No description available.

Research Doctorate - Doctor of Philosophy (PhD) / Reversible protein phosphorylation plays a central role in the regulation of intracellular signalling, and is controlled by the opposing activities of protein kinases and phosphatases. Deregulation of these mechanisms can result in increased proliferation and enhanced survival, which is a hallmark feature of malignant transformation. For example, over 90% of chronic myeloid leukaemia (CML) patients express the BCR/ABL oncoprotein, which exhibits unrestrained tyrosine kinase activity. In addition, activating mutations within the receptor tyrosine kinase, c-KIT, contribute to the pathogenesis of gastrointestinal stromal tumours (GIST), systemic mastocytosis, acute myeloid leukaemia (AML), testicular seminoma and melanoma. The advent of small molecule tyrosine kinase inhibitors, such as imatinib, has revolutionised the treatment of malignancies driven by these oncogenic kinases. However, a proportion of patients are either unresponsive or develop resistance, and as such, relapse and disease progression is a major clinical problem. In order to improve the treatment outcome for these patients, a greater understanding of the signalling pathways regulated downstream of BCR/ABL and c-KIT is required. The data presented in this thesis indicates that oncogenic BCR/ABL and mutant c-KIT both require inhibition of the tumour suppressor, protein phosphatase 2A (PP2A), to induce tumourigenesis. PP2A is a large family of serine/threonine phosphatases that provide the fine control on signalling pathways by governing the rate and duration of phosphorylation. The heterotrimeric PP2A enzyme is comprised of a structural subunit (PP2A Aα and Aβ), a catalytic subunit (PP2Acα and cβ) and a regulatory subunit, which consists of three unrelated families: B55 (α, β, γ, δ), B56 (α, β, γ, δ, ε) and B" (PR72/130 / PR70/48). Binding of the regulatory subunit to the core PP2A AC dimer directs both the substrate specificity and cellular localisation of the enzyme. The combinatorial assembly of these individual components permits the formation of distinct complexes which have been implicated in numerous cellular functions such as proliferation, survival and mitosis. In particular, important roles for PP2A in various aspects of malignant transformation are beginning to emerge. Recent work demonstrates that PP2A is functionally inactivated by BCR/ABL in myeloid progenitor cells. Using the mouse myeloid progenitor cell line, FDC-P1, these observations were confirmed in the current study. Detailed investigation into the underlying mechanisms have demonstrated for the first time that active BCR/ABL increases the expression of the PP2A structural and certain regulatory subunits. This alters the PP2A holoenzyme composition and results in the abundance of complexes containing B55α and B56α. Consequently, B56γ, a known tumour suppressive subunit, appears to be simultaneously displaced. To investigate which subunits are functionally important for BCR/ABL-mediated leukaemogenesis, individual PP2A subunits were targeted with shRNA sequences in WT BCR/ABL FDC-P1 cells. Subsequent evaluation identified B56α as a key player which facilitates the leukaemic phenotype. In accordance with an increase in PP2A activity, knockdown of B56α significantly inhibited the cellular growth and reduced the clonogenic potential of BCR/ABL⁺ myeloid progenitors. Furthermore, suppression of the B56δ subunit in WT BCR/ABL FDC-P1 cells appears to delay progression through the cell cycle. Together, these findings provide new insights into the biology of PP2A and begin to define the precise mechanisms by which BCR/ABL induces leukaemogenesis via PP2A in CML. Investigation of the regulation of PP2A was also extended to the oncogenic tyrosine kinase, c-KIT. Using FDC-P1 cells expressing imatinib-sensitive (V560G) or –resistant (D816V) mutant c-KIT, this work demonstrates for the first time that constitutive activation of c-KIT impairs the activity of PP2A, and this is essential for tumourigenesis. Pharmacological reactivation of PP2A with FTY720 significantly reduced the proliferation, impaired the clonogenic potential and induced apoptosis of oncogenic c-KIT cells, whilst having no effect on empty vector controls or WT c-KIT cells stimulated with stem cell factor (SCF). These cytotoxic effects of FTY720 are mediated, in part, by the rapid dephosphorylation, and hence inactivation, of oncogenic c-KIT receptors. These promising in vitro findings were translated into an in vivo model, where the daily administration of FTY720 significantly delayed the growth of mutant c-KIT⁺ tumours. Furthermore, FTY720 markedly prevented the infiltration of D816V c-KIT tumour cells into secondary lymphoid organs, such as the spleen and bone marrow. As a result, the survival of FTY720-treated mice was significantly prolonged compared to saline-treated controls. Overall, this body of work greatly enhances our understanding of PP2A function and identifies the complex mechanisms of PP2A regulation by the oncogenic tyrosine kinases, BCR/ABL and c-KIT. Taken together, the data suggests that inhibition of PP2A may represent a general mechanism employed by constitutively active kinases to facilitate tumour growth. As such, this work supports the future application of PP2A-activating agents in a broad range of human malignancies.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é resultante da proliferação clonal de uma célula tronco hematopoética, caracterizada por três fases bem definidas: crônica, acelerada e blástica e pela presença de uma anormalidade citogenética específica, o cromossomo Philadelphia (Ph). O cromossomo Ph é produto da translocação recíproca t(9;22)(q34;q11) que leva ao surgimento de um gene híbrido BCR-ABL cuja oncoproteína homônima, de 210 KD, tem uma atividade tirosino quinase intensa e desregulada, muito superior a da proteína ABL, de 145 KD. Esta atividade desregulada da proteína BCR-ABL confere o fenótipo da doença. Ao longo dos anos, houveram vários marcos terapêuticos no tratamento da LMC, desde bussulfan (BU) e hidroxiuréia (HU), até o advento do transplante alogênico de células tronco hematopoéticas (TCTH), alfa-interferon (α-IFN) e a infusões de linfócitos do doador na recaída pós transplante. O mesilato de imatinibe, aprovado pelas autoridades regulatórias em 2001, cujo alvo é a proteína BCR-ABL, revolucionou o tratamento da LMC, produzindo os melhores efeitos terapêuticos já alcançados, com exceção do TCTH. O TCTH continua sendo o tratamento comprovadamente capaz de promover a cura da doença, apesar da elevada morbi-mortalidade responsável por uma considerável redução em sua indicação terapêutica. Os resultados dos ensaios clínicos internacionais demonstraram a segurança e a eficácia do imatinibe, determinaram suas doses padrão, seus efeitos adversos e a superioridade na indução de respostas hematológicas completas (RHC), resposta citogenética maior (RCGM), melhor tolerabilidade e, principalmente, elevada freqüência de 16 resposta molecular maior (RMM), resultados jamais obtidos com o α-IFN, terapia de escolha até então. Objetivos e Métodos: O objetivo desta dissertação de mestrado é realizar um estudo de coorte retrospectivo através da análise de prontuários dos pacientes com LMC em tratamento com mesilato de imatinibe no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS), e descrever sua evolução quanto às respostas hematológicas e citogenéticas, sobrevida livre de progressão (SLP), sobrevida global (SG) e advento de efeitos adversos em um seguimento de 18 meses desde o início do tratamento com imatinibe. Resultados: Foram incluídos 81 pacientes que foram subdivididos em fase crônica inicial ou fase crônica tardia, fase acelerada ou fase blástica, de acordo com a fase da LMC em que estavam no início do tratamento com imatinibe. RHC foi alcançada por 90,9% dos pacientes em fase crônica inicial, 92,8% em fase crônica tardia e em 60,0% dos pacientes em fase acelerada. RGCM foi obtida por 83,3%, 85,7% e 20,0% nas fases crônica inicial, tardia e acelerada, respectivamente, enquanto a SLP foi de 83,3%, 94,7% e 58,8%. A probabilidade de SG foi de 91,7% na fase crônica inicial, 100% na tardia, 86,2% na fase acelerada e 0% na fase blástica. Os pacientes em fase blástica foram incluídos apenas para análise de SG. Na fase crônica inicial ou tardia, 5,3% dos pacientes apresentaram efeitos tóxicos de graus 3 ou 4 enquanto na fase acelerada, 23,5%. Quanto aos efeitos tóxicos hematológicos, pancitopenia ocorreu em 10,9%, principalmente na fase crônica tardia. Apenas 6,8% dos pacientes nas fases crônica ou acelerada suspenderam a terapia devido à toxicidade do tratamento. Conclusão: Os pacientes tratados com mesilato de imatinibe no HCPA, atendidos a parte de ensaios clínicos, apresentaram elevada freqüência de respostas hematológicas e citogenéticas, SLP e SG semelhantes às descritas na literatura mundial, justificando o investimento feito pelo SUS na aquisição deste medicamento.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é resultante da proliferação clonal de uma célula tronco hematopoética, caracterizada por três fases bem definidas: crônica, acelerada e blástica e pela presença de uma anormalidade citogenética específica, o cromossomo Philadelphia (Ph). O cromossomo Ph é produto da translocação recíproca t(9;22)(q34;q11) que leva ao surgimento de um gene híbrido BCR-ABL cuja oncoproteína homônima, de 210 KD, tem uma atividade tirosino quinase intensa e desregulada, muito superior a da proteína ABL, de 145 KD. Esta atividade desregulada da proteína BCR-ABL confere o fenótipo da doença. Ao longo dos anos, houveram vários marcos terapêuticos no tratamento da LMC, desde bussulfan (BU) e hidroxiuréia (HU), até o advento do transplante alogênico de células tronco hematopoéticas (TCTH), alfa-interferon (α-IFN) e a infusões de linfócitos do doador na recaída pós transplante. O mesilato de imatinibe, aprovado pelas autoridades regulatórias em 2001, cujo alvo é a proteína BCR-ABL, revolucionou o tratamento da LMC, produzindo os melhores efeitos terapêuticos já alcançados, com exceção do TCTH. O TCTH continua sendo o tratamento comprovadamente capaz de promover a cura da doença, apesar da elevada morbi-mortalidade responsável por uma considerável redução em sua indicação terapêutica. Os resultados dos ensaios clínicos internacionais demonstraram a segurança e a eficácia do imatinibe, determinaram suas doses padrão, seus efeitos adversos e a superioridade na indução de respostas hematológicas completas (RHC), resposta citogenética maior (RCGM), melhor tolerabilidade e, principalmente, elevada freqüência de 16 resposta molecular maior (RMM), resultados jamais obtidos com o α-IFN, terapia de escolha até então. Objetivos e Métodos: O objetivo desta dissertação de mestrado é realizar um estudo de coorte retrospectivo através da análise de prontuários dos pacientes com LMC em tratamento com mesilato de imatinibe no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS), e descrever sua evolução quanto às respostas hematológicas e citogenéticas, sobrevida livre de progressão (SLP), sobrevida global (SG) e advento de efeitos adversos em um seguimento de 18 meses desde o início do tratamento com imatinibe. Resultados: Foram incluídos 81 pacientes que foram subdivididos em fase crônica inicial ou fase crônica tardia, fase acelerada ou fase blástica, de acordo com a fase da LMC em que estavam no início do tratamento com imatinibe. RHC foi alcançada por 90,9% dos pacientes em fase crônica inicial, 92,8% em fase crônica tardia e em 60,0% dos pacientes em fase acelerada. RGCM foi obtida por 83,3%, 85,7% e 20,0% nas fases crônica inicial, tardia e acelerada, respectivamente, enquanto a SLP foi de 83,3%, 94,7% e 58,8%. A probabilidade de SG foi de 91,7% na fase crônica inicial, 100% na tardia, 86,2% na fase acelerada e 0% na fase blástica. Os pacientes em fase blástica foram incluídos apenas para análise de SG. Na fase crônica inicial ou tardia, 5,3% dos pacientes apresentaram efeitos tóxicos de graus 3 ou 4 enquanto na fase acelerada, 23,5%. Quanto aos efeitos tóxicos hematológicos, pancitopenia ocorreu em 10,9%, principalmente na fase crônica tardia. Apenas 6,8% dos pacientes nas fases crônica ou acelerada suspenderam a terapia devido à toxicidade do tratamento. Conclusão: Os pacientes tratados com mesilato de imatinibe no HCPA, atendidos a parte de ensaios clínicos, apresentaram elevada freqüência de respostas hematológicas e citogenéticas, SLP e SG semelhantes às descritas na literatura mundial, justificando o investimento feito pelo SUS na aquisição deste medicamento.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é resultante da proliferação clonal de uma célula tronco hematopoética, caracterizada por três fases bem definidas: crônica, acelerada e blástica e pela presença de uma anormalidade citogenética específica, o cromossomo Philadelphia (Ph). O cromossomo Ph é produto da translocação recíproca t(9;22)(q34;q11) que leva ao surgimento de um gene híbrido BCR-ABL cuja oncoproteína homônima, de 210 KD, tem uma atividade tirosino quinase intensa e desregulada, muito superior a da proteína ABL, de 145 KD. Esta atividade desregulada da proteína BCR-ABL confere o fenótipo da doença. Ao longo dos anos, houveram vários marcos terapêuticos no tratamento da LMC, desde bussulfan (BU) e hidroxiuréia (HU), até o advento do transplante alogênico de células tronco hematopoéticas (TCTH), alfa-interferon (α-IFN) e a infusões de linfócitos do doador na recaída pós transplante. O mesilato de imatinibe, aprovado pelas autoridades regulatórias em 2001, cujo alvo é a proteína BCR-ABL, revolucionou o tratamento da LMC, produzindo os melhores efeitos terapêuticos já alcançados, com exceção do TCTH. O TCTH continua sendo o tratamento comprovadamente capaz de promover a cura da doença, apesar da elevada morbi-mortalidade responsável por uma considerável redução em sua indicação terapêutica. Os resultados dos ensaios clínicos internacionais demonstraram a segurança e a eficácia do imatinibe, determinaram suas doses padrão, seus efeitos adversos e a superioridade na indução de respostas hematológicas completas (RHC), resposta citogenética maior (RCGM), melhor tolerabilidade e, principalmente, elevada freqüência de 16 resposta molecular maior (RMM), resultados jamais obtidos com o α-IFN, terapia de escolha até então. Objetivos e Métodos: O objetivo desta dissertação de mestrado é realizar um estudo de coorte retrospectivo através da análise de prontuários dos pacientes com LMC em tratamento com mesilato de imatinibe no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), atendidos pelo Sistema Único de Saúde (SUS), e descrever sua evolução quanto às respostas hematológicas e citogenéticas, sobrevida livre de progressão (SLP), sobrevida global (SG) e advento de efeitos adversos em um seguimento de 18 meses desde o início do tratamento com imatinibe. Resultados: Foram incluídos 81 pacientes que foram subdivididos em fase crônica inicial ou fase crônica tardia, fase acelerada ou fase blástica, de acordo com a fase da LMC em que estavam no início do tratamento com imatinibe. RHC foi alcançada por 90,9% dos pacientes em fase crônica inicial, 92,8% em fase crônica tardia e em 60,0% dos pacientes em fase acelerada. RGCM foi obtida por 83,3%, 85,7% e 20,0% nas fases crônica inicial, tardia e acelerada, respectivamente, enquanto a SLP foi de 83,3%, 94,7% e 58,8%. A probabilidade de SG foi de 91,7% na fase crônica inicial, 100% na tardia, 86,2% na fase acelerada e 0% na fase blástica. Os pacientes em fase blástica foram incluídos apenas para análise de SG. Na fase crônica inicial ou tardia, 5,3% dos pacientes apresentaram efeitos tóxicos de graus 3 ou 4 enquanto na fase acelerada, 23,5%. Quanto aos efeitos tóxicos hematológicos, pancitopenia ocorreu em 10,9%, principalmente na fase crônica tardia. Apenas 6,8% dos pacientes nas fases crônica ou acelerada suspenderam a terapia devido à toxicidade do tratamento. Conclusão: Os pacientes tratados com mesilato de imatinibe no HCPA, atendidos a parte de ensaios clínicos, apresentaram elevada freqüência de respostas hematológicas e citogenéticas, SLP e SG semelhantes às descritas na literatura mundial, justificando o investimento feito pelo SUS na aquisição deste medicamento.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa resultante da expansão clonal da célula hematopoética precursora. Sua fisiopatologia está associada ao cromossomo (cr) Philadelphia (Ph) originado da t(9;22) e ao oncogene bcr-abl1 que codifica a proteína Bcr-Abl1 com constitutiva atividade de tirosinoquinase (TK). A expressão de Bcr-Abl determina a leucemogênese por meio da alteração da adesão das células progenitoras leucêmicas ao estroma medular e resistência à apoptose. Os inibidores de TK, o mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe são utilizados no tratamento da LMC, entretanto, casos de resistência têm sido relacionados à presença de mutações em Bcr-Abl1, duplicação do cr Ph e superexpressão do gene bcr-abl1. A resistência ou refratariedade de alguns pacientes ao tratamento com inibidores de TK impulsiona a realização de estudos para melhor conhecimento da fisiopatologia da LMC e descrição de novos alvos terapêuticos. Nesse contexto, o presente estudo investigou a participação de microRNAs na modulação da expressão de genes que regulam a apoptose. O objetivo geral deste trabalho foi investigar o efeito de bcr-abl1 e da atividade tirosinoquinase de Bcr-abl na expressão desses miRNAs em linhagens celulares e pacientes com LMC. O RNA das linhagens celulares, de pacientes e controles foram obtidos por meio da extração com Trizol® e o cDNA sintetizado com o kit High Capacity cDNA reverse transcription. A expressão dos microRNAs e dos genes alvoss foi quantificada por PCR em tempo real utilizando o kit SYBR Green PCR Master Mix® e TaqMan Universal PCR Master Mix®. A inibição de Bcr-Abl1 na linhagem HL-60.Bcr-Abl1 tratada com o mesilato de imatinibe aumentou a expressão de miR-let-7d, miR-15a, miR-130a e miR-145 e diminuiu os níveis de miR-21. O tratamento com dasatinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a e miR-142-3p. O nilotinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a e miR-145 e, diminuiu os níveis de miRlet- 7d e miR-21. Os resultados obtidos da análise entre os de pacientes com LMC em diferentes fases da doença mostraram elevados níveis de miR-15a, miR-130b e miR-145 em pacientes na fase crônica versus controles e baixos níveis de miR-16, miR-26a e miR-146a. Pacientes em fases avançadas versus controles apresentaram baixa expressão de miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a. Baixos níveis de miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a foram observados nas fases avançadas da LMC em relação a fase crônica. Os genes anti-apoptóticos a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 e ciap-2 estavam mais elevados na fase crônica do que nos controles. A expressão do gene c-flip estava diminuída e dos genes a1, ciap-1 e mcl-1 aumentada nas fases avançadas em relação aos controles e a fase crônica. Pacientes com LMC resistentes ao MI apresentaram menores níveis de miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a e dos genes anti-apoptóticos ciap-1 e mcl-1. Os dados obtidos sugerem que a TK Bcr-Abl modula a expressão de microRNAs que possuem como alvos genes que regulam a apoptose celular / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resulting from clonal expasion of hematopoietic precursor cells. Its physiopathology is associated to Philadelphia (Ph) chromosome (cr) originated from the t(9;22) and bcr-abl1 oncogene that encodes the Bcr-Abl protein with constitutive tyrosine kinase activity (TK). The Bcr-Abl1 expression determines leukemogenesis by altering the leukemic progenitor cells´ adhesion by bone marrow stroma and apoptosis resistance. TK inhibitors imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib are used to treat CML, however, cases of resistance have been linked to mutation in Bcr-Abl1, duplication of the cr Ph and overexpression of the bcr-abl1. The resistance or refractoriness of some patients to treatment with TK inhibitors drives the studies to better understand the CML physiopathology and description of new therapeutic targets. In this context, this study investigated the participation of microRNAs in modulating expression of the genes that regulate apoptosis. The aim of this study was to investigate the effect of Bcr- Abl1 and its kinase activity in the expression of miRNAs in cell lines and CML patients. The RNA from cell lines, patients and controls were obtained by extraction with Trizol® and cDNA was synthesized with the kit High Capacity cDNA reverse transcription. The expression of miRNAs and target genes was quantified by real time PCR using SYBR Green PCR Master Mix® kit and TaqMan Universal PCR Master Mix®. The Bcr-Abl1 inhibition in the cell line HL-60.Bcr-Abl1 treated with imatinib mesylate increased the expression of miR-let- 7d, miR-15a, miR-130a and miR-145 and decreased miR-21 levels. Treatment with dasatinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a and miR- 142-3p. Nilotinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a and miR- 145 and, decreased miR-let-7d and miR-21 levels. The results of the analysis among patients with CML in different stages of disease showed high levels of miR-15a, miR-130b and miR-145 in chronic phase versus controls and low levels of miR-16, miR-26a and miR-146a. Patients in advanced phases versus controls showed low expression of miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a. Low levels of miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a were observed in CML advanced phases when compared with chronic phase. The antiapoptotic genes a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 and ciap-2 were higher in chronic phase than in controls. The c-flip expression was decreased and a1, ciap-1 and mcl-1 expression was increased in advanced phases when compared to controls and chronic phase. CML patients resistant to imatinib mesylate presented low levels of miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a and ciap-1 and mcl-1 antiapoptotic genes. The data obtained suggest that Bcr-Abl1 TK modulates the miRNA expression which has target genes involved in the apoptosis´ regulation.

Submitted by admin tede (tede@pucgoias.edu.br) on 2017-02-06T16:52:19Z No. of bitstreams: 1 Caio Bruno Quinta de Souza Leal.pdf: 116273125 bytes, checksum: 5e247a988672d255dad21fa0aedcc5da (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-06T16:52:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Caio Bruno Quinta de Souza Leal.pdf: 116273125 bytes, checksum: 5e247a988672d255dad21fa0aedcc5da (MD5) Previous issue date: 2014-01-31 / Monitoring of minimal residual disease (MRD) in patients with Chronic Myeloid Leukemia (CML) who receive treatment with Imatib mesylate (IM) is extremely important, because it enables the evaluation of the response to the treatment and the early diagnosis of possible recurrences. The objective of this study was to standardize molecular methods used in order to monitor MRD in patients with CML, on therapy with IM. Peripheral blood samples were collected from 11 patients diagnosed with CML in October 2012 to September 2013, in the Department of Hematology of Hospital Araújo Jorge of the Association to Combat Cancer in Goiás. Three months after starting treatment, patients underwent a new peripheral blood collection for evaluation of MRD. Detecting bcr-abl transcripts and endogenous controls (abl and β2m) employed reverse transcription methods associated with polymerase chain reaction (RT-PCR), while quantification of bcr-abl transcripts was achieved by using reverse transcription associated with real-time PCR (RQ-PCR) and Taqman probes. Specific oligonucleotides and probes recognizing e13a2 and e14a2 junctions of bcr-abl transcripts and to the abl endogenous control were used in this study. By the time of diagnosis, three patients (27.3%) expressed the b2a2 transcript, five patients (45.5%) expressed the b3a2 transcript, two patients (18.2%) expressed both transcripts and one patient (9%) did not express any of the transcripts. The endogenous controls analysis resulted in better amplification for the abl transcript, which was used in the RQ-PCR reactions. The assessment of DRM was possible in only eight patients, due to the loss of follow-up. Three months after starting treatment with IM, all patients presented complete hematologic response. However, only one patient (12.5%) presented the undetectable transcript, reaching the full molecular response, while the other seven patients (87.95%) presented MRD. One (12.5%) of the seven patients who presented MRD, reached complete molecular response, while six patients (75%) presented a reduction of two logs, achieving minor molecular response, and one patient (12.5%) presented only partial molecular response. By using molecular biology methods, our results have enabled the standardization and the establishment of a laboratory routine, according to the international guidelines, for monitoring MRD in patients with CML. / O monitoramento de doença residual mínima (DRM) em pacientes com leucemia meilóide crônica (LMC) que recebem tratamento com mesilato de imatibe (MI) é extremamente relevante, pois possibilita o acompanhamento da resposta e o diagnóstico precoce de eventuais recidivas da doença. O objetivo deste estudo foi padronizar métodos moleculares utilizados na avaliação de DRM em pacientes com LMC, em tratamento com MI. Amostras de sangue periférico foram coletadas de 11 pacientes diagnosticados com LMC, no período de outubro de 2012 a setembro de 2013, no Setor de Hematologia do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Três meses após o início do tratamento, os pacientes foram submetidos a uma nova coleta de sangue periférico para avaliação de DRM. A detecção dos transcritos bcr-abl e controles endógenos (abl e β2m) empregaram os métodos de transcrição reversa associados à reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), enquanto a quantificação dos transcritos bcr-abl foi feita por meio de transcrição reversa associada à PCR em tempo real (RQ-PCR), utilizando a metodologia de sondas de hidrólise (TaqMan). Oligonucleotídeos e sondas Taqman específicos para as junções e13a2 e e14a2 dos transcritos bcr-abl e para o controle endógeno (abl) foram usados neste estudo. Ao diagnóstico, três pacientes (27,3%) expressaram o transcrito b2a2, cinco pacientes (45,5%) o transcrito b3a2, dois pacientes (18,2%) expressaram ambos os transcritos e um paciente (9%) não expressou nenhum dos transcritos. A amplificação dos controles endógenos resultou em melhor amplificação para o transcrito abl, que foi usado nas reações de RQ-PCR. A avaliação de DRM foi possível em oito pacientes, devido à perda de seguimento dos demais. Três meses após o início do tratamento com MI, todos os pacientes apresentaram resposta hematológica completa. No entanto, apenas um paciente (12,5%) apresentou o transcrito bcr-abl indetectável, alcançando a reposta molecular completa, enquanto os outros sete pacientes (87,95%) apresentaram DRM. Dentre os sete pacientes que apresentaram DRM, seis (75%) apresentaram redução de um a dois logs, alcançando resposta molecular menor, enquanto um (12,5%) apresentou resposta molecular parcial. Nossos resultados possibilitaram a padronização e o estabelecimento de uma rotina segundo as diretrizes internacionais, para monitoramento da DRM em pacientes com LMC, utilizando métodos de biologia molecular.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:38:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CAIO BRUNO QUINTA DE SOUZA LEAL - PARTE 1.pdf: 34304765 bytes, checksum: 476dda15021939ae8be633403ae9dabe (MD5) Previous issue date: 2014-01-31 / Monitoring of minimal residual disease (MRD) in patients with Chronic Myeloid Leukemia (CML) who receive treatment with Imatib mesylate (IM) is extremely important, because it enables the evaluation of the response to the treatment and the early diagnosis of possible recurrences. The objective of this study was to standardize molecular methods used in order to monitor MRD in patients with CML, on therapy with IM. Peripheral blood samples were collected from 11 patients diagnosed with CML in October 2012 to September 2013, in the Department of Hematology of Hospital Araújo Jorge of the Association to Combat Cancer in Goiás. Three months after starting treatment, patients underwent a new peripheral blood collection for evaluation of MRD. Detecting bcr-abl transcripts and endogenous controls (abl and β2m) employed reverse transcription methods associated with polymerase chain reaction (RT-PCR), while quantification of bcr-abl transcripts was achieved by using reverse transcription associated with real-time PCR (RQ-PCR) and Taqman probes. Specific oligonucleotides and probes recognizing e13a2 and e14a2 junctions of bcr-abl transcripts and to the abl endogenous control were used in this study. By the time of diagnosis, three patients (27.3%) expressed the b2a2 transcript, five patients (45.5%) expressed the b3a2 transcript, two patients (18.2%) expressed both transcripts and one patient (9%) did not express any of the transcripts. The endogenous controls analysis resulted in better amplification for the abl transcript, which was used in the RQ-PCR reactions. The assessment of DRM was possible in only eight patients, due to the loss of follow-up. Three months after starting treatment with IM, all patients presented complete hematologic response. However, only one patient (12.5%) presented the undetectable transcript, reaching the full molecular response, while the other seven patients (87.95%) presented MRD. One (12.5%) of the seven patients who presented MRD, reached complete molecular response, while six patients (75%) presented a reduction of two logs, achieving minor molecular response, and one patient (12.5%) presented only partial molecular response. By using molecular biology methods, our results have enabled the standardization and the establishment of a laboratory routine, according to the international guidelines, for monitoring MRD in patients with CML. / O monitoramento de doença residual mínima (DRM) em pacientes com leucemia meilóide crônica (LMC) que recebem tratamento com mesilato de imatibe (MI) é extremamente relevante, pois possibilita o acompanhamento da resposta e o diagnóstico precoce de eventuais recidivas da doença. O objetivo deste estudo foi padronizar métodos moleculares utilizados na avaliação de DRM em pacientes com LMC, em tratamento com MI. Amostras de sangue periférico foram coletadas de 11 pacientes diagnosticados com LMC, no período de outubro de 2012 a setembro de 2013, no Setor de Hematologia do Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Três meses após o início do tratamento, os pacientes foram submetidos a uma nova coleta de sangue periférico para avaliação de DRM. A detecção dos transcritos bcr-abl e controles endógenos (abl e β2m) empregaram os métodos de transcrição reversa associados à reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), enquanto a quantificação dos transcritos bcr-abl foi feita por meio de transcrição reversa associada à PCR em tempo real (RQ-PCR), utilizando a metodologia de sondas de hidrólise (TaqMan). Oligonucleotídeos e sondas Taqman específicos para as junções e13a2 e e14a2 dos transcritos bcr-abl e para o controle endógeno (abl) foram usados neste estudo. Ao diagnóstico, três pacientes (27,3%) expressaram o transcrito b2a2, cinco pacientes (45,5%) o transcrito b3a2, dois pacientes (18,2%) expressaram ambos os transcritos e um paciente (9%) não expressou nenhum dos transcritos. A amplificação dos controles endógenos resultou em melhor amplificação para o transcrito abl, que foi usado nas reações de RQ-PCR. A avaliação de DRM foi possível em oito pacientes, devido à perda de seguimento dos demais. Três meses após o início do tratamento com MI, todos os pacientes apresentaram resposta hematológica completa. No entanto, apenas um paciente (12,5%) apresentou o transcrito bcr-abl indetectável, alcançando a reposta molecular completa, enquanto os outros sete pacientes (87,95%) apresentaram DRM. Dentre os sete pacientes que apresentaram DRM, seis (75%) apresentaram redução de um a dois logs, alcançando resposta molecular menor, enquanto um (12,5%) apresentou resposta molecular parcial. Nossos resultados possibilitaram a padronização e o estabelecimento de uma rotina segundo as diretrizes internacionais, para monitoramento da DRM em pacientes com LMC, utilizando métodos de biologia molecular

Les oncogènes Bcr-Abl (p190bcr-abl et p210bcr-abl) sont issus d'une translocation chromosomique t(9,22) qui fusionne en phase les gènes bcr et c-abl. p210bcr-abl est généralement responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) alors que p190bcr-abl induit un sous type de Leucémie Aigue Lymphoblastique (LAL). La seule différence structurale entre ces deux protéines est la présence d'un domaine DH/PH au sein de p210bcr-abl activateur spécifique de RhoA. L'expression de Bcr-Abl dans la lignée Ba/F3 est associée au déclenchement d'une migration spontanée, dépourvue de directionnalité, sous la dépendance de la GTPase Rac1.L'activation de RhoA, spécifique des cellules Ba/F3p210, est associée à un phénotype migratoire amœboïde dans une matrice de Matrigel™ en 3D où les cellules Ba/F3p190 dépourvues de RhoA activé, présentent une mobilité de type roulement. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que l'activation spécifique de ROCK1 par RhoA détermine deux voies parallèles et mutuellement indispensables pour le mouvement amœboïde : 1) la voie de la Chaine Légère de Myosine (CLM) 2) celle des protéines de la famille ADF (Actin Depolymerizing Factor), et plus particulièrement l'isoforme ADF/destrine. Nous démontrons également l'existence d'invadopodes spécifiquement dans les cellules Ba/F3p190, dont la formation est sous la dépendance de l'absence d'activation de RhoA corrélée à une augmentation de l'activation de Cdc42. Enfin nous démontrons que la voie de signalisation RhoA/ROCK est spécifiquement activée dans les progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issus de patients atteints de LMC et ce, indépendamment de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl. / Bcr-Abl chimeric oncogenes (p190bcr-abl and p210bcr-abl) result from the t(9,22) chromosomal translocation that fuse the bcr and the c-abl genes. p210bcr-abl and p190bcr-abl are associated with Chronic Myelogenous Leukemia (CML) and a subset of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) respectively. The only difference between these two chimeras is the presence of a specific RhoA-GEF domain in the p210bcr-abl oncogene. Bcr-Abl expression in Ba/F3 lymphoblasts induces spontaneous migration of these cells without apparent directionality. Motility triggering of Bcr-Abl-expressing Ba/F3 depends on the RhoGTPase Rac1.RhoA activity is associated with a typical amoeboid movement of Ba/F3p210 cells embedded in Matrigel™ 3D matrix, whereas the Ba/F3p190 cells, devoid of RhoA activity, display a rolling-type motility. In this work we showed that activation of the RhoA effector ROCK1 triggers two parallel pathways which are both necessary for amoeboid movement: 1) the Myosin Light chain (MLC) pathway 2) ADF family proteins (Actin Depolymerizing Factor) pathway, specifically the ADF/destrin isoform. Besides, we showed that Ba/F3p190 cells could assemble invadopodia-like structures. The formation of these structures is driven by the reduction of RhoA activity associated with the absence of the DH/PH domain in p190bcr-abl and correlates with an increase in Cdc42 activity. We finally demonstrated that the RhoA/ROCK pathway is constitutively activated in CD34+ cells isolated from CML patients while not in their normal counterparts. We also demonstrated that this activation is independent of the tyrosine Kinase activity of Bcr-Abl.

A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa resultante da expansão clonal da célula hematopoética precursora. Sua fisiopatologia está associada ao cromossomo (cr) Philadelphia (Ph) originado da t(9;22) e ao oncogene bcr-abl1 que codifica a proteína Bcr-Abl1 com constitutiva atividade de tirosinoquinase (TK). A expressão de Bcr-Abl determina a leucemogênese por meio da alteração da adesão das células progenitoras leucêmicas ao estroma medular e resistência à apoptose. Os inibidores de TK, o mesilato de imatinibe, dasatinibe e nilotinibe são utilizados no tratamento da LMC, entretanto, casos de resistência têm sido relacionados à presença de mutações em Bcr-Abl1, duplicação do cr Ph e superexpressão do gene bcr-abl1. A resistência ou refratariedade de alguns pacientes ao tratamento com inibidores de TK impulsiona a realização de estudos para melhor conhecimento da fisiopatologia da LMC e descrição de novos alvos terapêuticos. Nesse contexto, o presente estudo investigou a participação de microRNAs na modulação da expressão de genes que regulam a apoptose. O objetivo geral deste trabalho foi investigar o efeito de bcr-abl1 e da atividade tirosinoquinase de Bcr-abl na expressão desses miRNAs em linhagens celulares e pacientes com LMC. O RNA das linhagens celulares, de pacientes e controles foram obtidos por meio da extração com Trizol® e o cDNA sintetizado com o kit High Capacity cDNA reverse transcription. A expressão dos microRNAs e dos genes alvoss foi quantificada por PCR em tempo real utilizando o kit SYBR Green PCR Master Mix® e TaqMan Universal PCR Master Mix®. A inibição de Bcr-Abl1 na linhagem HL-60.Bcr-Abl1 tratada com o mesilato de imatinibe aumentou a expressão de miR-let-7d, miR-15a, miR-130a e miR-145 e diminuiu os níveis de miR-21. O tratamento com dasatinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a e miR-142-3p. O nilotinibe aumentou a expressão de miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a e miR-145 e, diminuiu os níveis de miRlet- 7d e miR-21. Os resultados obtidos da análise entre os de pacientes com LMC em diferentes fases da doença mostraram elevados níveis de miR-15a, miR-130b e miR-145 em pacientes na fase crônica versus controles e baixos níveis de miR-16, miR-26a e miR-146a. Pacientes em fases avançadas versus controles apresentaram baixa expressão de miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a. Baixos níveis de miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 e miR-146a foram observados nas fases avançadas da LMC em relação a fase crônica. Os genes anti-apoptóticos a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 e ciap-2 estavam mais elevados na fase crônica do que nos controles. A expressão do gene c-flip estava diminuída e dos genes a1, ciap-1 e mcl-1 aumentada nas fases avançadas em relação aos controles e a fase crônica. Pacientes com LMC resistentes ao MI apresentaram menores níveis de miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a e dos genes anti-apoptóticos ciap-1 e mcl-1. Os dados obtidos sugerem que a TK Bcr-Abl modula a expressão de microRNAs que possuem como alvos genes que regulam a apoptose celular / Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease resulting from clonal expasion of hematopoietic precursor cells. Its physiopathology is associated to Philadelphia (Ph) chromosome (cr) originated from the t(9;22) and bcr-abl1 oncogene that encodes the Bcr-Abl protein with constitutive tyrosine kinase activity (TK). The Bcr-Abl1 expression determines leukemogenesis by altering the leukemic progenitor cells´ adhesion by bone marrow stroma and apoptosis resistance. TK inhibitors imatinib mesylate, dasatinib and nilotinib are used to treat CML, however, cases of resistance have been linked to mutation in Bcr-Abl1, duplication of the cr Ph and overexpression of the bcr-abl1. The resistance or refractoriness of some patients to treatment with TK inhibitors drives the studies to better understand the CML physiopathology and description of new therapeutic targets. In this context, this study investigated the participation of microRNAs in modulating expression of the genes that regulate apoptosis. The aim of this study was to investigate the effect of Bcr- Abl1 and its kinase activity in the expression of miRNAs in cell lines and CML patients. The RNA from cell lines, patients and controls were obtained by extraction with Trizol® and cDNA was synthesized with the kit High Capacity cDNA reverse transcription. The expression of miRNAs and target genes was quantified by real time PCR using SYBR Green PCR Master Mix® kit and TaqMan Universal PCR Master Mix®. The Bcr-Abl1 inhibition in the cell line HL-60.Bcr-Abl1 treated with imatinib mesylate increased the expression of miR-let- 7d, miR-15a, miR-130a and miR-145 and decreased miR-21 levels. Treatment with dasatinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-21, miR-30e, miR-130a and miR- 142-3p. Nilotinib increased the expression of miR-let-7e, miR-15a, miR-16, miR-130a and miR- 145 and, decreased miR-let-7d and miR-21 levels. The results of the analysis among patients with CML in different stages of disease showed high levels of miR-15a, miR-130b and miR-145 in chronic phase versus controls and low levels of miR-16, miR-26a and miR-146a. Patients in advanced phases versus controls showed low expression of miR-let-7d, miR-16, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a. Low levels of miR-let-7d, miR-15a, miR-16, miR-29c, miR-142-3p, miR-145 and miR-146a were observed in CML advanced phases when compared with chronic phase. The antiapoptotic genes a1, bcl-2, c-flip, ciap-1 and ciap-2 were higher in chronic phase than in controls. The c-flip expression was decreased and a1, ciap-1 and mcl-1 expression was increased in advanced phases when compared to controls and chronic phase. CML patients resistant to imatinib mesylate presented low levels of miR-26a, miR-29c, miR-130b, miR-146a and ciap-1 and mcl-1 antiapoptotic genes. The data obtained suggest that Bcr-Abl1 TK modulates the miRNA expression which has target genes involved in the apoptosis´ regulation.