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Colonisation et biodétérioration des bétons en milieu marin : mise au point d'essais en laboratoire et influence de la composition chimique du matériau cimentaire / Colonisation and biodeterioration of concrete in marine environment : development of laboratory protocols and influence of chemical composition of the cementitiousFerrero, Marie-Adeline 26 November 2018 (has links)
Dans le contexte actuel d’accroissement de la population mondiale, il est nécessaire de construire d’avantage d’infrastructures pour répondre à la pression industrielle grandissante. Ces constructions se font principalement sur la mer comme les ports, les îles artificielles ou encore les logements touristiques. Le béton est le matériau majoritairement utilisé en raison de son faible coût de production mais aussi de sa résistance à l’eau de mer. Comme tout matériau immergé en milieu marin, le béton est colonisé par les organismes vivants, devenant ainsi support de leur développement. Cependant, l’eau de mer est un milieu particulièrement agressif vis-à-vis des matériaux cimentaires ; des dégradations physiques, chimiques et biologiques sont observées dans le temps. Les deux premiers types de dégradation sont particulièrement bien documentés par la communauté scientifique. En revanche, les dégradations biologiques sont peu étudiées. L’objectif de cette thèse est donc de tout d’abord mettre en place un dispositif expérimental en laboratoire, permettant la colonisation d’un matériau cimentaire par des microorganismes. Des outils pertinents pour caractériser le biofilm sur le matériau ont été choisis après une étude bibliographique, dans le but de mieux comprendre la cinétique de colonisation. Des analyses chimiques du matériau ainsi que de l’eau de mer artificielle ont été effectuées à échéances régulières pour évaluer les actions du biofilm sur le matériau cimentaire. Différents matériaux ont été formulés pour étudier l’impact de la formulation sur la colonisation. / In the current context of increased world population, it is necessary to built more infrastructures to meet the increasing industrial pressure. These constructions are erected on the sea as harbors, artificial islands or tourist accommodation. Concrete is mainly used because of its low-cost and durability in the marine environment. Like any material immersed in seawater, concrete is colonized by living organisms, becoming an habitat for their development. However, seawater is a very aggressive environment towards cementitious materials; physical, chemical and biological degradations are observed with time. Nowadays, physical and chemical degradations are well understood and reported in the literature but there is a lack of knowledge concerning biological effects. The aim of this thesis is first develop an experimental device in laboratory, allowing the colonization of cementitious material by microorganisms. Relevant tools to characterize the biofilm on the material were chosen to better understand colonisation’s kinetic. Chemical analysis of material and seawater were made to evaluate the actions of the biofilm on cementitious material. Different materials were produced to study the impact of the formulation on the colonization.
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An in-vitro evaluation of the efficacy of oral devices to remove dental biofilm from three prosthodontic materialsAhmed, Omnia Abdelmoneim Khidir January 2019 (has links)
Magister Scientiae Dentium - MSc(Dent) / Introduction: The evolution of Dentistry witnessed an increase in fixed prostheses as
opposed to removable ones. Zirconia (ZrO2) and Lithium disilicate (LDS) are
becoming the material of choice in implant or tooth retained prostheses.
Polyetheretherketone (PEEK) is a recent alternative as it is lighter and causes less
wear of opposing retained teeth. Biofilm formation is a permanent daily struggle for
patients as it can be found in nearly all surfaces exposed to the natural environment.
Therefore, the interest in a new device capable of removing or reducing oral biofilm
from fixed prostheses is increasing. Aquaflosser (AQ) and Waterpik (WP) are
examples of these oral irrigating devices that were introduced to the dental market
recently. They can be effective in removing dental biofilm from different surfaces.
Purpose of study: The purpose of this study is to evaluate biofilm formation on three
fixed dental substructures and to evaluate the efficacy of two oral irrigating devices
on biofilm removal from these three substructures.
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Avaliação Clínica Periodontal e Perfil Microbiológico do Biofilme Subgengival em Mulheres Portadoras de Câncer de MamaBERNHARD, V. R. 18 December 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-12-18 / O entendimento da cavidade oral como uma fonte de infecção focal à
distância tem sido discutido há décadas. Neste contexto, muitos estudos consideram a doença periodontal como um fator de risco em potencial associada às doenças sistêmicas, tais como, parto prematuro e baixo peso ao nascimento, doença pulmonar, diabetes, aterosclerose e problemas cardiovasculares. Além disso, uma relação entre doença periodontal e câncer mostra que indivíduos jovens com lesões periodontais e com perda dos dentes molares possuem maior risco para morte prematura de doenças fatais, tais como, neoplasias malignas e doenças cardiovasculares. Por sua vez, outros estudos sugerem associação da periodontite com câncer de mama, próstata, pâncreas, pulmão, câncer do trato digestivo como um todo, câncer coloretal, bexiga, próstata e colo uterino. OBJETIVO: Avaliar a condição clínica periodontal e microbiológica do biofilme subgengival em mulheres com câncer de mama assistidas no Hospital Universitário Cassiano Antônio de Morais (HUCAM) no Espírito Santo. METODOLOGIA: Estudo transversal com
participação de 44 mulheres voluntárias com câncer de mama portadoras de doença periodontal. Parâmetros clínicos periodontais e 144 amostras de biofilme subgengival foram submetidas à extração do DNA por meio da técnica de hibridização Checkerboard DNA-DNA. A análise estatística caracterizou-se por meio da frequência observada, porcentagem, média, mediana e desvio padrão, além de estatísticas de testes adotando-se o nível de significância de 5%. RESULTADOS:
Bolsas periodontais de 4,0mm a 5,0mm apresentaram frequência de 59%; o nível clínico de inserção para bolsas ≥6,0mm alcançou 71,8%; o sangramento à sondagem atingiu média de 27,6%; e a média de índice de placa visível foi de 45,7%. A bactéria Tannerella forsythia (62,7%) mostrou significância para bolsas moderada (p<0,01) e nível clínico de inserção (p=0,440), enquanto a bactéria Parvimonas micra (62,8%) apresentou significância para bolsas profundas (p<0,01) e nível clínico de inserção (p<0,001). As bactérias do complexo amarelo, Streptococcus oralis, S. intermedius e S. gordonii apresentaram significância para bolsas profundas e nível clínico de inserção ≥6,0mm. CONCLUSÃO: Alguns estudos mostram a relação entre a carga bacteriana e o desenvolvimento e progressão do câncer, sendo justificável o controle do biofilme oral a fim de reduzir a 8 carga microbiana da boca para combater o desenvolvimento carcinogênico. Apesar do papel das bactérias periodontopatogênicas na etiopatogênese da lesão de câncer de mama ainda não estar esclarecida na literatura, mais estudos clínicos randomizados controlados são necessários para determinar se existe qualquer elemento causal na associação da doença periodontal e câncer de mama.
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The influence of microbial processes on fluid flow and nanoparticle transport in porous mediaKurlanda, Hanna January 2013 (has links)
Biofilm growth is a significant factor in subsurface processes governing fluid flow and contaminant transport. Biobarriers are known to reduce hydraulic conductivity, as well as to immobilise metals in the matrix of the exopolymeric substances (EPS) produced by bacterial cells. It is therefore necessary to develop understanding of how bioclogging and related mechanisms occur in porous media, and how contaminants interact with biofilms at the laboratory scale, which ultimately can be scaled up to field scenarios. The aims of the laboratory experiments were to a) enable uniform biofilm growth in columns packed with different types of porous media, b) develop methods of quantifying and visualising biofilm distribution in porous media, and c) measure transport of zinc oxide (ZnO) nanoparticles in columns with and without biofilm growing on the porous media. Experiments were conducted with columns and batch tests. Biofilms were grown by inoculating columns with Pseudomonas putida. Biofilm distribution was quantified by biomass extraction and visualised using X-ray computed microtomography (μCT) imaging. Colorimetric methods were used predominantly to quantify protein and polysaccharide content in biofilms. However, these methods possess several major disadvantages, which were highlighted using experimental data from batch tests. X-ray computer microtomography is a non-destructive method of visualising biofilm growth and illustrating flow paths in porous media. Particular components of μCT images (porous media, biofilm, tracer) were subtracted from images based on density contrasts. Reconstructed images of small, bio-clogged columns show that clogging occurs not only as a result of abundant biofilm growth but also air bubbles. Nanoparticle transport in porous media involved the injection of bare and capped ZnO nanoparticle suspensions into columns packed with glass beads, sand and calcite with and without inoculation of bacteria. Results, as well as modelled predictions, showed that ZnO nanoparticles generally possess low mobility, and that biofilm impedes nanoparticle transport. Porous media surface charge, as well as the extent of biofilm growth, play an important role in nanoparticle transport.
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A unique relationship between switching, mating and biofilm formation in the human pathogen Candida albicansYi, Song 01 July 2009 (has links)
Candida albicans is the most prevalent human fungal pathogen. The research described in this thesis has focused on the identification and characterization of the regulatory pathways in this pathogen controlling white-opaque switching, mating and biofilm formation as well as the relationship between them. White-opaque switching and mating in C. albicans are under the repression of the a1-α2 complex. Based on this, a chromatin immunoprecipitation-microarray analysis of the a1-α2 target genes was conducted to search for the master switch locus. The result identified TOS9 (WOR1) as a master regulator gene, and overexpression of TOS9 resulted in a switch en masse from white to opaque. In 2006, a novel form of communication was demonstrated between white and opaque cells in C. albicans. It was shown that minority opaque cells through the release of pheromone signaled majority white cells of the opposite mating type to become cohesive, adhesive and form enhanced biofilms. These biofilms in turn facilitated opaque cell chemotropism required for opaque cell mating. To identify the pathway regulating the white cell pheromone response, deletion mutants were generated for select genes mediating the opaque cell mating response. It was demonstrated that the pathways regulating the white and opaque cell responses to the same pheromone share the same upstream components, including receptors, heterotrimeric G protein, and mitogen-activated protein kinase cascade, but they use different downstream transcription factors that regulate the expression of genes specific to the alternative responses. This configuration, although found in higher, multicellular systems, is uncommon in fungi and suggests that it may be an antecedent to multicellularity in higher eukaryotes. In addition, it was found that a C. albicans-specific 55-amino-acid region of the first intracellular loop, IC1, of the α-pheromone receptor, is required for the α-pheromone response of white cells, but not that of opaque cells. Finally, to test the generality of the white cell pheromone response, evidence was presented that the response occurs in all tested media and in all of the 27 tested strains, including a/a and α/α strains, derivatives of the common laboratory strain SC5314, and representatives from all of the five major clades. The white cell response to pheromone, therefore, proved to be a general characteristic of MTL-homozygous strains of C. albicans.
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Characterization of Staphylococcus aureus extracellular nuclease activityKiedrowski, Megan R. 01 December 2012 (has links)
Staphylococcus aureus encodes two extracellular nuclease enzymes, Nuc and Nuc2. Nuc is a secreted enzyme that is cut by signal peptidase (SpsB) at the cell membrane and is further processed into two active forms, NucA and NucB, by an unknown protease. Nuc2 is predicted to be a second extracellular nuclease based on sequence homology to the staphylococcal nuclease (SNase) and is tethered to the membrane with a N-terminal anchor. At the beginning of these studies, little was understood about the biological and physiological roles of Nuc and Nuc2 in S. aureus. The goal of this dissertation was to characterize the extracellular nuclease activity of S. aureus in order to better understand the contributions of Nuc and Nuc2 to the S. aureus life cycle.
The studies presented in Chapter II focus on the role of Nuc in regulating S. aureus biofilm growth. The secreted forms of Nuc, called NucA and NucB, were first identified as anti-biofilm agents present in spent media from a S. aureus alternative sigma factor B (sigB) mutant. Regulation studies identified the major repressors and activators of nuc expression and showed that nuc is repressed under biofilm-forming conditions. By bypassing the native regulatory mechanisms using a nuc inducible plasmid, biofilm growth could be inhibited in a dose-dependent manner. Biofilm testing of nuc mutant strains across genetic backgrounds led to the observation that biofilm thickness increased two-fold in the absence of Nuc. More high molecular weight extracellular DNA (eDNA) accumulated in the nuc mutant compared to wild-type cells, indicating a direct link between Nuc and the availability of eDNA to contribute to the biofilm matrix. These studies showed that nuc expression is tightly regulated in S. aureus biofilms, and Nuc activity can greatly impact biofilm formation and maturation.
In Chapter III, studies were performed to determine whether Nuc2 is an active nuclease in S. aureus and where the protein is localized in the cell. Upon initial comparison to Nuc, Nuc2 has 42% amino acid identity in the proposed SNase domain, and 7 of 9 residues known to be required for Nuc activity are conserved in Nuc2. Fluorescence microscopy of a Nuc2-sGFP translational fusion demonstrated the protein is localized to the cell membrane, and alkaline phosphatase fusion studies showed that the C-terminus of Nuc2 faces out of the cell. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) assays facilitated the detection of low levels of Nuc2 activity on the S. aureus cell surface, demonstrating for the first time the enzyme is a functional nuclease, and mutations in the nuc2 gene eliminated this activity. Purification of recombinant Nuc2 also showed that enzyme has DNase activity that is calcium-dependent. Through the construction of Nuc/Nuc2 chimeric proteins, it was determined that localization to the cell membrane does not impair nuclease activity, and the low levels measured for Nuc2 on S. aureus cells is likely due instead to weak expression. The knowledge that Nuc2 is an active nuclease, localized to the cell surface, provides insight into the potential roles Nuc2 may play in a biofilm environment and during S. aureus infection.
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Analysing Quorum Sensing and Biofilm formation in Staphylococcus aureus / Untersuchungen des Quorum-Sensing und der Biofilm-Bildung in Staphylokokkus aureusAudretsch, Christof January 2013 (has links) (PDF)
Staphylococcus aureus (SA) causes nosocomial infections including life threatening sepsis by multi-resistant strains (MRSA). It has the ability to form biofilms to protect it from the host immune system and from anti staphylococcal drugs. Biofilm and planctonic life style is regulated by a complex Quorum-Sensing (QS) system with agr as a central regulator. To study biofilm formation and QS mechanisms in SA a Boolean network was build (94 nodes, 184 edges) including two different component systems such as agr, sae and arl. Important proteins such as Sar, Rot and SigB were included as further nodes in the model. System analysis showed there are only two stable states biofilm forming versus planctonic with clearly different subnetworks turned on. Validation according to gene expression data confirmed this. Network consistency was tested first according to previous knowledge and literature. Furthermore, the predicted node activity of different in silico knock-out strains agreed well with corresponding micro array experiments and data sets. Additional validation included the expression of further nodes (Northern blots) and biofilm production compared in different knock-out strains in biofilm adherence assays. The model faithfully reproduces the behaviour of QS signalling mutants. The integrated model allows also prediction of various other network mutations and is supported by experimental data from different strains. Furthermore, the well connected hub proteins elucidate how integration of different inputs is achieved by the QS network. For in silico as well as in vitro experiments it was found that the sae-locus is also a central modulator of biofilm production. Sae knock-out strains showed stronger biofilms. Wild type phenotype was rescued by sae complementation. To elucidate the way in which sae takes influence on biofilm formation the network was used and Venn-diagrams were made, revealing nodes regulated by sae and changed in biofilms. In these Venn-diagrams nucleases and extracellular proteins were found to be promising nodes. The network revealed DNAse to be of great importance. Therefore qualitatively the DNAse amount, produced by different SA mutants was measured, it was tried to dissolve biofilms with according amounts of DNAse and the concentration of nucleic acids, proteins and polysaccharides were measured in biofilms of different SA mutants.
With its thorough validation the network model provides a powerful tool to study QS and biofilm formation in SA, including successful predictions for different knock-out mutant behaviour, QS signalling and biofilm formation. This includes implications for the behaviour of MRSA strains and mutants. Key regulatory mutation combinations (agr–, sae–, sae–/agr–, sigB+, sigB+/sae–) were directly tested in the model but also in experiments. High connectivity was a good guide to identify master regulators, whose detailed behaviour was studied both in vitro and in the model. Together, both lines of evidence support in particular a refined regulatory role for sae and agr with involvement in biofilm repression and/or SA dissemination. With examination of the composition of different mutant biofilms as well as with the examination of the reaction cascade that connects sae to the biofilm forming ability of SA and also by postulating that nucleases might play an important role in that, first steps were taken in proving and explaining regulatory links leading from sae to biofilms. Furthermore differences in biofilms of different mutant SA strains were found leading us in perspective towards a new understanding of biofilms including knowledge how to better regulate, fight and use its different properties. / Staphylococcus aureus (SA) ist Auslöser nosocomialer Infektionen, darunter auch die, durch multiresistente Stämme (MRSA) verursachte, lebensbedrohliche Sepsis. Er hat die Fähigkeit Biofilme zu bilden, um sich vor dem Immunsystem des Wirtes und vor Antibiotika zu schützen. Biofilm und planktonische Lebensweise werden durch ein komplexes Quorum-Sensing (QS) System mit agr als zentralem Regulator gesteuert. Um die Biofilm Bildung und QS Mechanismen in SA zu untersuchen, wurde ein Boole´sches Netzwerk erstellt (94 Knoten, 184 Kanten) das verschiedene Zwei-Komponenten-Systeme wie agr, sae und arl mit einschließt. Wichtige Proteine wie Sar, Rot und SigB wurden als weitere Knoten im Modell eingefügt. Die Systemanalyse zeigte, dass es nur zwei stabile Zustände gibt, Biofilm bildend versus planktonisch, in denen deutlich unterschiedliche Subnetzwerke angeschaltet sind. Überprüfungen anhand von Gen-Expressions-Daten bestätigten dies. Die Netzwerkstabilität wurde zuerst an Hand von bestehendem Wissen und Literatur getestet. Zudem stimmte die vorhergesagte Aktivität der Knoten in verschiedenen in silico Knock-out Stämmen sehr gut mit den zugehörigen Micro-array Experimenten und Daten überein. Zusätzliche Validierungen schlossen die Expression weiterer Knoten (Northern Blots) und die Biofilm Produktion, verglichen durch Biofilm adherence assays, in verschiedenen Knock-out Stämmen mit ein. Das Modell spiegelt zuverlässig das Verhalten von QS-Signal Mutanten wieder. Das integrierte Modell erlaubt auch Vorhersagen von diversen anderen Netzwerk Mutationen und wird durch experimentelle Daten unterschiedlicher Stämme gestützt. Außerdem zeigen die gut vernetzten Hubproteine im Detail auf, wie die Verarbeitung unterschiedlicher Eingangssignale durch das QS-Netzwerk erreicht wird. Sowohl für in silico als auch für in vitro Experimente konnte gezeigt werden, dass der sae-Locus auch einen zentralen Modulator der Biofilm Produktion darstellt, sae Knock-out Stämme zeigten stärkere Biofilme. Der Wildtyp Phänotyp wurde durch sae Komplementierung wiederhergestellt. Um die Art und Weise, mit der sae Einfluss auf die Biofilm Bildung nimmt, aufzuklären wurde das Netzwerk genutzt und Venn-Diagramme angefertigt, welche Knoten aufzeigten, die durch sae reguliert- und in Biofilmen verändert sind. In den Venn-Diagrammen wurden Nucleasen und extrazelluläre Proteine als vielversprechende Knoten gefunden. Das Netzwerk zeigte, dass DNAse von großer Bedeutung ist. Deswegen wurde qualitativ die, durch unterschiedliche SA Mutanten produzierte, DNAse-Menge gemessen, es wurde versucht den Biofilm mit vergleichbaren DNAse-Mengen aufzulösen und die Konzentration von Nukleinsäuren, Proteinen und Polysacchariden wurde in Biofilmen unterschiedlicher SA Mutanten gemessen.
Aufgrund seiner sorgfältigen Überprüfung stellt das Netzwerk-Modell ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung von QS und Biofilm Bildung in SA dar, erfolgreiche Vorhersagen über das Verhalten unterschiedlicher Knock-out Mutanten, QS Signale und Biofilm Bildung eingeschlossen. Dies beinhaltet Prognosen für das Verhalten von MRSA Stämmen und Mutanten. Zentrale regulatorische Mutationskombinationen (agr–, sae–, sae–/agr–, sigB+, sigB+/sae–) wurden direkt im Model aber auch in Experimenten getestet. Hohe Konektivität war ein guter Anhaltspunkt, um Hauptregulatoren zu identifizieren, deren Verhalten in vitro und im Modell untersucht wurde. Zusammen unterstützen beide Beweisführungen im Besonderen eine präzise regulatorische Rolle von sae und agr in Bezug auf Biofilm Unterdrückung und/oder SA Ausbreitung. Mit der Untersuchung der Zusammensetzung von Biofilmen unterschiedlicher Mutanten, ebenso wie mit der Untersuchung der Reaktionskaskade die sae mit der Biofilm Bildungsfähigkeit von SA verbindet und auch dem Überprüfen der Annahme, dass Nukleasen eine bedeutende Rolle hierin spielen könnten, wurden erste Schritte unternommen, um regulatoische Interaktionen zwischen sae und Biofilmen zu belegen und zu untersuchen. Des Weiteren wurden Unterschiede in Biofilmen verschiedener mutierter SA Stämme gefunden, die uns voraussichtlich zu einem neuem Verständnis von Biofilmen und damit zu Wissen führen, wie ihre Eigenschaften reguliert, bekämpft und genutzt werden können.
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Divergence of cell-fates in multicellular aggregates of \(Staphylococcus\) \(aureus\) defines acute and chronic infection cell types / Divergenz von Zelldifferenzierung in multizellulären Aggregaten von \(Staphylococcus\) \(aureus\) grenzt Zelllinien für akute und chronische Infektionen voneinander abGarcia Betancur, Juan Carlos January 2018 (has links) (PDF)
Staphylococcus aureus is a versatile human pathogen that normally develops acute or chronic infections. The broad range of diseases caused by this bacterium facilitates the escape from the host's immune response as well as from target-specific antimicrobial therapies. Nevertheless, the underlying cellular and molecular mechanisms that enable S. aureus to cause these disparate types of infections are largely unknown. In this work, we depicted a novel genetic program involved in the development of cell-fate decision, which promotes the differentiation of the staphylococcal cells into two genetically identical but differently heritable cell lines capable of defining the course of an infection, by simultaneously progressing to (i) a biofilm-associated chronic infection or (ii) a disperse acute bacteremia. Here, S. aureus growing in architecturally complex multicellular communities harbored different cell types that followed an exclusive developmental plan, resulting in a clonal heterogeneous population. We found that these cell types are physiologically specialized and that, this specialization impacts the collective behavior within the multicellular aggregates. Whereas one cell line that we named BRcells, promotes biofilm formation that engenders chronic infections, the second cell line, which we termed DRcells is planktonic and synthetizes virulence factors, such as toxins that can drive acute bacteremia. We identified that the positive feedback loop present in Agr quorum sensing system of S. aureus acts a bimodal switch able to antagonistically control the divergence of these two physiologically distinct, heritable cell lines. Also, we found that this bimodal switch was triggered in response to environmental signals particularly extracellular Mg2+, affecting the size of the subpopulations in specific colonization environments. Specifically, Mg2+-enriched environments enhanced the binding of this cation to the staphylococcal teichoic acids, increasing the rigidity of the cell wall and triggering a genetic program involving the alternative sigma factor σB that downregulated the Agr bimodal switch, favoring the enrichment of the BRcells type. Therefore, colonization environments with different Mg2+ content favored different outcomes in the bimodal system, defining distinct ratio in the BRcells/DRcells subpopulations and the S. aureus outcome in our in vitro model of development of multicellular aggregates and, the infection outcome in an in vivo mice infection model. In this prime human pathogen cell-fate decision-making generates a conserved pattern of heritable, physiological heterogeneity that actively contributes to determine the course of an infection through the emergence and spatio-temporal dynamics of distinct and specialized cell types. In conclusion, this work demonstrates that cell differentiation in pathogenic bacteria is a fundamental phenomenon and its understanding, is central to understand nosocomial infections and to designing new anti-infective strategies / Staphylococcus aureus ist ein wandlungsfähiges humanes Pathogen, das im Allgemeinen akute oder chronische Infektionen entwickelt. Das breite Spektrum von Krankheiten, die von diesem Bakterium verursacht werden, erleichtert es, sowohl der Immunantwort des Wirts als auch gezielten antimikrobiellen Therapien zu entgehen. Dennoch sind die zellulären und molekularen Mechanismen, die S. aureus die Entwicklung dieser verschiedenartigen Infektionsarten ermöglichen, weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit beschreiben wir ein neues genetisches Programm, das bei der Entwicklung der Zelldifferenzierung beteiligt ist und die Differenzierung der Staphylokokken-Zellen in zwei genetisch identische, aber unterschiedliche, erbliche Zelllinien fördert. Diese können den Verlauf einer Infektion bestimmen, indem sie sich gleichzeitig entwickeln zu (i) einer Biofilm-assoziierten chronischen Infektion oder (ii) einer sich ausbreitenden akuten Bakteriämie. Hier verbirgt S. aureus, der in architektonisch komplexen multizellulären Bakteriengemeinschaften wächst, verschiedene Zelltypen, die einem einzigartigen Entwicklungsplan folgen, resultierend in einer klonal heterogenen Population. Wir haben festgestellt, dass diese Zellzypen physiologisch spezialisiert sind, und dass diese Spezialisierung das kollektive Verhalten innerhalb der multizellulären Aggregate beeinflusst. Während eine Zelllinie, die wir als BRcells benennen, Biofilm-Bildung fördert, was chronische Infektionen erzeugt, ist die zweite Zelllinie, als DRcells bezeichnet, planktonisch und synthetisiert Virulenzfaktoren wie Toxine, die eine akute Bakteriämie verursachen können. Wir haben identifiziert, dass die im Agr Quorum sensing System von S. aureus vorhandene positive Rückkopplung als bimodaler Schalter agiert, der antagonistisch die Divergenz dieser beiden physiologisch unterschiedlichen, vererbbaren Zelllinien kontrolliert. Wir haben auch gefunden, dass dieser bimodale Schalter durch Signale aus der Umgebung ausgelöst wird, insbesondere durch extrazelluläres Mg2+, wodurch die Größe der Subpopulationen in spezifischen Kolonisierungsumgebungen beeinflusst wird. Besonders Mg2+-angereicherte Umgebungen fördern die Bindung dieses Kations mit den Teichonsäuren von Staphylokokken, welche die Steifigkeit der Zellwand erhöhen und ein genetisches Programm initialisieren, welches den alternativen Sigmafaktor σB beinhaltet. Dieser regelt den bimodalen Agr Schalter herunter und begünstigt die Anreicherung des Brcells Zelltyps. Daher begünstigen verschiedene Kolonisierungsumgebungen mit verschiedenem Mg2+ Gehalt unterschiedliche Ergebnisse im bimodalen System, welche sich in individuellen Verhältnissen der Brcells/Drcells Subpopulationen und dem Ergebnis für S. aureus – sowohl in unserem in vitro Modell der Entwicklung multizellulärer Aggregate als auch der Entzündungsentwicklung in einem in vivo Maus-Infektionsmodell. In diesem primären Humanpathogen generiert die Zelldifferenzierung ein bleibendes Muster von vererbbarer, physiologischer Heterogenität, die aktiv dazu beiträgt, den Infektionsverlauf durch das Auftreten und die räumlich-zeitliche Dynamik verschiedener spezialisierter Zelltypen zu bestimmen. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Zelldifferenzierung in pathogenen Bakterien ein grundlegendes Phänomen ist. Diese zu erfassen ist zentral für das Verständnis nosokomialer Infektionen und die Konzeption neuer Strategien gegen Infektionen.
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Morphology, regulation and interstrain interactions in a new macrocolony biofilm model of the human pathogen \(Staphylococcus\) \(aureus\) / Morphologie, Regulation und stammübergreifende Wechselwirkungen in einem neuen Makrokolonie-Biofilmmodell des Humanpathogens \(Staphylococcus\) \(aureus\)Wermser, Charlotte January 2019 (has links) (PDF)
The role of multicellularity as the predominant microbial lifestyle has been affirmed by studies on the genetic regulation of biofilms and the conditions driving their formation. Biofilms are of prime importance for the pathology of chronic infections of the opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus.
The recent development of a macrocolony biofilm model in S. aureus opened new opportunities to study evolution and physiological specialization in biofilm communities in this organism. In the macrocolony biofilm model, bacteria form complex aggregates with a sophisticated spatial organization on the micro- and macroscale. The central positive and negative regulators of this organization in S. aureus are the alternative sigma factor σB and the quorum sensing system Agr, respectively. Nevertheless, nothing is known on additional factors controlling the macrocolony morphogenesis.
In this work, the genome of S. aureus was screened for novel factors that are required for the development of the macrocolony architecture. A central role for basic metabolic pathways was demonstrated in this context as the macrocolony architecture was strongly altered by the disruption of nucleotide and carbohydrate synthesis. Environmental signals further modulate macrocolony morphogenesis as illustrated by the role of an oxygen-sensitive gene regulator, which is required for the formation of complex surface structures. A further application of the macrocolony biofilm model was demonstrated in the study of interstrain interactions. The integrity of macrocolony communities was macroscopically visibly disturbed by competitive interactions between clinical isolates of S. aureus.
The results of this work contribute to the characterization of the macrocolony biofilm model and improve our understanding of developmental processes relevant in staphylococcal infections. The identification of anti-biofilm effects exercised through competitive interactions could lead to the design of novel antimicrobial strategies targeting multicellular bacterial communities. / Die Rolle von Multizellularität als der vorherrschende mikrobielle Lebensstil wurde durch Studien über die genetische Steuerung von Biofilmen und über Biofilmbildung-fördernde Bedingungen bestätigt. Biofilme sind wichtige Faktoren in der Pathogenese chronischer Infektionen durch das opportunistische Humanpathogen Staphylococcus aureus.
Die kürzlich erfolgte Entwicklung eines Makrokolonie-Biofilmmodells für S. aureus eröffnet neue Möglichkeiten evolutionäre Entwicklungen und die physiologische Spezialisierung in bakteriellen Gemeinschaften zu untersuchen. Im Makrokolonie-Biofilmmodell bilden Bakterien komplexe Aggregate, die sich durch eine hochentwickelte räumliche Organisation auf mikroskopischer und makroskopischer Ebene auszeichnen. Die positiven und negativen Hauptregulatoren dieser Organisation sind der alternative Sigmafaktor σB sowie das Quorum sensing System Agr. Dennoch sind weitere Faktoren, die die Morphogenese der Makrokolonien steuern, unbekannt.
In dieser Arbeit wurde das Genom von S. aureus im Hinblick auf neue Faktoren, die für die Entwicklung der Makrokoloniearchitektur nötig sind, analysiert. Dabei wurde belegt, dass zentrale Stoffwechselwege eine zentrale Rolle spielen. Störungen der Nukleotid- und Kohlenhydrat-Synthese hatten starke Auswirkungen auf die Makrokoloniearchitektur. Weiterhin wurde anhand eines Sauerstoff-sensitiven Genregulators, der für die Ausbildung von Oberflächenstrukturen nötig ist, demonstriert, wie die Morphogenese der Makrokolonien durch Umweltsignale moduliert wird. Das Makrokolonie-Biofilmmodell fand weitere Anwendung in der Untersuchung von stammübergreifenden Interaktionen. Die Integrität der Makrokolonie-Biofilme wurde durch die Wechselwirkungen in Konkurrenz stehender klinischer Isolate stark herabgesetzt.
Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen zur Charakterisierung des Makrokolonie-Biofilmmodells bei und geben Einsicht in Entwicklungsprozesse, die während Staphylokokken-Infektionen ablaufen. Die Beschreibung der negativen Beeinflussung der Biofilme durch bakterielle Wechselwirkungen könnte zur Entwicklung neuer antimikrobieller Strategien, die gezielt gegen multizelluläre bakterielle Gemeinschaften wirksam sind, beitragen.
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Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermdis / The role of the bacterial insertion sequence IS256 in the modulation of biofilmproduction in Staphylococcus epidermidisLößner, Isabel January 2002 (has links) (PDF)
Staphylococcus epidermidis zählt zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdkörpern. Diese Bakterien zeigen eine außergewöhnliche phänotypische und genotypische Variabilität, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. Möglicherweise verfügen Staphylokokken damit über Anpassungsstrategien, die sie für das Überleben unter wechselnden Umweltbedingungen benötigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizität von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die Fähigkeit von S. epidermidis, an Oberflächen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Präsenz und Expression des ica-Operons abhängig, das Enzyme für die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist äußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die veränderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zurückzuführen ist, an denen das IS-Element IS256 ursächlich beteiligt ist. Zunächst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die nähere Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abkömmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache für den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot für die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis Stämmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache für die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der Fähigkeit, Biofilme auszubilden, führte. Um die Frage zu klären, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis –Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verfügung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-Stämmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster für Proteine mit Ähnlichkeiten zu oberflächenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adhärenz der Bakterien beteiligt sein könnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit Ähnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis möglicherweise Teil einer Pathogenitätsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizität von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufklärung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkulärer, extrachromosomaler DNA-Moleküle gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollständigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Brücke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der früheren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollständigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Moleküle gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen können und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion während der Zirkularisierung mit geringer Spezifität verläuft. Ringförmige IS256-Moleküle konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-Stämmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen läßt. Dagegen konnte durch die Einführung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt für die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkulärer IS256-Moleküle die Voraussetzung für die präzise Exzision des Elementes während der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zurücklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen während der Zirkelbildung vorstellbar. Darüber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte für homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor für die Flexibilität des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, könnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben. / Staphylococcus epidermidis is the predominant cause of implanted medical device related infections and of nosokomial sepsis. These bacteria show an unusual phenotypic and genotypic variability that comprises the expression of virulence- and resistance-associated genes. This adaptability is thought to be involved in the survival of staphylococci under changing environmental conditions. In this study the role of bacterial insertion sequences (IS) in the genome plasticity of S. epidermidis was investigated. Of particular interest was the insertion sequence element IS256 and its influence on S. epidermidis-biofilm formation. The capability of S. epidermidis to attach to surfaces and to form biofilms is due to the presence and expression of the ica Operon. This gene locus was shown to mediate cell-cell adhesion and production of the polysaccharid intercellular adhesin (PIA). The PIA-production is variable and has an influence on the virulence and staphylococcal colonization. In the first part of this work it was shown that variable PIA-production depends on three different mechanisms which involve the insertion sequence IS256. By comparison of different IS256-specific hybridization patterns of a biofilm forming wildtype S. epidermidis and its PIA-negative spontaneous variants, it could be shown that IS256 which is present in multiple copies in the genome of this strain is highly active. A more detailed analysis of this variants has shown that IS256 mediates genome rearrangements and causes the loss of biofilm formation in a number of PIA-negative variants. Another group of biofilm-negative variants carries an IS256 inserted in the ica-Operon. The distribution of the icaC::IS256 insertion sites led us assume that icaC is a hot spot for the integration of IS256. ica::IS256 insertions have been detected in numerous S. epidermidis strains. Because this insertions are reversible they are a substantial cause for phase variation of biofilm formation in S. epidermidis. A third group of variants shows the deletion of chromosomal DNA fragments of variable length which are accompanied with the loss of the ica genes and the ability to form biofilms. To answer the question which are the ica-neighbouring genes that get lost with the deletion of DNA-Fragments up to 250 kbp, we constructed an S. epidermidis wild type cosmid library. Nucleotide sequence information has been compared with the sequence of the reference strain S. epidermidis RP62A that is available in the genome database and was summarized in a gene map. Apart from some differences between this two S. epidermidis strains, it was remarkable that various open reading frames get lost, which show similarities to surface-associated proteins and which might be involved in adherence of bacteria. In addition, there are open reading frames showing similarities to transport proteins and numerous mobile DNA elements. These results indicate that the ica operon could be possibly a part of a pathogenicity island. Analysis of the deletion borders of a mutant has shown that homologous 1. B SUMMARY 4 recombination between two IS256 elements, oriented in the same direction, were responsible for the loss of more than 200 kbp DNA. Because IS256 plays an essential role in the genome plasticity in S. epidermidis it was of special interest to elucidate the transposition mechanism of IS256 which was the second part of this work. The data obtained in this analyses have shown that IS256 transposes via an alternative transposition mechanism that is characterized by the formation of extrachromosomal circular DNA molecules. These DNA circles consist of complete IS256 copies in which the left and the right end of the IS element are connected via foreign DNA (circle junctions). It could be shown that these circle junctions were derived from upstream and downstream flanking DNA-sequences of the parental genetic locus. In addition to complete circles, incomplete circles were detected in which either the left or the right end of IS256 was truncated. These results suggest that either end of IS256 can attack the opposite terminus and, in contrast to other circle-forming IS elements, the strand-transfer reaction occurs with low specifity. Circular IS256 molecules could be shown both in recombinant S. aureus and E. coli strains, which indicates that in the circularization process host factors play a minor role. Mutagenesis of the gene for the putative transposase revealed that this gene product is essential for formation of IS256 circles. There are grounds for the assumption that the formation of IS256-circles is the prerequisite for precise excision of the element during biofilm phase variation. Besides the generation of stable mutations through imprecise excision of the element is conceivable. In addition multiple copies of the element in the genome represent sites for homologous recombination. The combined data suggest that IS256 represents a driving force in the flexibility of the S. epidermidis genome. A detailed analysis of the molecular mechanisms which influence the transposition of IS256 could give an insight into the genetic adaptation of this important nosocomial pathogen.
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