La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale cause de démence chez les personnes âgées. Les mutations dans les gènes codant pour les présénilines 1 et 2 (PS1 et PS2) sont associées à une forme familiale très agressive de la MA, affectant des individus entre 25-50 ans. PS1 est un membre du complexe y-sécrétase impliqué dans la production de l'amyloïde, et les mutations de PS1 entraînent une surproduction des formes longues de ce peptide qui évoluent vers les plaques seniles. Cependant, il est maintenant bien décrit que PS1 interagît avec d'autres protéines et voies de signalisation, parmi lesquelles se trouve son seul partenaire exclusivement neuronal, la neural plakophilin related armadillo protein (NPRAP ou 5-caténine). Afin d'investiguer la fonction biologique de NPRAP, ainsi que son interaction avec PS1, nous avons réalisé une analyse d'expression génique à l'aide de micropuces à ADN. Nous avons trouvé plusieurs gènes régulés par NPRAP, y compris BCHE (butyrylcholinesterase), qui est associé à la MA. De plus, nous avons démontré que le signal de localisation nucléaire de NPRAP est requis pour cette modulation et que la PS1 peut affecter l'effet de NPRAP sur BCHE. Ces résultats sont en accord avec d'autres observations qui suggèrent un rôle pour PS1 comme régulateur de la mobilité de NPRAP, de la périphérie cellulaire jusqu'à la région périnucléaire ou ils interagissent très fortement. De façon intéressante, l'analyse de l'interactome de NPRAP par spectrométrie de masse a identifié son association directe à une isoforme de la dynamine 2 impliquée dans le trafic membranaire et l'assemblage de l'actine dans le Golgi. Nos résultats suggèrent que PS1 peut réguler la signalisation intracellulaire médiée par NPRAP, mais aussi que NPRAP aurait un rôle putatif dans la régulation du complexe y-sécrétase dans lequel participe PS1.

L’Anémie de Fanconi est une pathologie génétique rare qui se caractérise par une anémie aplasique, des malformations congénitales de sévérité variable et un risque accrue au développement de cancers. En particulier, les patients atteints d’Anémie de Fanconi développent des carcinomes squameux de la tête et du coup. La protéine FANCC est l’une des 21 protéines Fanconi connues à ce jour. Il a déjà été montré que FANCC possède de nombreux rôles en dehors de celui de la réparation de l’ADN. Ici, nous nous sommes intéressés au rôle de FANCC dans la régulation de la voie Wnt/β-caténine. Cette voie de signalisation est souvent dérégulée dans les cancers. Nous avons pu montrer que des formes mutantes de FANCC régulent la quantité de β-caténine libre via son interaction avec le complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine. En effet, en interagissant avec l’une des protéines du complexe, la protéine APC, les formes mutantes de FANCC permettent d’augmenter la quantité de cette protéine, ainsi que de la protéine d’assemblage du complexe de dégradation/neutralisation de la β-caténine, Axin-1. On observe ainsi une diminution importante de la quantité de β-caténine libre, ainsi que de β-caténine au noyau, entrainant une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de la β-caténine. Parmi ces cibles, l’oncogène c-Myc, codant pour un facteur de transcription connu pour réprimer la transcription de DKK1. Or, il a été montré que le niveau d’expression de DKK1 est plus élevé dans les cellules mutantes pur FANCC. Nous avons, effectivement, pu confirmer que l’expression de DKK1 est inverse de celle de la protéine c-Myc dans les fibroblastes de peau dérivés de patients Fanconi. De manière intéressante, si l’expression de la protéine c-Myc est diminué dans les fibroblastes mutants pour FANCC, en comparaison aux fibroblastes exprimant un FANCC sauvage, nous n’avons pas observé de variation dans l’expression de c-Myc dans des cellules de carcinomes squameux dérivées de patient mutant pour FANCC et complémentées en FANCC. Ainsi, la surexpression des protéines Axin-1 et APC dans les cellules mutantes pour FANCC induit un défaut d’accumulation de la β-caténine dans ces cellules, conduisant à une perte d’activation des cibles transcriptionnelles de cette protéine. De plus, la réexpression de la protéine c-Myc dans les cellules de carcinomes squameux dérivées de patient, mutées pour FANCC, permet d’envisager de nouvelles cibles thérapeutiques, comme la protéine CT120. Cette dernière est une protéine membranaire, régulée par c-Myc qui est impliquée dans 2 voies de signalisation fréquemment dérégulées dans des cancers, et en particulier dans les carcinomes squameux de la tête et du coup. Ce type de cancers est particulièrement problématique à la fois chez les patients Fanconi, mais également dans la population générale. En effet, les carcinomes squameux de la tête et du coup représentent la 5ième cause de mortalité causée par le cancer dans le monde. / Fanconi Anemia (FA) is a rare genetic disorder characterized by bone marrow failure, physicals abnormalities and a high risk of cancers. Specifically, the FA patients develop head and neck squamous cell carcinoma. The FANCC protein is one of the 21 FA proteins. It was already shown that FANCC have numerous functions in addition of the DNA repair. We investigate about the role of FANCC in the Wnt/β-catenin regulation. The signaling pathway is known for its involvement in carcinogenesis. We show that mutants of FANCC regulate the free β-catenin level, interacting with APC, a protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. Indeed, this interaction leads to an increasing of the levels of APC and Axin-1, the scaffold protein of the β-catenin degradation/neutralization complex. The decreasing of free β-catenin leads to the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets, including c-Myc. The protein coded by c-Myc is a transcriptional factor known for repressing DKK1 expression. It was previously shown that there is an increase expression of DKK1 in FA mutant cells. And we show that the expression of DKK1 is opposite of the expression of c-Myc in FA patient derived fibroblasts. Interestingly, the expression of c-Myc is decreased in FANCC mutant patient derived fibroblasts, compare to the complemented cells, but there is no difference in the c-Myc level between patient derived squamous cell carcinoma cells mutant for FANCC and complemented cells. We hypothesize that the increased levels of APC and Axin-1, leading the decreased level of activated β-catenin and the loss of the transcriptional activation of the β-catenin targets in FANCC mutant cells is a protecting mechanism against the cells transformation. Furthermore, this expression of c-Myc in patient derived squamous cell carcinoma cells, open to new therapeutic targets, as CT120. This protein is a membranous protein, regulate by c-Myc, involved in 2 signalization pathways deregulated in cancers, including head and neck squamous cell carcinoma. This kind of cancer is a health care issue; indeed, this cancer is the 5th death cause related to cancer in the general population.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une fonne de démence caractérisée par une dégénérescence des cellules nerveuses et une perte des fonctions synaptiques. Une des causes majeures de la forme familiale de la MA serait la présence de mutations dans le gène codant poin la préséniline 1 (PSI). Des études antérieures ont confirmé l'interaction de PSI avec la Neural-Plakophilin-Related Armadillo Protein (NPRAP), une protéine neuronale dont la deletion du gène est impliquée dans le syndrome du Cri-du-Chat et entraîne des déficits cognitifs importants. Le rôle fonctionnel de cette interaction reste inconnu. Puisque les souris nulles NPRAP présentent des déficits cognitifs importants et des défauts synaptiques, nous supposons que NPRAP contribue au phénotype de pertes synaptiques associées aux mutations de PSI dans la MA. Le but de ce projet était d'élucider la voie moléculaire de NPRAP en identifiant ses partenaires biochimiques afin de caractériser son rôle putatif dans les voies de signalisation de la MA. Le système de double hybride en levures a été utilisé afin de confirmer l'interaction de partenaires biochimiques de NPRAP identifiés lors d'im criblage d'une banque d'ADNc spécifiques du cerveau hiunain. Les candidats retenus ont été clones dans des vecteurs d'expression mammaliens afin de confirmer leur expression dans des cellules HEK293T. La technique de co-iimnunoprécipitation en co-transfectant les protéines hypothétiques avec NPRAP a été utilisée afin d'appuyer les résultats obtenus en levure. Panni les quatre protéines candidates retenues, seule l'interaction de deux protéines avec NPRAP a été confinnée en levure, soient la tubulin beta2B (TUBB2B) et une protéine hypothétique dont le gène est situé sur le chromosome 8. L'expression de la protéine hypothétique n'a pu être confirmée dans les cellules HEK293T. La TUBB2B semble être exprimée dans le même modèle cellulaire, mais n'interagit pas avec NPRAP lorsque co-iimnunoprécipitée. D'autres expériences sont nécessaires afin de vérifier les interactions ht vitro. Une clarification de la voie de signalisation de NPRAP permettrait de comprendre comment son interaction avec PSI peut être associée à la MA.

Dans la majorité des cas, l’hypersécrétion de cortisol résulte d’un adénome hypophysaire sécrétant de l’ACTH (maladie de Cushing). Plus rarement, le syndrome de Cushing est la conséquence d’un adénome corticosurrénalien unilatéral ou d’une hyperplasie bilatérale des surrénales (HMBS) sécrétant du cortisol. Ces deux pathologies appartiennent à la catégorie des hypercortisolismes dits ACTH-indépendants en raison des taux plasmatiques effondrés d’adrénocorticotrophine (ACTH). Les mécanismes moléculaires à l’origine de la sécrétion accrue de cortisol par ces lésions sont longtemps restés méconnus. Au cours des dernières années, des avancées considérables ont été réalisées dans la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie du syndrome de Cushing. Deux grands types d’anomalies paraissent impliqués dans la pathogénie de l’hypercortisolisme : des mutations germinales et somatiques activant des voies de signalisation intracellulaires et l’expression illégitime de récepteurs membranaires. Dans la surrénale humaine normale, la sérotonine (5-HT), synthétisée et libérée par les mastocytes sous-capsulaires, stimule la sécrétion des corticostéroïdes via son récepteur 5-HT4. Ce dernier est principalement localisé à la surface des cellules de la zone glomérulée mais faiblement exprimé au niveau des cellules de la zone fasciculée, expliquant l’action stimulante prédominante de la 5-HT sur la sécrétion d’aldostérone. Dans la dysplasie micronodulaire pigmentée des surrénales, l’activation de la voie AMPc/PKA par une mutation du gène PRKAR1A est responsable d’une surexpression de la tryptophane hydroxylase (TPH) de type 2, enzyme limitante de la synthèse de 5-HT, et des récepteurs sérotoninergiques 5-HT4, 5-HT6 et 5-HT7 couplés positivement à la voie AMPc/PKA dans les cellules cortisolosécrétrices. Chez l’Homme, la sécrétion de cortisol est physiologiquement stimulée par l’ACTH également via la voie AMPc/PKA. Les patients souffrant de maladie de Cushing, d’un syndrome de Cushing paranéoplasique (paraCS), d’un déficit en 21-hydroxylase ou d’HMBS présentent des taux d’ACTH plasmatique ou intrasurrénalienne élevés. Chez ces patients, nous montrons que la stimulation chronique de la voie AMPc/PKA par l’ACTH provoque une surexpression de la TPH de type 1, du récepteur eutopique 5-HT4 et des récepteurs ectopiques 5-HT6 et 5-HT7 dans les cellules stéroïdogènes. Pour l’un des patients avec paraCS, nous avons pu montrer que les cellules corticosurrénaliennes en culture sécrètent du cortisol en réponse à la 5-HT ou à des agonistes des récepteurs 5-HT4 ou 5-HT7. Par ailleurs, le rôle de la voie Wnt/-caténine dans l’apparition des récepteurs illégitimes reste controversé. Nous avons donc évalué l’expression des récepteurs 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, du LH-R et du GIP-R dans une tumeur corticosurrénalienne avec mutation germinale du gène APC et deux modèles d’activation constitutive de la voie Wnt/-caténine dans le cortex surrénalien, incluant des souris génétiquement modifiées et des cellules corticosurrénaliennes humaines en culture primaire. Nos résultats indiquent que l’activation de la voie Wnt/-caténine favorise une surexpression significative du LH-R dans les 3 modèles étudiés. Globalement, les données issues de notre travail montrent que l’activation de voies de signalisation intracellulaire, comme la voie AMPc/PKA par l’ACTH ou la voie Wnt/-caténine par des mutations génétiques, favorise l’émergence de systèmes de régulation surrénaliens aberrants. Ils indiquent en outre que la 5-HT intrasurrénalienne est impliquée dans l’hypersécrétion de corticostéroïdes associée à différentes pathologies incluant la maladie de Cushing et le syndrome de Cushing paranéoplasique, le bloc en 21-hydroxylase et l’HMBS. Le recours à des inhibiteurs sélectifs de la tryptophane hydroxylase pourrait donc permettre de réduire l’excès de stéroïdes chez les patients atteints de ces affections. / In most cases, cortisol hypersecretion (Cushing’s syndrome; CS) results from ACTH-producing pituitary adenoma (Cushing’s disease). Occasionally, CS is the consequence of a unilateral adrenal adenoma or a bilateral macronodular adrenal hyperplasia (BMAH) producing cortisol. In these conditions, hypercortisolism is referred to as “ACTH-independent” owing to suppressed plasma ACTH levels. The molecular mechanisms underlying the maintenance of cortisol hypersecretion by adrenocortical adenomas and BMAHs in the absence of circulating ACTH has long remained unknown. However, major advances have been made during the past recent years in the comprehension of the pathophysiology of primary adrenal CS. Two main types of molecular defects have been shown to favor cortisol hypersecretion by adrenocortical neoplasms: somatic mutations responsible for activation of intracellular signaling pathways and abnormally expressed (or illegitimate) membrane receptors by tumor cells. In the human adrenal gland, serotonin (5-HT), released by subcapsular mast cells stimulates corticosteroid secretion through activation of its type 4 receptor (5-HT4R). The 5-HT4R is principally expressed in zona glomerulosa cells but weakly expressed in zona fasciculata cells explaining why 5-HT strongly stimulates aldosterone production. Interestingly, in primary pigmented nodular adrenocortical disease (PPNAD) cells, activation of the cAMP/PKA pathway by PRKAR1A mutations triggers upregulation of the 5-HT synthesizing enzyme tryptophan hydroxylase (TPH) type 2 together with the 5-HT4, 5-HT6 and 5-HT7 receptors, positively coupled to cAMP/PKA signaling pathway. 5-HT strongly stimulates cortisol production and inhibition of TPH reduced corticosteroidogenesis in cultured PPNAD cells. In human, cortisol secretion is normally stimulated by ACTH also through activation of the cAMP/PKA signaling pathway. Patients suffering from Cushing’s disease, paraneoplastic Cushing’s syndrome (paraCS), 21-hydroxylase deficiency or BMAH display high plasma or intraadrenal ACTH levels. In these patients, we show that chronic stimulation of cAMP/PKA pathway by ACTH induces TPH type 1 and 5-HT4/6/7 receptors overexpression in steroidogenic cells. In primary cultured adrenocortical cells originating from a patient with paraCS, 5-HT and 5-HT4/7 receptors agonists were able to activate cortisol secretion. On the other hand, the role of Wnt/-catenin signaling pathway in the emergence of illegitimate receptors is still debated. We therefore evaluated 5-HT4, 5-HT6, 5-HT7, LH/hCG and GIP receptors expression in an adrenocortical tumor with APC germline mutation and two experimental models of constitutive activation of β-catenin in adrenocortical cells, namely genetically modified mice and human transfected adrenocortical cells. Our results indicate that Wnt/-catenin pathway activation promotes significant overexpression of LH/hCG receptor in the 3 models investigated. Globally, our data show that activation of intracellular signaling pathways such as the cAMP/PKA pathway by ACTH or Wnt/-catenin by genetic mutations favors the emergence of abnormal regulatory systems in the adrenal cortex. Our results also demonstrate that intraadrenal 5-HT is involved in corticosteroids hypersecretion related to different diseases including Cushing’s disease, paraneoplastic Cushing’s syndrome, 21-hydroxylase deficiency and BMAH. TPH inhibitors may thus represent a new therapeutic approach of corticosteroid excess in patients suffering from these disorders.

Dans ce mémoire, nous présentons l’utilisation de techniques de model-checking pour l’inférence de paramètres de réseaux de régulation génétique (GRN) et l’analyse formelle d’une voie de signalisation. Le coeur du mémoire est décrit dans la première partie, dans laquelle nous proposons une approche pour inférer les paramètres biologiques régissant les dynamiques de modèles discrets de GRN. Les GRN sont encodés sous la forme d’un méta-modèle, appelé GRN paramétré, de telle façon qu’une instance de paramètres définit un modèle discret du GRN initial. Sous réserve que les propriétés biologiques d’intérêt s’expriment sous la forme de formules LTL, les techniques de model-checking LTL sont combinées à celles d’exécution symbolique et de résolution de contraintes afin de sélectionner les modèles satisfaisant ces propriétés. L’enjeu est de contourner l’explosion combinatoire en terme de taille et de nombre de modèles discrets. Nous avons implémenté notre méthode en Java, dans un outil appelé SPuTNIk. La seconde partie décrit une collaboration avec des neuropédiatres, qui ont pour objectif de comprendre l’apparition du phénotype protecteur ou toxique des microglies (un type de macrophage du cerveau) chez les prématurés. Cette partie exploite un autre versant du model-checking, celui du modelchecking statistique, afin d’étudier un type de réseau biologique particulier : la voie de signalisation Wnt/β-caténine, qui permet la transmission d’un signal de l’extérieur à l’intérieur des cellules via une cascade de réactions biochimiques. Nous présentons ici l’apport du model-checker stochastique COSMOS, utilisant la logique stochastique à automate hybride (HASL), un formalisme très expressif nous permettant une analyse formelle sophistiquée des dynamiques de la voie Wnt/β-caténine, modélisée sous la forme d’un processus stochastique à événements discrets. / In this thesis, we present the use of model checking techniques for inference of parameters of Gene Regulatory Networks (GRNs) and formal analysis of a signalling pathway. In the first and main part, we provide an approach to infer biological parameters governing the dynamics of discrete models of GRNs. GRNs are encoded in the form of a meta-model, called Parametric GRN, such that a parameter instance defines a discrete model of the original GRN. Provided that targeted biological properties are expressed in the form of LTL formulas, LTL model-checking techniques are combined with symbolic execution and constraint solving techniques to select discrete models satisfying these properties. The challenge is to prevent combinatorial explosion in terms of size and number of discrete models. Our method is implemented in Java, in a tool called SPuTNIk. The second part describes a work performed in collaboration with child neurologists, who aim to understand the occurrence of toxic or protective phenotype of microglia (a type of macrophage in the brain) in the case of preemies. We use an other type of model-checking, the statistical model-checking, to study a particular type of biological network: the Wnt/β- catenin pathway that transmits an external signal into the cells via a cascade of biochemical reactions. Here we present the benefit of the stochastic model checker COSMOS, using the Hybrid Automata Stochastic Logic (HASL), that is an very expressive formalism allowing a sophisticated formal analysis of the dynamics of the Wnt/β-catenin pathway, modelled as a discrete event stochastic process.