京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23801号 / 医博第4847号 / 新制||医||1058(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 小林 恭, 教授 竹内 理, 教授 金子 新 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Le rhabdomyosarcome (RMS) est le cancer des tissus mous le plus courant chez l'enfant, et moins de 30 % des patients à haut risque obtiennent une rémission. Par conséquent, il existe un besoin pour une immunothérapie nouvelle et efficace. Les cellules tueuses naturelles (NK), avec leur capacité intrinsèque à tuer les cellules cancéreuses, représentent un outil thérapeutique prometteur. Cependant, leur efficacité clinique est limitée. Ainsi, nous proposons de concevoir ces cellules avec un récepteur antigénique chimérique (CAR) qui permettra aux cellules NK de cibler plus efficacement les cellules de RMS. De plus, nous proposons aussi de concevoir grâce à la technologie CRISPR-Cas9, des NK n’exprimant pas NKG2A, un récepteur impliqué dans l'inhibition des cellules NK par le microenvironnement tumoral. Nous avons développé un vecteur lentiviral codant pour une construction CAR reconnaissant B7-H3 et FGFR4, deux protéines surexprimées à la surface des cellules RMS, associées à une queue intracellulaire optimisée pour l'activation des NK. Les cellules NK primaires expandues ont été transduites et triées en fonction de l'expression du CAR, conduisant à une population de cellules CAR+- NK enrichie. L'efficacité des deux CAR a été évaluée par des tests cytotoxiques et de dégranulation contre les lignées cellulaires de RMS, RH-30 et RD, toutes deux exprimant B7-H3 et FGFR4. Les résultats préliminaires ont montré une augmentation de la cytotoxicité de 20 % par rapport aux NK de type sauvage pour les CAR anti-B7-H3. Les cellules NK ont également été transduites pour éliminer l’expression du gène KLRC1, codant pour NKG2A, en utilisant CRISPR Cas9. Ceci a permis d’augmenter la cytotoxicité des NK de 20% à 25% comparativement aux NK qui expriment NKG2A. Nous avons aussi combiné les deux modifications génétiques, obtenant ainsi des NK qui expriment un CAR contre les cellules du RMS et n’exprimant pas NKG2A. Des résultats préliminaires nous ont permis d’observer que les NK doublement modifiées étaient 60% plus cytotoxiques que les NK non-transduites et 20% plus efficaces que les CAR-NK ou les NK n’exprimant pas NKG2A. Ce projet sera une preuve de principe qu'une thérapie hautement innovante basée sur l'ingénierie des cellules NK est efficace et applicable au cancer solide. / Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue cancer in childhood, and less than 30% of high-risk patients achieve remission. Therefore, there is a need for new and efficient immunotherapy. Natural killer (NK) cells, with their intrinsic ability to kill cancer cells, represent a promising therapeutic tool. However, their clinical efficacy is limited. Thus, we propose to engineer these cells with a Chimeric Antigen Receptor (CAR) that will allow NK cells to target RMS cells more efficiently and though the knock-out of NKG2A, a receptor involved in the inhibition of NK cells by the tumor microenvironment. We developed a lentiviral vector coding for a CAR construct recognizing B7-H3 and FGFR4, two proteins overexpressed at the surface of RMS cells, combined to an intracellular tail optimized for NK activation. Expanded primary NK cells were transduced and sorted based on CAR expression, leading to an enriched CAR+ -NK cells population. Efficacy of both CARs was evaluated by cytotoxic and degranulation assays against RH-30 and RD RMS cell lines, both expressing B7-H3 and FGFR4. Preliminary results showed an increase in cytotoxicity of 20% compared to wild type NK for CAR anti-B7-H3. NK cells were also knocked-out for the gene coding for NKG2A, using CRISPR Cas9, thereby increasing cytotoxicity by 20% to 25%. The combination of both genetic modifications should significantly increase the efficacy of NK-cell based therapy in RMS. Indeed, preliminary results allowed us to observe that doubly modified NKs were more than 60% more cytotoxic than non-transduced NKs and 20% more effective than CAR-NKs or NKs not expressing NKG2A. This project will be a proof of principle that a highly innovative therapy based on NK-cell engineering is efficient and applicable to solid cancer.