the herbicide Gramoxone (Singenta) as inducer of bacterial response resulted in resistance greater then 100μM of paraquat by the microorganism. The methodology of Representational Difference Analysis (cDNA-RDA) as a way to identify genes expressed by bacteria in this specific conditions resulted in the isolation of six genes involved directly and indirectly in the process being a transcriptional regulator of the GntR family; an alcanosulfonato monooxigenase; a NAD dependent epimerase/desidratase and one serine protease. This is the first work that uses Oscillating Phenol Emulsion Reassociation Technique (OSPERT) in association with cDNA-RDA. The methodology used was shown to be functional for the conditions tested and it’s a powerful tool for the study of differential expression in organisms whose genome is unknown.

O gênero Azospirillum é conhecido pela capacidade de promover o crescimento vegetal, principalmente através da fixação biológica do nitrogênio e metabolismo de fitormônios. Apesar de muitos anos de estudos com esses microrganismos, apenas em 2010 o primeiro genoma completo foi disponibilizado, tendo sido selecionada Azospirillum sp. B510 devido a capacidade de atuar endofiticamente. A espécie A. amazonense, isolada de gramíneas de importância econômica como arroz e cana-de-açúcar, possui características que possibilitam sua utilização em solos mais ácidos, além de atuar na metabolização de xenobióticos, onde tem se destacado seu potencial em biorremediação. Com a colaboração do Projeto Genoma Sul nosso grupo realizou um sequenciamento parcial do genoma de A. amazonense. Genes vinculados a fixação de nitrogênio e carbono, quorum sensing, quimiotaxia e resistência bacteriana foram inicialmente caracterizado em um total de 3.319 ORFs anotadas. O presente trabalho realizou uma predição e anotação para a sequência completa dos contigs já depositados para este genoma, onde 5.496 proteínas foram caracterizadas em diferentes bancos de dados de sequências curadas, visando a identificação de características de importância biotecnológica. Devido a recente disponibilização de três outros genomas de Azospirillum, uma análise comparativa foi realizada para identificar e caracterizar sequências conservadas e diferenciais entre as espécies. Por meio da genômica comparativa entre essas bactérias e os vegetais associados foi identificado proteínas possivelmente relacionadas com o metabolismo de fitormônios. Análises detalhadas são apresentadas para proteínas do sistema de secreção do tipo IV e transportadores em geral, elementos genéticos móveis e sistema imune bacteriano. Estudos in vitro utilizando a técnica de RDA foram realizados para a comparação entre os genomas de A. amazonense e A. brasilense, sendo 46 proteínas exclusivas da primeira espécie identificadas e caracterizadas. Os resultados demonstraram que A. amazonense é a espécie mais afastada filogeneticamente entre essas bactérias, possuindo maior similaridade com A. brasilense entre os genomas já sequenciados neste gênero. Foram identificadas proteínas exclusivas de A. amazonense relacionadas ao sistema de secreção do tipo IV, envolvidas na troca de material genético. Essa espécie também apresentou duas regiões com proteínas exclusivas associadas ao sistema imune CRISPR, vinculado ao controle de entrada de DNA/RNA exógeno. Os resultados obtidos auxiliam no entendimento da genética desses microrganismos, servindo como base para experimentos futuros dirigidos à sua utilização como inoculante e na compreensão do seu papel no ambiente em que vive. / The genus Azospirillum is known for its ability to promote plant growth, mainly through biological nitrogen fixation and metabolism of plant hormones. Despite many years of studies with these microorganisms, the first complete genome became available only in 2010, and Azospirillum sp. B510 has been selected due to its ability to act as an endophyte. The A. amazonense specie, isolated from grasses of economic importance such as rice and sugar cane, possesses characteristics that allow its use in acidic soils, besides acting in xenobiotics metabolism, which has highlighted its potential for bioremediation. With the collaboration of Projeto Integrado Genoma Sul, our group conducted a partial sequencing of A. amazonense genome. Genes linked to nitrogen and carbon fixation, quorum sensing, chemotaxis and bacterial resistance were initially characterized in a total of 3,319 annotated ORFs. In the present work, we performed the prediction and annotation for the complete sequence of the contigs already deposited for A. amazonense genome, from which 5,496 proteins were characterized in different curated sequence databases, with the aim to identify characteristics of biotechnological importance. Due to the recent availability of three other genomes of Azospirillum, we performed a comparative analysis to identify conserved sequences and differences between these species. A comparative genomics study between these bacteria and associated plants has been conducted, and proteins possibly associated to plant hormones metabolism were identified. Detailed analyzes are presented for protein secretion system type IV and for transporters in general, for mobile genetic elements and for bacterial immune system. A comparison between A. amazonense and A. brasilense was performed by in vitro studies applying the RDA technique, and 46 proteins unique to the former specie were identified and characterized. The results obtained showed that A. amazonense is the specie more distant phylogenetically among these bacteria, and presenting highest similarity to A. brasilense among the genomes already sequenced in this genus. We identified several unique A. amazonense proteins related to type IV secretion system, which involves exchange of genetic material. This specie also presented two regions with unique proteins associated with the immune system CRISPR, associated to the input control of exogenous DNA/RNA. The results obtained in this study help in understanding the genetics of these microorganisms, serving as a basis for future experiments concerning its use as an inoculant, or in the comprehension of their role in the environment in which they live.

O gênero Azospirillum é conhecido pela capacidade de promover o crescimento vegetal, principalmente através da fixação biológica do nitrogênio e metabolismo de fitormônios. Apesar de muitos anos de estudos com esses microrganismos, apenas em 2010 o primeiro genoma completo foi disponibilizado, tendo sido selecionada Azospirillum sp. B510 devido a capacidade de atuar endofiticamente. A espécie A. amazonense, isolada de gramíneas de importância econômica como arroz e cana-de-açúcar, possui características que possibilitam sua utilização em solos mais ácidos, além de atuar na metabolização de xenobióticos, onde tem se destacado seu potencial em biorremediação. Com a colaboração do Projeto Genoma Sul nosso grupo realizou um sequenciamento parcial do genoma de A. amazonense. Genes vinculados a fixação de nitrogênio e carbono, quorum sensing, quimiotaxia e resistência bacteriana foram inicialmente caracterizado em um total de 3.319 ORFs anotadas. O presente trabalho realizou uma predição e anotação para a sequência completa dos contigs já depositados para este genoma, onde 5.496 proteínas foram caracterizadas em diferentes bancos de dados de sequências curadas, visando a identificação de características de importância biotecnológica. Devido a recente disponibilização de três outros genomas de Azospirillum, uma análise comparativa foi realizada para identificar e caracterizar sequências conservadas e diferenciais entre as espécies. Por meio da genômica comparativa entre essas bactérias e os vegetais associados foi identificado proteínas possivelmente relacionadas com o metabolismo de fitormônios. Análises detalhadas são apresentadas para proteínas do sistema de secreção do tipo IV e transportadores em geral, elementos genéticos móveis e sistema imune bacteriano. Estudos in vitro utilizando a técnica de RDA foram realizados para a comparação entre os genomas de A. amazonense e A. brasilense, sendo 46 proteínas exclusivas da primeira espécie identificadas e caracterizadas. Os resultados demonstraram que A. amazonense é a espécie mais afastada filogeneticamente entre essas bactérias, possuindo maior similaridade com A. brasilense entre os genomas já sequenciados neste gênero. Foram identificadas proteínas exclusivas de A. amazonense relacionadas ao sistema de secreção do tipo IV, envolvidas na troca de material genético. Essa espécie também apresentou duas regiões com proteínas exclusivas associadas ao sistema imune CRISPR, vinculado ao controle de entrada de DNA/RNA exógeno. Os resultados obtidos auxiliam no entendimento da genética desses microrganismos, servindo como base para experimentos futuros dirigidos à sua utilização como inoculante e na compreensão do seu papel no ambiente em que vive. / The genus Azospirillum is known for its ability to promote plant growth, mainly through biological nitrogen fixation and metabolism of plant hormones. Despite many years of studies with these microorganisms, the first complete genome became available only in 2010, and Azospirillum sp. B510 has been selected due to its ability to act as an endophyte. The A. amazonense specie, isolated from grasses of economic importance such as rice and sugar cane, possesses characteristics that allow its use in acidic soils, besides acting in xenobiotics metabolism, which has highlighted its potential for bioremediation. With the collaboration of Projeto Integrado Genoma Sul, our group conducted a partial sequencing of A. amazonense genome. Genes linked to nitrogen and carbon fixation, quorum sensing, chemotaxis and bacterial resistance were initially characterized in a total of 3,319 annotated ORFs. In the present work, we performed the prediction and annotation for the complete sequence of the contigs already deposited for A. amazonense genome, from which 5,496 proteins were characterized in different curated sequence databases, with the aim to identify characteristics of biotechnological importance. Due to the recent availability of three other genomes of Azospirillum, we performed a comparative analysis to identify conserved sequences and differences between these species. A comparative genomics study between these bacteria and associated plants has been conducted, and proteins possibly associated to plant hormones metabolism were identified. Detailed analyzes are presented for protein secretion system type IV and for transporters in general, for mobile genetic elements and for bacterial immune system. A comparison between A. amazonense and A. brasilense was performed by in vitro studies applying the RDA technique, and 46 proteins unique to the former specie were identified and characterized. The results obtained showed that A. amazonense is the specie more distant phylogenetically among these bacteria, and presenting highest similarity to A. brasilense among the genomes already sequenced in this genus. We identified several unique A. amazonense proteins related to type IV secretion system, which involves exchange of genetic material. This specie also presented two regions with unique proteins associated with the immune system CRISPR, associated to the input control of exogenous DNA/RNA. The results obtained in this study help in understanding the genetics of these microorganisms, serving as a basis for future experiments concerning its use as an inoculant, or in the comprehension of their role in the environment in which they live.

O surgimento e conseqüente acúmulo de O2 livre na atmosfera a partir do início da atividade fotossintética foi um evento que causou extinções em massa no nosso planeta. Apesar do grande aumento da quantidade de energia disponibilizado pela utilização do O2 na oxidação dos alimentos em comparação com a fermentação, a toxicidade do mesmo causou uma pressão seletiva nos organismos e o desenvolvimento de atividades de proteção contra o ataque do oxigênio e seus radicais aos clusters metálicos de enzimas de atividades essenciais como a nitrogenase e outras biomoléculas. Trabalhos demonstraram que o microrganismo diazotrófico Azospirillum amazonense, apesar de pouco estudado, está presente em grande quantidade no solo de pastagens e culturas de arroz, trigo, milho e cana-de-açúcar no Brasil, e além de estar adaptado à acidez do solo, produz importantes hormônios vegetais em associação com as mesmas. O presente estudo tem o objetivo de contribuir pa ra o entendimento da alta tolerância de A. amazonense ao estresse por oxigênio e seus radicais. A utilização do herbicida Gramoxone (Singenta) como indutor da resposta bacteriana resultou na resistência pelo microrganismo a concentrações maiores do que 100μM de paraquat. A metodologia de Representational Difference Analysis (cDNARDA) como forma de identificar genes diferencialmente expressos pela bactéria nessa condição resultou no isolamento de seis genes envolvidos direta e indiretamente no processo sendo um regulador transcricional da família GntR; uma alcanosulfonato monooxigenase; uma epimerase/desidratase dependente de NAD e uma serina protease. Este é o primeiro trabalho que utiliza emulsão fenólica em ciclos oscilatórios de temperatura (OSPERT) associada a cDNA-RDA. A metodologia utilizada mostrou ser funcional para as condições testadas sendo uma grande ferramenta para o estudo de expressão diferencial em organismos cujo genoma não é conhecido. / The emergence and consequent accumulation of free O2 in the atmosphere from the beginning of the photosynthetic activity was an event that caused mass extinctions on our planet. Despite of the large increase in the amount of energy available by the use of O2 in the oxidation of nutrients compared to the fermentation, the toxicity of the same caused a selective pressure on live organisms and the development of activities to protect against the attack of oxygen radicals in essential clusters of metallo-enzymes as nitrogenase and other biomolecules. Previous works showed that the diazotrophic microorganism Azospirillum amazonense, is present in large quantities in the soil, pasture, rice, wheat and sugarcane in Brazil, and besides being adapted to the acidity of the soil, is able to produce important phytormones in association with them. This study is intended to contribute to the understanding of the high tolerance of A. amazonense to stress by oxygen and their radicals. The use of the herbicide Gramoxone (Singenta) as inducer of bacterial response resulted in resistance greater then 100μM of paraquat by the microorganism. The methodology of Representational Difference Analysis (cDNA-RDA) as a way to identify genes expressed by bacteria in this specific conditions resulted in the isolation of six genes involved directly and indirectly in the process being a transcriptional regulator of the GntR family; an alcanosulfonato monooxigenase; a NAD dependent epimerase/desidratase and one serine protease. This is the first work that uses Oscillating Phenol Emulsion Reassociation Technique (OSPERT) in association with cDNA-RDA. The methodology used was shown to be functional for the conditions tested and it’s a powerful tool for the study of differential expression in organisms whose genome is unknown.

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

A superfamília PII de proteínas de transdução de sinal é conhecida por conter as proteínas sinalizadoras mais amplamente distribuídas na natureza, sendo ubíquas entre bactérias. Elas desempenham um papel chave na coordenação da regulação de processos metabólicos centrais, especialmente aqueles relacionados ao metabolismo de nitrogênio. As proteínas PII atuam por interação direta com uma variedade de alvos celulares, tais como fatores transcricionais, enzimas e transportadores, resultando na modulação da atividade desses receptores. A sinalização realizada por PII apresenta o potencial de responder a três sinais metabólicos: o sinal de energia ATP, o sinal de carbono 2- oxoglutarato e o sinal de nitrogênio glutamina. Os dois primeiros são transmitidos diretamente pela ligação das moléculas efetoras, enquanto que os níveis de nitrogênio são refletidos pela uridilação reversível de PII pela enzima GlnD, em condições de deficiência de nitrogênio. Em microrganismos diazotróficos, o papel das proteínas PII é estendido para o controle do processo de fixação de nitrogênio. O gênero Azospirillum é composto de diazotróficos de vida livre capazes de se associar de forma benéfica com diversas gramíneas, como por exemplo, cana-de-açúcar e arroz. Com o objetivo de analisar os sistemas regulatórios do metabolismo e da fixação de nitrogênio no modelo de estudo Azospirillum amazonense, foi proposta uma investigação da função das proteínas PII nessas vias. Os alvos celulares dos parálogos de PII presentes em A. amazonense – chamados de GlnB e GlnK – foram investigados utilizando experimentos de pull-down. Dois extratos de A. amazonense foram testados, referindo-se a condições de crescimento em abundância e limitação de nitrogênio. Ao todo, 42 prováveis proteínas de interação das formas não modificadas das duas proteínas PII foram identificadas por espectrometria de massas em tandem, no entanto as interações mapeadas devem ser confirmadas por métodos alternativos. Entre as proteínas isoladas, destaca-se a presença de 10 fatores transcricionais. Esses podem representar pontos de conexão com outros sistemas regulatórios, tais como o sistema de controle do conteúdo celular de exopolissacarídeos e o sistema de controle redox de processos energéticos. Além desses reguladores, nossos resultados incluem 2 proteínas envolvidas no metabolismo de metais, 2 transportadores, 12 enzimas metabólicas, 7 proteínas de funções basais e 9 proteínas de função desconhecida. / The PII superfamily of signal transduction proteins is known to contain the most widely distributed signaling proteins in nature, being ubiquitous among bacteria. They play a major role in coordinating the regulation of central metabolic processes, especially those related to nitrogen metabolism. PII proteins act by direct interaction with a variety of cellular targets, such as transcription factors, enzymes and transporters, resulting in modulation of receptor activities. PII signaling has the potential to respond to three central metabolic signals: the energy signal ATP, the carbon signal 2- oxoglutarate and the nitrogen signal glutamine. The first two are sensed directly by the binding of the effector molecules. The nitrogen levels are reflected by reversible uridylation of the PII by the glutamine-sensor enzyme GlnD, under nitrogen deficiency conditions. Thus, PII proteins serve as the central processing unit for the integration of antagonistic signals of carbon and nitrogen status, and use this information to control nitrogen assimilation. In diazotrophic microorganisms, PII proteins role is extended to the control of the nitrogen fixation process. The genus Azospirillum is composed of free-living diazotrophs capable of beneficial association with a variety of Graminae plants, such as sugarcane and rice. In order to appraise the regulatory systems of nitrogen fixation and metabolism in the model organism Azospirillum amazonense, an investigation of the PII proteins functions in these networks was proposed. The cellular targets of each of the PII paralogues found in A. amazonense – named GlnB and GlnK – were investigated by pull-down assays. Two protein extracts of A. amazonense were tested, referring to growth conditions of nitrogen limitation and sufficiency. Altogether, 42 potential interacting partners of the unmodified form of the two PII proteins were identified by LC-MS/MS, and these interactions are to be further confirmed by alternative methods. It is noteworthy that 10 transcriptional factors were isolated in our experiments. These factors may represent linking points for the cross-talk between nitrogen regulation and other regulatory systems, such as the control of exopolysaccharide biosynthesis and the redox control of energetic processes. Besides these transcriptional regulators, our results comprise 2 proteins related to heavy metals metabolism, 2 transporters, 12 metabolic enzymes, 7 housekeeping function proteins and 9 unknown function proteins.

A utilização massiva de fertilizantes químicos na agricultura tem efeitos perniciosos ao ambiente. As bactérias do gênero Azospirillum são amplamente estudadas, pois são capazes de promover o crescimento vegetal. Essa característica lhes confere potencial para serem utilizadas na agricultura como uma alternativa ecologicamente compatível. Embora a espécie Azospirillum amazonense seja menos conhecida, o estudo de sua biologia molecular poderia contribuir para a elucidação dos mecanismos envolvidos na promoção do crescimento vegetal. Na primeira parte deste trabalho, foram descritas ferramentas genéticas que podem facilitar o estudo da biologia molecular de A. amazonense. Métodos de conjugação e eletroporação foram otimizados utilizando vetores com origens de replicação de amplo espectro (pVS1 e pBBR1). Além disso, mutantes para o gene glnK foram gerados utilizando o sistema do vetor pK19MOBSACB. Finalmente, um protocolo de análise de promotores baseado na expressão de proteínas fluorescentes foi desenvolvido para permitir estudos de regulação gênica. Na segunda parte do trabalho, uma análise abrangente das características do draft do genoma de A. amazonense foi realizada. Essa espécie apresenta um repertório versátil de genes, crucial para seu modo de vida na rizosfera. Genes putativos relacionados com metabolismo de nitrogênio e de carbono, produção de energia, produção de fitormônio, transporte, quorum sensing, resistência a antibióticos, síntese de bacteriofitocromo, quimiotaxia e motilidade foram identificados. Os genes da fixação do nitrogênio e da nitrilase poderiam estar diretamente relacionados com a promoção do crescimento vegetal. A identificação de genes da RubisCO sugere que A. amazonense seja capaz de fixar carbono, característica do seu metabolismo antes desconhecida. Outro aspecto relevante é que alguns genes de A. amazonense, como os da nitrogenase e da RubisCO, são mais próximos filogeneticamente aos genes de membros da ordem Rhizobiales do que dos de espécies do mesmo gênero. / The massive use of chemical fertilizers in agriculture has harmful effects to the environment. Bacteria from the Azospirillum genus are widely studied, since they are able to promote plant growth. This feature gives them the potential to be used in agriculture as an ecologically compatible alternative. Although the Azospirillum amazonense is a lesserknown species, the study of its molecular biology could contribute to a better understanding of the mechanisms implicated in plant growth. In the first part of this study, genetic tools that can support the study of the molecular biology of A. amazonense were described. Conjugation and electrotransformation methods were established utilizing vectors with broad host-replication origins (pVS1 and pBBR1). Furthermore, glnK-specific A. amazonense mutants were generated utilizing the pK19MOBSACB vector system. Finally, a promoter analysis protocol based on fluorescent protein expression was optimized to aid genetic regulation studies on this bacterium. In the second part of this study a comprehensive analysis of the genomic features of this species was presented. The species A. amazonense presents a versatile repertoire of genes crucial for its plant-associated lifestyle. Genes of A. amazonense related to nitrogen/carbon metabolism, energy production, phytohormone production, transport, quorum sensing, antibiotic resistance, chemotaxis/motility and bacteriophytochrome biosynthesis were identified. Noteworthy genes were the nitrogen fixation genes and the nitrilase gene, which could be directly implicated in plant growth promotion, and the carbon fixation genes, which had previously been poorly investigated in this genus. One important finding was that some A. amazonense genes, like the nitrogenase genes and RubisCO genes, were closer phylogenetically to genes from Rhizobiales members than to those from species of its own order.