Orientador: Maria Lígia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:07:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_DesireeSoaresda_D.pdf: 3168437 bytes, checksum: b863b3429e08cd7ff7926b540a4d69b5 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Inibidores de peptidases (IPs) são proteínas vegetais envolvidas nos mecanismos de defesa contra herbívoros e patógenos. São considerados agentes antimetabólicos, uma vez que sua presença na dieta de insetos compromete seu desenvolvimento normal. Este efeito se dá através da formação de complexos entre os IPs e as enzimas digestivas, comprometendo assim o processo digestivo dos insetos. Neste trabalho, investigamos efeitos do inibidor de tripsina de sementes de Adenanthera pavonina (ApTI) sobre o desenvolvimento de dois insetos-praga, a broca-da-cana (Diatraea saccharalis) e a lagarta-do-cartucho (Spodoptera frugiperda). Bioensaios, estudos bioquímicos e de proteômica, foram realizados a fim de determinar o efeito de ApTI sobre o desenvolvimento destes insetos. A exposição aguda de larvas de D. saccharalis ao ApTI diminuiu a atividade das tripsinas e quimotripsinas em 87% e 63%, respectivamente. ApTI afetou o desenvolvimento deste inseto como observado através da diminuição na viabilidade larval (55%) e pupal (20,6%). Larvas oriundas da geração F1 apresentaram efeitos similares aos observados na geração F0, como redução no peso (23%) e na taxa de sobrevivência (33%). Análises bioquímicas revelaram que o inibidor foi refratário à digestão pelas peptidases de D. saccharalis e que o perfil de enzimas digestivas permaneceu sensível à inibição por quantidades crescentes de ApTI. Entretanto, não foi possível realizar a identificação das proteínas do intestino desta lagarta por espectrometria de massas. Larvas de S. frugiperda foram criadas em dieta contendo 0,5% de ApTI. Ao final dos experimentos, uma redução no peso médio larval de 30% foi observada. Porém, diferentemente dos resultados obtidos para D. saccharalis, as enzimas das larvas alimentadas com ApTI mostraram-se resistentes à inibição, sugerindo que esta espécie adapta-se à dieta contendo inibidor. O sequenciamento das proteínas presentes nos fluidos intestinais de S. frugiperda permitiu a identificação de 41 proteínas. Dentre elas foi possível identificar serinopeptidases do tipo tripsina e quimotripsina, proteínas estruturais, enzimas quinases e fosfatases. Nossos resultados demonstram que são necessários novos estudos para obtenção de mais informações acerca das proteínas presentes no fluido intestinal de S. frugiperda, para correlacionarmos sua expressão diferencial em larvas submetidas a diferentes tratamentos, conhecendo desta maneira um novo indício sobre os mecanismos adaptativos desta espécie contra os IPs / Abstract: Peptidase inhibitors (PIs) are plant proteins involved in defense mechanisms against herbivores and pathogens. They are considered antinutritional compounds, since their presence in insect diet hinder the normal larval development. This effect is due the complexation between PIs and peptidases, affecting the insect digestive process. In this work, we investigated the effects of trypsin inhibitor from Adenanthera pavonina seeds (ApTI) on the development of two pest insects: the sugarcane borer (Diatraea saccharalis) and the fall armyworm (Spodoptera frugiperda). Biochemical and proteomic studies were carried out in order to determine the ApTI effects on the development of these insects. The acute exposure of sugarcane borer to ApTI reduced the trypsin and chymotrypsin activities in 87% and 63%, respectively. The effect of ApTI on development of sugarcane borer was noticed by reduced larval (23%) and pupal viability (33%). Biochemical analysis revealed that the inhibitor was refractory to digestion by D. saccharalis peptidases and the enzymes maintained sensibility to inhibition by increasing amounts of ApTI. However, it was not possible to identify proteins from sugarcane borer gut through mass spectrometry approach. S. frugiperda larvae were reared in artificial diet containing 0.5% ApTI and a reduction in average larval weight of 30% was noticed. But, differently of D. saccharalis, S. frugiperda midgut enzymes became resistant to inhibition by ApTI, showing that this species adapted to ApTI-diet. From the sequencing of S. frugiperda gut fluid proteins we identified 41 proteins. Among them, we identified trypsin and chymotrypsin enzymes, structural proteins and quinases and phosphatases enzymes. Our results demonstrated that further researches are necessary in order to obtain more information about proteins from S. frugiperda gut fluid. The correlation between differential expressed proteins in larvae submitted to different treatments is crucial to reach new indicatives about the adaptive mechanisms this species evolve against PIs / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Maria Imaculada Zucchi, Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:00:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pavinato_VitorAntonioCorrea_D.pdf: 6829608 bytes, checksum: 7fdb8c74593eb4dc2fe78e2302d3995f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A associação entre subpopulações de insetos e plantas-hospedeiras pode ocorrer por adaptação e esta, pode ser uma etapa anterior ao surgimento de raças-hospedeiras e especialização. Pouco se sabe sobre o papel da mudança da composição da paisagem, mediada pela atividade agrícola recente, na divergência adaptativa e fluxo gênico de insetos fitófagos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivos: i) desenvolver marcadores moleculares microssatélites para o estudo genético de um inseto fitófago, Diatraea saccharalis; ii) quantificar e caracterizar a estrutura genética, o fluxo gênico e os fatores que contribuem para a divergência genética das subpopulações da espécie; iii) identificar variação genética sob seleção natural que possa estar contribuindo para a divergência genética de subpopulações associadas a cana-de-açúcar e milho e; iv) desenvolver recurso genômico através de bibliotecas genômicas RADtag para a busca, desenvolvimento e caracterização de marcadores moleculares associados a genes candidatos. Dos 20 locos microssatélites, dez foram selecionados para serem utilizados no estudo de ecologia molecular. Os índices de diferenciação mostraram que, tanto a estruturação genética espacial, quanto a determinada pelo hospedeiro, foram significativas. Dos 301 locos AFLP utilizados para a genotipagem de quatro subpopulações, 19 foram identificados como outliers nas comparações par-a-par e desses, cinco locos foram identificados pelos dois métodos empregados na detecção de outliers, e podem, desta forma, estar associados à adaptação à planta-hospedeira. Os resultados das análises de agrupamento utilizando os locos outliers mostraram o agrupamento dos indivíduos em grupos que representam a planta-hospedeira onde foram coletados. Os mesmos resultados foram obtidos com uma amostra dos SNPs isolados através do protocolo de RADtag. Os dados genômicos obtidos até o momento estão sendo utilizados, juntamente com o estudo de genômica comparativa, na identificação e desenho de primers específicos para genes candidatos. Os resultados mostraram os efeitos da expansão e mudança recente da paisagem agrícola na diversidade genética de uma espécie de inseto fitófago. A atividade agrícola pode ser fonte de seleção divergente suficiente para levar à especialização e especiação de insetos. Os resultados deste trabalho sugerem estar havendo divergência ecológica entre as subpopulações de D. saccharalis coletadas em milho e cana-de-açúcar e que esta divergência, por ser recente, não é completa. Além disso, esses resultados mostram a necessidade de estudos complementares para isolar as fontes de seleção divergente, os mecanismos de isolamento reprodutivo, e a arquitetura genética que liga a seleção divergente ao isolamento reprodutivo / Abstract: The association between subpopulations of insects and their host plants can occur by adaptation and this may lead to host-races formation and specialization. Little is known about the role of the changing landscape composition mediated by recent agricultural activity in adaptive divergence and gene flow of phytophagous insects. This study aimed to: i) develop microsatellite markers for the genetic study of a phytophagous insect, Diatraea saccharalis; ii) quantify and characterize the genetic structure, gene flow and the factors that contribute to the genetic divergence of subpopulations of the species; iii) identify genetic variation that may be experiencing natural selection and thus be contributing to genetic divergence of subpopulations associated with sugarcane and maize; iv) develop genomic resource through RADtag libraries to search, characterize and develop molecular markers linked to candidate genes. Ten of 20 microsatellite loci were selected for use in the study of molecular ecology. The genetic differentiation showed that both spatial genetic structure and that determined by the host-plant were significant. Of the 301 AFLP loci used for genotyping four subpopulations, 19 were identified as outliers in pairwise comparisons and five were identified by the two methods employed for outliers detection and thus, can be associated with host-plant adaptation. Cluster analysis using outlier loci showed the grouping of individuals into groups that represent the host plant where they were collected. Data from a sample of SNPs isolated by RADtag protocol showed the same results. The genomic data obtained so far are being used together with the study of comparative genomics for the identification and design of specific primers for candidate genes. The results showed the effects of expansion and recent changes in agricultural landscape in genetic diversity of phytophagous insect species. Farming can generate enough source for ecologically based divergence that could lead to specialization and speciation in insects species. The results of this study suggest that there is ecological divergence between subpopulations of D. saccharalis collected from corn and sugarcane, but it is not complete. In addition, these results showed the need for further studies to isolate the sources of divergent selection, the mechanisms of reproductive isolation, and the genetic architecture linking the divergent reproductive isolation with selection / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular