Κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου ένας από τους σημαντικότερους μηχανισμούς ρύθμισης της ομοιόστασης των πρωτεϊνικών μορίων είναι η ελεγχόμενη στο χώρο και στο χρόνο αποδόμηση τους. Οποιαδήποτε ανωμαλία στη ρύθμιση των μηχανισμών αποδόμησης των πρωτεϊνών μπορεί να προκαλέσει σημαντική βλάβη στη λειτουργία του κυττάρου και να οδηγήσει σε κακοήθη εξαλλαγή του. Η αποδόμηση των κύκλινο-εξατώμενων αναστολέων του κυτταρικού κύκλου, p27 και p21, έχει δειχθεί να αυξάνει κατά την καρκινογένεση. Αν και η πρωτεόλυση των p27 και p21 έχει δειχθεί να μεσολαβείται από διαφορετικά μονοπάτια ωστόσο το περισσότερο γνωστό και καλύτερα τεκμηριωμένο είναι το μονοπάτι μέσω του συμπλόκου SCF (Skp2-cul1-Skp1) Ε3 λιγάσης της ουβικουιτίνης. Αρχικά οι πρωτεΐνες p27 και p21 φωσφορυλιώνονται από το σύμπλκο κυκλίνης Ε/Α-CDK2 στη θρεονίνη 187 (Thr187) και στη σερίνη 130 (Ser130) αντίστοιχα, και εν συνεχεία αναγνωρίζονται από το σύμπλοκο SCFSkp2, το οποίο διευκολύνει την πολύ-ουβικουιτινυλίωση και την αποδόμηση των πρωτεϊνών στο πρωτεόσωμα. Στη παρούσα εργασία μελετήθηκε η έκφραση των πρωτεϊνών: p27, p21, Skp2, cul1, pThr187-p27, κυκλίνη Α, κυκλίνη Ε και CDK2 σε 135 περιπτώσεις Β-λεμφωμάτων με Επιθετική [66 ΔΛΜΒΚ (35 λεμφαδενικά και 31 εξωλεμφαδενικά), 13 ΛΚΜ (8 κλασσικά και 5 βλαστικά) και 5 με ΛΛ βαθμού 3α/β)] και Ήπια βιολογική συμπεριφορά [9 ΛΛ (3 βαθμού 1, 6 βαθμού 2), 20 ΛΟΖ (12 λεμφαδενικά 6 εξωλεμφαδενικά, 2 σπληνικά) και 22 ΛΜΚ]. Η έκφραση της p27 παρατηρήθηκε μέγιστη στα ήπια λεμφώματα. Ωστόσο σε αρκετές περιπτώσεις επιθετικού λεμφώματος, κυρίως ΔΛΜΒΚ (~40%, >30%), η έκφραση της p27 βρέθηκε αυξημένη. Επιπλέον, σε όλες τις περιπτώσεις λεμφωμάτων εκτός του λεμφοζιδιακού και της οριακής ζώνης, παρουσιάστηκε αδυναμία αρνητικής συσχέτισης μεταξύ της p27 και της Skp2. Η μέγιστη έκφραση της p21, αντίθετα με την p27, παρατηρήθηκε στα ΔΛΜΒΚ, γεγονός που συνδέει την p21 με επιθετικότερη νόσο. Η πρωτεΐνη p21 δεν έδειξε να συσχετίζεται με τις πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για την αποδόμηση της, γεγονός που πιθανόν να υποδεικνύει ότι στα Β-λεμφώματα που μελετήθηκαν η p21 δεν πρωτεολύεται από το σύμπλοκο SCFSkp2. Η υπερέκφραση της Skp2 στα ΔΛΜΒΚ, ΛΚΜ (κυρίως βλαστικά) και ΛΛ (βαθμού 3) καθώς και η ισχυρή θετική συσχέτιση με το δείκτη πολλαπλασιασμού, την κυκλίνη Α και τη CDK2 προσδίδουν στη πρωτεΐνη χαρακτηριστικά δείκτη επιθετικότητας. H cul1 έδειξε τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης και μία ισχυρή θετική συσχέτιση με την Skp2 στα ΔΛΜΒΚ, υποδεικνύοντας την παρουσία ενεργού SCF συμπλόκου, ωστόσο δεν παρατηρήθηκε παρόμοια συσχέτιση στους άλλους τύπους λεμφώματος. Υπερέκφραση της φωσφορυλιωμένης μορφής της p27 (pThr187-p27), δείχθηκε στα επιθετικότερα λεμφώματα. Επιπλέον, ισχυρή θετική συσχέτιση με το δείκτη πολλαπλασιασμού έδειξε η pThr187-p27, σε όλους τους τύπους λεμφώματος, δείχνοντας μία πιθανή σύνδεση της pThr187-p27 με την επιθετικότητα της νόσου. Συσχέτιση των παραπάνω πρωτεϊνών με τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα των των ασθενών δείχνουν ότι στα επιθετικά λεμφώματα η υπερέκφραση των Skp2 και pThr187-p27 συνδέεται με βραχύτερο διάστημα ελεύθερο νόσο, ενώ η υπερέκφραση της pThr187-p27 έδειξε να συνδέεται και με πτωχότερη ολική επιβίωση. Επίσης κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση, δείχθηκε για πρώτη φορά ότι η έκφραση της pThr187-p27 αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα για τη συνολική επιβίωση όχι μόνο ανάμεσα στις υπό μελέτη πρωτεΐνες αλλά και σε συνάρτηση με τις κλινικές παραμέτρους στα επιθετικά Β-λεμφώματα / Cell cycle is tightly regulated by a functionally conserved group of proteins which together constitute the basic cell division machinery that controls cell cycle progression. Altered expression of these proteins are almost always detected in human cancer cells. However, aberrant expression of these proteins can be the cause of malignant transformation but also in some cases, can be the consequence of cancer progression. The cell cycle regulators p27 and p21 play a central role in the suppression of tumorigenesis in a variety of human cancers. Of particular importance for the development of human cancers is the ubiquitin dependent degradation of p27 and p21 by the proteasome. This pathway is controlled by many complexes, however the most well studied is the SCFSkp2 complex. p27 and p21 proteins are phosphorylated at a conserved Threonine (T187) and Serine (Ser130) residue by cyclin E/A-cdk2 complexes, respectively, and the Skp2 protein facilitates the polyubiquitylation of p27 and p21 by the SCF complex. In the present study was examined the immunoexpression of p27, p21, Skp2, cul1, pThr187-p27, cyclin Α, cyclin Ε and CDK2 in 135 cases with B-cell Lymphoma with aggressive [66 DLBCL (35 nodal and 31 extranodal), 13 MCL (8 classical and 5 blastic) and 5 FL grade 3α/β)] and indolent biological behaviour [9 FL (3 G1, 6 G2), 20 MZL (12 nodal, 6 extranodal, 2 splenic) and 22 SLL]. P27 was overexpressed in indolent B-cell lymphomas. However, many cases with aggressive B-cell lymphoma, mainly DLBCLs (~40%, >30%),, showed increased expression of p27. In addition, all lymphoma cases except the FLs and MZLs failed to show an inverse correlation between p27 and Skp2. The highest expression of p21 was observed in DLBCL, indicating that p21 expression is associated with more aggressive neoplasias. The levels of p21 expression did not correlate with Skp2 and cul1, indicating that SCFSkp2 complex might not be capable for p21 degradation in B-cell lymphomas. Overexpression of Skp2 in DLBCLs, MCLs (mainly blastic type) and FL (Grade 3), as well as the strong positive correlation with cyclin A and CDK2, indicate that Skp2 may be a putative biomarker of tumor aggressiveness. The expression of cul1 was higher in DLBCLs, and correlate well with the expression of Skp2, indicating the presence of active SCFSkp2 complex. However, a similar correlation was not observed in other lymphoma groups. The phosphorylated form of p27 (pThr187-p27) was overexpressed in aggressive cases. Furthermore, a strong positive correlation between pThr187-p27 and the proliferation index, was observed in all lymphoma cases. This correlation may indicate that pThr187-p27 could be used as a marker of tumor aggressiveness. The correlation of the studied proteins with the clinical and laboratory data showed that in the aggressive lymphomas the expression of Skp2 and pThr187-p27 is associated with poor disease free survival rate, and pThr187-p27 is also associated with shorter overall survival. In the present study, the multivariant cox analysis showed that the expression of pThr187-p27 is an independent prosgnostic factor for the overall survival among other clinical parameters.

La rencontre des lymphocytes B matures avec l’antigène (Ag), au niveau des organes lymphoïdes secondaires, déclenche la maturation terminale, au cours de laquelle deux évènements peuvent avoir lieu : la commutation de classe de l’immunoglobuline (CSR pour Class Switch Recombination) et l’hypermutation somatique (SHM).Dernièrement, notre laboratoire a décrit pour la première fois la recombinaison suicide du locus IgH (LSR pour Locus Suicide Recombination) (Péron et al., 2012). Cette recombinaison engendre une délétion totale de l’ensemble des gènes constants du locus IgH, empêchant ainsi l’expression d’Ig, et donc l’absence du récepteur BCR (B Cell Receptor). La cellule B se retrouve privée des signaux de survie délivrés par ce récepteur, et est induite à l’apoptose. La LSR semble opérer par les mêmes étapes que la CSR : 1- la transcription de régions de l’ADN ciblées, 2- la génération de cassures double brin (CDB) à partir de lésions introduites par AID (Activation-induced cytidine deaminase), 3- la réparation de l’ADN lésé majoritairement par le système classique de ligation des extrémités non homologues (C-NHEJ). Cependant, la réparation au cours de la LSR n’a pas été pleinement décrite, et sa détermination constitue l’objectif principale de mon doctorat. Dans un premier temps, nous avons mis au point un programme bio-informatique « CSReport », afin d’analyser la masse de données générées par le séquençage haut débit de jonctions du locus IgH (CSR et LSR) (Boyer et al., 2017). Cet outil nous a permis d’étudier le système de réparation des CDB, à travers la détermination de la structure au point de jonction. De façon inattendue, nos résultats montrent que la réparation de l’ADN dans la LSR est similaire entre la souris et l’Homme et si la CSR fait intervenir le C-NHEJ, la LSR semble faire appel à l’A-EJ (Alternative End Joining) et/ou la HR (Homologous Recombination). Ces observations sont renforcées par les résultats mettant en évidence une différence de l’association de protéines de réparation, ainsi que des marques épigénétiques particulières entre les segments concernés par la CSR et ceux ciblés par la LSR chez la souris.Nous nous sommes ensuite interrogés sur la LSR dans le lymphome de Hodgkin (HL pour Hodgkin lymphoma), car l’absence de BCR à la surface des cellules de Reed Sternberg pourrait provenir de cet évènement. Les résultats de séquençage haut débit révèlent une réparation différente au cours de la LSR entre le HL et le contrôle (amygdales saines) ce qui nous laisser stipuler que des altérations intrinsèques aux systèmes de réparation de l’ADN dans les cellules tumorales sont en cause.Globalement, nous avons développé « CSReport », un outil qui nous permet d’analyser la structure de réparation de l’ADN en partie, et de montrer une réparation similaire des CDB entre la souris et l’Homme et une différence de réparation de l’ADN entre la recombinaison CSR et LSR. De plus, nous avons mis en évidence une altération de la réparation dans des échantillons de lymphomes B (HL et CLL) comparé à des contrôles (amygdales saines). / Mature B lymphocytes meeting with antigen (Ag) inside secondary lymphoid organs activates their terminal maturation, with occurrence of class switch recombination (CSR) and somatic hyper mutation (SHM).Recently, our laboratory described for the first time IgH locus suicide recombination (LSR) (Péron et al., 2012). This process removes the whole constant genes of the locus, preventing Ig and BCR (B Cell Receptor) expression. The B cell is devoid of survival signals delivered by its receptor and is induced to apoptosis.LSR seems to operate with same molecular steps as CSR : 1- transcription of targeted DNA regions, 2- generation of double strand breaks (DSB) from DNA lesions induced by AID (Activation-induced cytidine deaminase), 3- DNA repair by classical non homologous end joining (C-NHEJ) pathway. However, DNA repair during LSR was not fully understood, and this is the principal objectif of my PhD studies. First, we developped a bioinformatic program « CSReport », to analyse high throughput sequencing (HTS) datas of IgH locus junctions (CSR and LSR) (Boyer, Boutouil et al.,2017). This tool allowed us to study the DSB repair systems, through determination of the structure at the junction site. Unexpectedly, our results show that DNA repair in DNA during LSR is similar between mice and human, and if CSR implicates C-NHEJ, LSR seems to invlove Alternative end joining (A-EJ) and /or homologous recombination (HR). These observations are consolidated by results showing a difference in the association of repair proteins, and in particular epigenitic marks between DNA segments concerned by CSR and those targeted by LSR in mice. We asked ourselves about LSR in HL, because BCR absence on its Reed Sternberg cells surface may be a result of this recombination. HTS results reveal a different repair during LSR between HL and the control (healthy tonsils), which let us stipulate that alterations in DNA repair systems of tumoral cells are the cause.Globaly, we developped « CSReport », a tool which permits us to study DNA repair structure in a part, and to show a similar DSB repair systems between mice and human, and a difference between CSR and LSR repair. Furthermore, we show an alteration in DNA repair of B lymphoma samples (HL and CLL) compared with the control (healthy tonsils).