The calcineurin-NFATc signaling pathway is involved in many aspects of the development and function of the immune, neural, skeletal, cardiovascular and muscular system of vertebrates. Regulators of Calcineurin (RCAN) proteins constitute a family of endogenous regulators of calcineurin, which play an important role in the modulation of the calcineurin-NFATc pathway. Here, we identifiy a novel protein kinase CK2 dependent mechanism by which the CIC motif of RCAN proteins modulate the final signaling output of the pathway. Moreover, we show that the functional CIC motif of RCANs responsible for Cn-NFATc regulation is sufficient to inhibit tumor progression producing a strong anti-angiogenic phenotype in an orthotopic human breast cancer mouse model. Therefore, a CIC-derived peptide has potent immunosuppressive and antitumoral activities by itself. Finally, the results here presented provide important insights for the rational design of potent and specific NFATc inhibitory drugs, which could be of use in autoimmune diseases and cancer. / La vía de señalización calcineurina-NFATc desempeña diversos roles en el desarrollo y function en el sistema, immune, nervioso, esqueletico, cardiovascular y muscular de veretebrados. Las proteínas RCAN (Regulators of Calcineurin), constitutyen una familia de reguladores endógenos de la calcineurina (Cn) que juegan un papel importante en la modulación de dicha vía. En el presente trabajo, hemos identificado un nuevo mecanismo de regulación, dependiente de la proteína quinasa CK2, por el cual el motivo CIC de las RCAN regula la vía Cn-NFATc. Además, demostramos que el motivo CIC de las RCAN responsable de la regulación de la vía Cn-NFATc, es suficiente para inhibir la progresión tumoral, produciendo un fuerte efecto angiogénico en un modelo ortotópico murino de tumor de mama. Por tanto, un péptido derivado del motivo CIC posee actividad inmunosupresora y antitumoral por sí mismo. Finalmente, este trabajo proporciona nuevos conocimientos que pueden ser de aplicación en el desarrollo racional de nuevos fármacos, especificos y potentes inhibidores de NFATc con posibles aplicaciones en la terapia immunosupresora y del cáncer.

Ribonucleases are promising candidates for use in anticancer therapy. There are different ways to endow an RNase with antitumor properties. Targeting the enzyme to the cell nucleus is a potential approach. PE5 is a variant of HP-RNase that it’s cytotoxic because it contains a nuclear localization signal. It has been shown that this sequence allows its interaction with α-importin. An alternative strategy to endow an RNase with cytotoxic activity is its dimerization. An HP-RNase variant, PM8, which forms a dimer through domain swapping, was produced in solution. This variant dimerized through a two-steps mechanism of domain swapping. To prove his model several variants of PM8 were produced in which the side chains of residues involved were removed. The variation of flexibility of the resulting hinge peptides and the effect of these changes on the ability of the variants to swap domains and to dimerize was determined / Les ribonucleases són potencials agents anticancerosos. Hi ha diferents camins per aconseguir que una RNasa adquireixi propietats antitumorals. La direccionalització al nucli de la cèl•lula és una opció potencial. PE5 és una variant de l’HP-RNasa que és citotòxica perquè conté una seqüència de localització nuclear. Es demostra que aquesta seqüència permet la interacció de PE5 amb la importina-α. Una estratègia alternativa per dotar una RNasa d’activitat citotòxica és l’adquisició d’estructura quaternària. Es va obtenir en solució una variant de l’HP-RNasa, PM8, la qual forma un dímer per intercanvi de dominis. Aquesta variant dimeritza a través d’un mecanisme en dues etapes. Per comprovar aquest model se’n van obtenir variants en les quals es van eliminar cadenes laterals de residus implicats. Es va determinar el canvi de flexibilitat dels pèptids xarnera resultants, així com l’efecte dels canvis en la capacitat de les variants per dimeritzar i intercanviar els dominis

Sequence alignment is one of the basic methods to compare biological sequences and the cornerstone of a wide range of different analyses. Due to this privileged position at the beginning of many studies its accuracy is of great importance, in fact, each result based on an alignment is depending on the alignment quality. This has been confirmed in several recent papers investigating the effect of alignment methods on phylogenetic reconstruction and the estimation of positive selection. In this thesis, I present several projects dedicated to the problem of developing more accurate multiple sequence alignments and how to evaluate them. I addressed the problem of structural protein alignment evaluation, the accurate structural alignment of RNA sequences and the alignment of large sequence data sets. / El alineamiento es uno de los métodos básicos en la comparación de secuencias biológicas, y a menudo el primer pasó en análisis posteriores. Por su posición privilegiada al principio de muchos estudios, la calidad del alineamiento es de gran importancia, de hecho cada resultado basado en un alineamiento depende en gran medida de la calidad de ´este. Este hecho se ha confirmado en diversos artículos recientes, en los cuales se ha investigado los efectos de la elección del método de alineamiento en la reconstrucción filogenética y la estimación de la selección positiva. En esta tesis, presento varios proyectos enfocados en la implementación de mejoras tanto en los métodos de alineamiento múltiple de secuencias como en la evaluación de estos. Concretamente, he tratado problemas como la evaluación de alineamientos estructurales de proteínas, la construcción de alineamientos estructurales y precisos de ARN y también el alineamiento de grandes conjuntos de secuencias.

La monoubiquitinación de la histona H2A cumple un rol esencial en la represión génica. Diversas enzimas desubiquitinantes (DUBs) han sido identificadas, que remueven específicamente la ubiquitina de H2A en distintos contextos celulares. Sin embargo poco se sabe sobre la regulación de esta actividad enzimática y de la interrelación con la maquinaria de ubiquitinación. En el presente trabajo hemos estudiado USP21, una DUB específica de H2A, que modula la iniciación de la transcripción. Hemos identificado BEND3 como interactor del USP21 nuclear. BEND3 se distingue por la presencia de cuatro dominios BEN, está localizado en la heterocromatina y actúa como represor de la transcripción. Hemos validado y delimitado la interacción entre USP21 y BEND3 y hemos observado que BEND3 está polyubiquitinado. La estabilidad proteica de BEND3 y su localización subcelular fueron independientes de la actividad catalítica de USP21 y los niveles de H2Aub no fueron influenciados por BEND3. Finalmente, el análisis de la expresión génica en células madre embrionarias de ratón revela la expresión diferencial de genes involucrados en crecimiento, proliferación celular y ciclo celular. / Monoubiquitination of histone H2A fulfills an essential role in gene repression. Several deubiquitinating enzymes (DUBs) have been identified that specifically remove ubiquitin in different cellular contexts. However, the regulation of their enzymatic activity as well as their interplay with the ubiquitination machinery are not well understood. We studied the H2A specific deubiquitinase USP21, which modulates transcriptional initiation. We identified BEND3 as interactor of nuclear USP21. BEND3 is characterized by a quadruple repeat of BEN domains, is localized to heterochromatin, and acts as a transcriptional repressor. We validated and mapped the interaction between USP21 and BEND3 and found that BEND3 is polyubiquitinated. BEND3 protein stability and subcellular localization were independent of the catalytic activity of USP21 protein, and H2Aub levels were not influenced by BEND3. Finally microarray gene expression analysis in mouse embryonic stem cells depleted for BEND3 revealed the differential expression of genes involved in cellular growth proliferation and cell cycle amongst others.

Proteins are the basic functional and structural blocks of life. Knowledge of their structure and function is key to understand how it works. Lately, the gap between new discovered proteins and systematically studied ones has increased due to the advance of sequencing techniques. As experimental methods are not able to keep up with the growing data, computational approximations to fill that gap are required. This thesis presents the study of protein loops (aperiodic regions in their three dimensional conformation) and their computational applications. It describes the latest developments regarding their classification (ArchDB), their use in protein structure modelling (Frag’r’Us) and in protein function prediction (Archer). It takes a special focus in protein redesign, which can be exploited to produce catalyst for non-biological processes or to design new synthetic biology pathways. / Les proteïnes son els blocs funcionals i estructurals de la vida. Conèixer la seva estructura i funció és vital per entendre-la. Últimament, la diferència entre noves proteïnes descrites i proteïnes estudiades sistemàticament ha augmentat explosivament degut a les noves tècniques de seqüenciació. Donat que el mètodes experimentals no poden fer-ho, és responsabilitat dels mètodes computacionals minimitzar aquesta diferència. Aquesta tesis presenta un estudi sobre els llaços de proteïnes (les regions aperiòdiques en la seva conformació tridimensional) i les seves aplicacions computacionals. Descriu els últims avanços referents a la seva classificació (ArchDB) i la seva utilitat en el modelatge de proteïnes (Frag’r’Us) i en la predicció de la seva funció (Archer). Fa un especial èmfasis en el seu redisseny, el qual pot ser explotat per catalitzar processos no-biològics o per el disseny sintètic de funcions biològiques.

In the present thesis we studied the effects of hydric stress in the ovary of the cockroach Blattella germanica. At morphological level, we described ovarian resorption induced by water deprivation. At a molecular level, we looked for markers differentially expressed under hydric stress. First, we focused on aquaporins given their role as water channel proteins. We cloned, sequenced and functionally characterised an aquaporin that transports water and urea. Then, we obtained a library of microRNAs (small non-coding RNAs that regulate gene expression post transcriptionally) present in the ovary under stress conditions. We analysed the differential expression of 13 of them and we observed that the majority were overexpressed under hydric stress. We selected miR-34-5p to perform a deeper study, including a study of their potential target mRNAs. Among the possible targets, we studied the function of Windei, a factor that resulted necessary for the trimethylation of lysine 9 in histone H3 and for chorion formation. Finally, we selected CARMER (an arginine methyltransferase) as hydric stress marker candidate. We assessed that it is overexpressed in response to hydric stress and that it is necessary for the dimethylation of arginine 17 in histone H3. / En esta tesis estudiamos los efectos del estrés hídrico en el ovario de la cucaracha Blattella germanica. A nivel morfológico describimos el proceso de reabsorción ovárica tras la privación de agua. A nivel molecular buscamos marcadores diferencialmente expresados en respuesta a este estrés. Primero nos centramos en las acuaporinas por su papel como proteínas que forman un canal transportador de agua. Clonamos, secuenciamos y caracterizamos funcionalmente una acuaporina que transporta agua y urea. Después obtuvimos una biblioteca de microRNAs (RNAs cortos no codificantes que regulan la expresión génica post-transcripcionalmente) presentes en el ovario en situación de estrés. Analizamos la expresión diferencial de 13 de ellos y observamos que la mayoría se sobreexpresaban en situación de estrés. Elegimos miR-34-5p para hacer un estudio más profundo, incluyendo un análisis de sus potenciales mRNA diana. De entre ellos, estudiamos la función de Windei y comprobamos que dicho factor es necesario para la trimetilación de la lisina 9 en la histona H3 y para la formación del corion. Por último, seleccionamos CARMER (una arginina methyltransferasa) como candidato a marcador de estrés hídrico. Comprobamos que CARMER se sobreexpresa en respuesta a estrés y que es necesario para la dimetilación de la arginina 17 en la histona H3.

The large-conductance Ca2+- and voltage-gated K+ (BK) channel containing the pore-forming and the regulatory B1 subunits play a pivotal role in the control of arterial tone and modification of channel function is associated to changes in blood pressure in both animal models and humans. Tungstate, a compound with antidiabetic and antiobesity properties, also reduces blood pressure in experimental animal models of both hypertension and metabolic syndrome, although the underlying mechanisms are not completely understood. This Thesis evaluates the effect of tungstate on BK channel function and its relevance for both the regulation of vascular resistance and intracellular signaling. Our results show that tungstate activates BK channels in a - and Mg2+-dependent manner and induces vasodilatation only in mouse arteries that express the BK B1 subunit. Our functional and comparative structural analysis suggest that, although the tungstate interaction site is located in the BK subunit, its positive effect on the channel requires residues of the B1 subunit extracellular loop that stabilize the active configuration of the voltage sensor. In addition, we have found that tungstate-induced, Gi/o protein-mediated ERK phosphorylation is enhanced by BK B1 channels. / El canal de potasio (K+) de alta conductancia dependiente de voltaje y Ca2+ (BK) y compuesto por la subunidad alfa(formadora del poro) y la subunidad reguladora B1, tiene un papel fundamental en el control del tono arterial. Cambios en la función del canal tienen una relación directa con modificaciones en la presión sanguínea tanto en modelos animales como en humanos. El tungstato, un compuesto con propiedades antidiabéticas y antiobesidad, también reduce la presión sanguínea en modelos animales de hipertensión y síndrome metabólico, aunque los mecanismos subyacentes no son del todo conocidos. Esta Tesis, evalúa el efecto del tungstato sobre la función del los canales BK y su relevancia en la regulación de la resistencia vascular y la señalización intracelular. Nuestros resultados demuestran que el tungstato activa los canales BK en una manera B- y Mg2+-dependiente, induciendo vasodilatación de arterias murinas que expresan la subunidad B1. Nuestros análisis funcionales junto a estudios estructurales comparativos sugieren que, aunque el sitio de interacción del tungstato está situado en la subunidad B, su efecto positivo sobre el canal requiere residuos pertenecientes al lazo extracelular de la subunidad B1 implicados en la estabilización del sensor de voltaje del canal BK en su configuración activa. Además, hemos observado que la fosforilación de ERK inducida por el tungstato y mediada por proteínas Gi/o está potenciada en presencia de canales BKBB1.

The view on how protein kinases regulate gene expression have recently expanded to include not only transcription factors but also histones, chromatin remodelers or components of the basal transcription machinery, which are directly modified on genomic loci. For the shuttling kinase DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase), most of its nuclear-associated functions can be explained by DYRK1A cytosolic activities, questioning a role for DYRK1A within the nuclear compartment. In the present study, through an unbiased proteomic approach the first “DYRK1A nuclear interactome” have been generated. DYRK1A interacts with several components of the basal transcriptional machinery as well as with the pre-mRNA processing machinery. Moreover, evidences uncovering a new role for DYRK1A as a transcriptional regulator of specific target genes have been generated. Genome-wide DYRK1A-chromatin analysis shows that the kinase is recruited to RNA polymerase II proximal promoters, via a highly conserved palindromic sequence, and also to RNA polymerase III-dependent promoters. Growth-dependent induction of the expression of a subset of target genes (protein coding and tRNAs) depends on DYRK1A protein levels and/or activity. In addition, downregulation of DYRK1A leads to a reduction in cell size. DYRK1A could therefore work by sitting on promoters of specific genes and act on different components of the basal transcription and/or mRNA processing machinery to modulate gene expression. / Resultados recientes han puesto de manifiesto que la regulación de la expresión génica por proteína quinasas va mas allá de su modulación de la actividad de factores de transcripción, ya que tanto histonas como remodeladores de cromatina o componentes de la maquinaria basal de transcripción puedes ser sustratos de fosforilaciones directamente en regiones genómicas reguladoras. La proteína quinasa DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase) está presente tanto en el núcleo como en el citoplasma de células de mamífero, si bien la mayoría de sus actividades nucleares pueden ser explicadas por fosforilaciones que ocurren en el citosol, lo que ha planteado dudas sobre si esta quinasa posee funciones específicamente nucleares. En este trabajo, se ha definido el primer "interactoma" nuclear de DYRK1A mediante una aproximación proteómica no sesgada, que ha permitido mostrar que DYRK1A interacciona con componentes de la maquinaria basal de transcripción así como con complejos implicados en el procesamiento del pre-mRNA. Los resultados también han puesto de manifiesto un nuevo papel de DYRK1A como regulador de la transcripción de un grupo específico de genes relacionados con la traducción de proteínas. Análisis a nivel genómico de la presencia de DYRK1A en cromatina muestra que la quinasa es reclutada a regiones proximales de promotores dependientes de la RNA polimerasa II, mediante una secuencia palindrómica altamente conservada, así como a genes dependientes de la RNA polimerasa III. La inducción de la expresión de un grupo de estos genes diana (tanto codificantes como tRNAs) en respuesta a factores de crecimiento depende de DYRK1A. Además, la reducción en los niveles de DYRK1A provoca una reducción en el tamaño de las células. Los resultados permiten proponer un modelo por el que DYRK1A podría regular directamente la expresión de genes diana mediante la fosforilación, en regiones reguladoras promotoras, de diferentes componentes de la maquinaria basal de la transcripción y/o de los complejos proteicos implicados en el procesamiento del mRNA.

Cytotoxic ribonucleases are promising agents to be used in the treatment of cancer. Our group previously described a cytotoxic human pancreatic ribonuclease variant, named PE5, which carries a nuclear localization signal. This protein is routed into the nucleus, where it cleaves nuclear RNA inducing the apoptosis of cancer cells. In the present work, the molecular mechanism of PE5-induced cytotoxicity has been investigated using global gene expression and miRNA microarrays. The results indicate that this ribonuclease causes pleiotropic effects and regulates the expression of numerous genes and miRNAs. On the other hand, we have improved the antitumor properties of PE5. First, we have obtained PE10, which is as cytotoxic as PE5 but it is potentially less immunogenic because its sequence is more similar to that of the wild type human pancreatic ribonuclease. And second, we have obtained NLSPE5, which exhibits 6-14 times higher cytotoxicity for tumor cells than PE5 / Les ribonucleases citotòxiques són proteïnes amb un gran potencial per ser utilitzades en el tractament del càncer. El nostre grup va descriure una variant citotòxica de la ribonucleasa pancreàtica humana, anomenada PE5, que incorpora un senyal de localització nuclear. Aquesta proteïna es dirigeix al nucli, on degrada RNA nuclear induint així l’apoptosi de les cèl•lules tumorals. En aquest treball s’ha investigat el mecanisme de citotoxicitat de PE5 utilitzant microarrays globals d’expressió gènica i de miRNAs. Els resultats obtinguts indiquen que PE5 causa efectes pleiotròpics i regula l’expressió de nombrosos gens i miRNAs. D’altra banda, s’han millorat les propietats antitumorals de PE5. Primer, s’ha produït PE10, la qual presenta la mateixa citotoxicitat que PE5 però és potencialment menys immunogènica perquè la seva seqüència és més similar a la de la ribonucleasa pancreàtica humana. En segon lloc, s’ha construït NLSPE5, la quals exhibeix una citotoxicitat 6-14 vegades superior a PE5

Microtubules are ubiquitous elements of any eucaryotic cell, serving many functions at different stages of its life. In plant cells they form so-called plant cell cortex, where they are organized into parallel arrays. These arrays serve as a matrix of synthesis of a plant cell wall, defining the direction of growth. Microtubule arrays are sensible to tropic stimuli. However, the nature of such sensibility is still not well established. We provide a computational analysis of this phenomenon. Using both kinetic Monte-Carlo simulations and theoretical investigation, we show that compression due to mechanical stress may cause orientation of microtubules along major stress lines. We also show that anisotropic distribution of chemical agents interacting with microtubule-associated proteins may also cause orientation of microtubules. Such mechanisms are primarily connected with gravitropism but similar reorientations of microtubules in response to light may suggest that these mechanisms can also be relevant for other tropisms. / Los microtúbulos son elementos ubicuos de cualquier célula eucariota, que poseen distintas funciones en diferentes etapas de su vida. En células de plantas ellos forman la estructura llamada corteza célula vegetal, donde se organizan en conjuntos paralelos. Estos conjuntos sirven como una matriz de síntesis de una pared celular vegetal, definiendo la dirección del crecimiento de la célula. Los conjuntos de microtúbulos son sensibles a estímulos trópicos. Sin embargo, la naturaleza de dicha sensibilidad todavía no está bien establecida. Les ofrecemos un análisis computacional de este fenómeno. Usando simulaciones cinéticas Monte-Carlo y la investigación teórica, nos mostramos que la compresión debida al estrés mecánico puede causar la orientación de los microtúbulos a lo largo de las principales líneas de tensión. También se muestra que la distribución anisotrópica de agentes químicos que interactúan con las proteínas asociadas a los microtúbulos también puede provocar orientación de los microtúbulos. Estos mecanismos están conectados principalmente con gravitropismo pero reorientaciones similares de microtúbulos en respuesta a la luz puede sugerir que estos mecanismos también pueden ser relevantes para otros tropismos.