Tübingen, Univ., Diss., 2005.

In deafness, which is caused by the malfunctioning of the inner ear, an implantation of a cochlear implant (CI) is able to restore hearing. The CI is a neural prosthesis that is located within the cochlea. It replaces the function of the inner hair cells by direct electrical stimulation of the auditory nerve fibers. The CI enables many deaf or severe hearing-impaired people to achieve a good speech perception. Nevertheless, there is a lot of potential for further improvements. Compared to normal-hearing listeners rate pitch discrimination is much worse. Rate pitch discrimination is the ability to distinguish the pitch of two stimuli with two different pulse rates. This ability is important for enjoying music as well as speech perception (in noise). Further, the small dynamic range in electrical hearing (compared to normal-hearing listeners) and therefore the small intensity resolution limits the performance of CI users. Both, rate pitch coding and dynamic range were investigated in this doctoral thesis. For the first issue, a pitch discrimination task was designed to determine the just-noticeable-difference (JND) in pitch with 200 and 400 pps as reference. Additionally to the default biphasic pulse (single pulse) the experiment was performed with double pulses. The double pulse consists out of two biphasic pulses directly after each other and a small interpulse interval (IPI) in between. Three different IPIs (15, 50, and 150 µs) were tested. The statistical analysis of JNDs revealed no significant effects between stimulation with single-pulse or double-pulse trains. A follow-up study investigated an alternating pulse train consisting of single and double pulses. To investigate if the 400 pps alternating pulse train is comparable in pitch with the 400 pps single-pulse train, a pairwise pitch comparison test was conducted. The alternating pulse train was compared with single-pulse trains at 200, 300 and 400 pps. The results showed that the alternating pulse train is for most subjects similar in pitch with the 200 pps single-pulse train. Therefore, pitch perception seemed to be dominated by the double pulses within the pulse train. Accordingly, double pulses with different amplitudes were tested. Based on the facilitation effect, a larger neuronal response was expected by stimulating with two pulses with a short IPI within the temporal facilitation range. In other studies, this effect was shown to be maximal in CIs of the manufacturer Cochlear, with first pulse amplitudes set at or slightly below the electrically evoked compound action potential (ECAP) threshold. The second pulse amplitude did not influence the facilitation effect and therefore could be choose at will. Similarly, this effect was tested in this thesis with CIs of the manufacturer MED-EL. Nevertheless, to achieve a proper signal-to-noise ratio, technical issues had to be addressed like a high noise floor, resulting in incorrect determination of the ECAP threshold. After solving this issues, the maximum facilitation effect was around the ECAP threshold as in the previous study with Cochlear. For future studies this effect could be used in a modified double pulse rate pitch experiment with the first pulse amplitude at ECAP threshold and the second pulse amplitude variable to set the most comfortable loudness level (MCL). The last study within this thesis investigated the loudness perception at two different loudness levels and the resulting dynamic range for different interphase-gaps (IPG). A larger IPG can reduce the amplitude at same loudness level to save battery power. However, it was unknown if the IPG has an influence on the dynamic range. Different IPGs (10 and 30 µs) were compared with the default IPG (2.1 µs) in a loudness matching experiment. The experiment was performed at the most comfortable loudness level (MCL) of the subject and the amplitude of half the dynamic range (50%-ADR). An upper dynamic range was calculated from the results of MCL and 50%-ADR (therefore not the whole dynamic range was covered). As expected from previous studies a larger IPG resulted in smaller amplitudes. However, the observed effect was larger at MCL than at 50%-ADR which resulted in a smaller upper dynamic range. This is the first time a decrease of this dynamic range was shown. / Bei einer Taubheit, welche durch eine Schädigung des Innenohres hervorgerufen wird, ist es möglich das Gehör mittels eines Cochlea-Implantates (CI) wieder herzustellen. Das Implantat befindet sich innerhalb der Hörschnecke und ist in der Lage, die Funktion der inneren Haarzellen zu ersetzen. Dies geschieht durch direkte elektrische Stimulation der auditorischen Nervenfasern. Dadurch ermöglicht das CI Ertaubten oder stark Schwerhörigen, ein gutes Sprachverstehen zu erlangen. Dennoch gibt es weiterhin Verbesserungspotential. Im Vergleich zu Normalhörenden ist unter anderem die Tonhöhenunterscheidung stark eingeschränkt. Die Unterscheidung von Tonhöhen ist sowohl für den Musikgenuss als auch für das Sprachverstehen (im Störgeräusch) wichtig. Ebenso verfügen CI Träger über einen vergleichsweise kleinen Dynamikbereich und einer daraus resultierenden geringen Auflösung der Intensitäten. Dies kann zu einer Beeinträchtigung des Hörens führen. Sowohl die Fähigkeit der Tonhöhenunterscheidung als auch der Dynamikbereich werden in der vorliegenden Doktorarbeit untersucht. Hierfür wurde zunächst ein Tonhöhenunterscheidungs-Experiment entworfen, bei welchem der kleinste wahrnehmbare Unterschied zweier Pulsraten ermittelt wurde. Die Pulsraten 200 und 400 pps dienten als Referenzwert. Neben dem standardmäßig verwendeten Biphasischen Puls, wurden Doppelpulse genutzt. Diese bestehen aus zwei aufeinander folgenden biphasischen Pulsen gleicher Amplitude, welche durch ein kurzes interpuls Intervall (IPI) separiert sind. In dem Experiment wurden drei unterschiedliche IPIs getestet (15, 50 und 150 µs). Die Analyse des kleinesten wahrnehmbaren Tonhöhenunterschieds ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen dem einfachen Puls und den Doppelpulsen. Ein Folgeexperiment beschäftigte sich mit einer alternierenden Pulsfolge bestehend aus dem einfachen und dem Doppelpuls. In einem paarweisen Vergleichsexperiment wurde die alternierende Pulsfolge bei 400 pps mit einem Einfachpuls bei 200, 300 und 400 pps in ihrer Tonhöhe verglichen. Es zeigte sich, dass die alternierende Pulsfolge bei 400 pps mehrheitlich mit dem Einzelpuls bei 200 pps vergleichbar war. Demzufolge scheint die Tonhöhenwahrnehmung der alternierenden Pulsfolge von dem Doppelpuls dominiert zu werden. Auf beide Experimente aufbauend, wurden Doppelpulse mit unterschiedlichen Amplituden untersucht. Basierend auf den Bahnungseffekt (Facilitation-Effekt), kann eine größere neuronale Antwort hervorgerufen werden, indem mit Doppelpulsen mit kurzem IPI stimuliert wird. In einer anderen Studie konnte anhand von CIs der Firma Cochlear gezeigt werden, dass dieser Effekt maximal war, wenn die Amplitude des ersten Pulses nahe der Schwelle zum elektrisch evozierten Summenaktionspotential (ECAP) liegt. Die Amplitude des zweiten Pulses dagegen hatte keinen Einfluss auf den „Facilitation“-Effekt und konnte beliebig gewählt werden. Dieser Effekt wurde mit CIs der Firma MED-EL in der vorliegenden Doktorarbeit nachgestellt. Es zeigte sich, dass auch hier der größte „Facilitation“-Effekt auftrat, wenn die Amplitude des ersten Pulses nahe der ECAP-Schwelle lag. In zukünftigen Studien könnte dieser Effekt für einen modifizierten Doppelpuls genutzt werden, um mit diesem das ursprüngliche Tonhöhenunterscheidungs-Experiment zu wiederholen. Dabei würde die Amplitude des ersten Pulses der ECAP-Schwelle entsprechen, während die zweite Pulsamplitude variiert wird, um den größten, möglichst angenehmen, Lautheitspegel zu erhalten. In einer letzten Studie wurde das Lautheitsempfinden bei zwei unterschiedlichen Lautheiten bei unterschiedlichen Interphasen-Gaps (IPG) untersucht und der daraus resultierende Dynamikbereich. Eine Vergrößerung des IPGs führt bei gleich bleibendem Lautheitsempfinden zu geringeren Stimulations-Amplituden und ist dadurch in der Lage die Batterie schonen. Allerdings ist der Einfluss auf den Dynamikbereich bisher unbekannt. In einem Lautheits-Experiment wurden Pulse mit verschiedenen IPGs (10 und 30 µs) mit dem standardmäßig verwendeten IPG (2.1 µs) in ihrer Lautheit angeglichen. Dieses Verfahren wurde bei MCL und der Amplitude des halben Dynamikbereichs (50%-ADR) durchgeführt. Aus den ermittelten Werten konnte ein „oberer“ Dynamikbereich zwischen MCL und 50%-ADR ermittelt werden. Es zeigte sich, dass sich die Amplituden mit größerem IPG, wie erwartet, verringerten. Jedoch zeigte sich ein stärkerer Effekt bei MCL, was eine Verringerung des Dynamikbereichs zur Folge hat. Dies ist das erste Mal, dass eine Verringerung des Dynamikbereichs gezeigt wurde.

Die Informationsverarbeitung im Nervensystem basiert auf der Signalübertragung an chemischen Synapsen. Um diese bei hochfrequenter Aktivität aufrecht erhalten zu können, ist das Nachfüllen von Neurotransmitter-gefüllten Vesikeln an die präsynaptische Membran von zentraler Bedeutung. Die glutamatergen Parallelfaser-Purkinjezelle-Synapsen (PF-PC-Synapsen) des Zerebellums weisen eine ausgeprägte und anhaltende Kurzzeitbahnung für bis zu 30 Aktionspotentiale (APs) bei hochfrequenter Aktivität auf, obwohl anfänglich nur eine vergleichsweise geringe Anzahl synaptischer Vesikel (~ 3) an der aktiven Zone gedockt ist. Dies wird durch ultra-schnelles Nachfüllen (Recruitment) im Millisekundenbereich ermöglicht, welches sogar zu einer Vergrößerung des Pools gedockter und freisetzungsbereiter Vesikel (Readily releasable pool, RRP) führt (Overfilling, Überfüllen). Es gibt Evidenz dafür, dass dieser Prozess mindestens teilweise Kalzium(Ca2+)-abhängig ist. Durch welche Kanäle das hierfür bereitgestellte Ca2+ in die Präsynapse gelangt, war bislang unklar. An PF-PC-Synapsen sind drei Subtypen spannungsabhängiger Ca2+-Kanäle (Cavs) vorhanden: Cav2.1 (P/Q Typ), Cav2.2 (N Typ) und Cav2.3 (R Typ). Diese stellen in jungen Mäusen (P8-10) gemeinsam das Ca2+ für die Freisetzung der Transmitter-Vesikel zur Verfügung. Während der Entwicklung verringert sich die Kopplungsdistanz zwischen Cav2.1-Kanälen und Ca2+-Sensor, sodass bei reiferen Tieren (P21–24) allein der Ca2+-Einstrom durch eng gekoppelte Cav2.1 zur Vesikelfreisetzung führt. Cav2.2 und Cav2.3 sind jedoch weiterhin an der Präsynapse vorhanden und tragen zum Aktionspotential(AP)-vermittelten Ca2+-Einstrom bei. Die Funktion dieser Kanäle in reiferen Tieren blieb bisher weitgehend ungeklärt. Vorliegend wurden folgende Hypothesen überprüft: 1. Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 oder Cav2.3 ist für spontane, nicht AP-vermittelte Vesikelfreisetzung verantwortlich. 2. Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 oder Cav2.3 stellt Ca2+ für ultra-schnelles Nachfüllen mit Überfüllen bereit. Um diese Hypothesen zu prüfen, wurden Whole-Cell Patch-Clamp Messungen an Purkinjezellen in akuten Hirnschnitten reifer (P21–24) C57BL/6 Mäuse durchgeführt und die Parallelfasern (PFs) extrazellulär in der Molekularschicht stimuliert. Zunächst wurde die Hypothese geprüft, ob Cav2.2 und Cav2.3 an der Ca2+-Bereitstellung für spontane Vesikelfreisetzung beteiligt sind. Dazu wurden sogenannte miniature excitatory postsynaptic currents (Miniatur-EPSCs, mEPSCs) der Purkinjezellen aufgezeichnet. Bei Erhöhung der extrazellulären Ca2+-Konzentration von 2 mM auf 5 mM zeigte sich eine deutliche Steigerung der mEPSC-Frequenz, was die Annahme stützt, dass die spontane Vesikelfreisetzung eine Ca2+-abhängige Komponente hat. Um Rückschlüsse auf die Beteiligung der Cav-Subtypen ziehen zu können, wurden Cav2 Subtyp-spezifische Toxinblocker eingesetzt. Ω-Agatoxin-IVA wurde zur Blockierung von Cav2.1 eingesetzt. Cav2.2 wurde mit Ω-Conotoxin GVIA und Cav2.3 mit SNX-482 blockiert. Unter dem Einfluss dieser Toxine konnte weder einzeln noch in Kombination ein Effekt auf die Frequenz der mEPSCs beobachtet werden. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Funktion dieser Cav2s nicht die Ca2+-Bereitstellung für spontane Vesikelfreisetzung ist. Anschließend wurde der Einfluss der Blockade der Cav2 Subtypen auf das Vesikel-Nachfüllen untersucht. Dazu wurden Parallelfasern zunächst fünf Mal bei einer Frequenz von 20 Hz extrazellulär stimuliert und die hervorgerufenen EPSCs aufgezeichnet. Hieraus wurde das Verhältnis aus den Amplituden des zweiten bis fünften EPSCs zur Amplitude des ersten EPSCs berechnet (Ai/A1). Diese Paarpulsverhältnisse sollten sich bei einem durch Cav2-Blocker beeinträchtigtem Vesikel-Nachfüllen verkleinern. Ein solcher Effekt war jedoch bei dieser kurzen Aktivierung mit 5 Stimuli nicht zu beobachten. Da die in-vivo-Aktivität an der PF-PC-Synapse aus längeren, hochfrequenten Trains besteht und sie in der Lage ist, auch bei länger anhaltender Stimulation zu bahnen, wurde ein weiteres Experiment mit Trains aus 50 Stimuli durchgeführt. Hierbei sollte während oder zumindest gegen Ende des Trains ein Gleichgewicht aus Freisetzung und Nachfüllen (Steady State) erreicht werden. Dazu war es erforderlich, die extrazelluläre Ca2+-Konzentration auf 6 mM zu erhöhen. Die aufgezeichneten EPSC-Amplituden wurden in einem kumulativen Plot aufgetragen und mit einer Methode nach Schneggenburger et al. ausgewertet. Dabei wird der Gleichgewichtsbereich mit einer linearen Funktion gefittet, deren Anstieg ein Maß für die Nachladerate und deren y-Achsenabschnitt ein Maß für das Dekrement des RRP ist. Durch spezifische Blockade einzelner Cav-Subtypen kann man Aussagen über deren Einfluss auf Vesikel-Nachfüllen und RRP treffen. Unter Hinzugabe von Ω Agatoxin IVA konnte, wie erwartet, eine starke Reduktion bereits bei der ersten EPSC-Amplitude beobachtet werden, da der Ca2+-Einstrom durch Cav2.1 entscheidend für die Freisetzungswahrscheinlichkeit der Vesikel (pv) ist. Hierdurch erklärt sich die beobachtete Abnahme des RRP-Dekrements. Der Anstieg der Geraden im Gleichgewichtszustand zeigte sich durch Ω-Agatoxin-IVA nicht signifikant verändert. Allerdings könnte ein möglicher Effekt durch die starke Reduktion der pv maskiert sein. Daher wurde in einem weiteren Versuch eine reduzierte Dosis (100 nM statt 250 nM) Ω Agatoxin-IVA eingesetzt. Hier zeigte sich neben dem Effekt auf das RRP-Dekrement außerdem ein vermindertes Nachfüllen der Vesikel. Dieser Effekt wurde bei voller Dosis vermutlich maskiert und weist darauf hin, dass Ca2+-Einstrom durch Cav2.1 zur Aufrechterhaltung des Vesikel-Nachfüllens beiträgt. Bei Blockade von Cav2.3 mit SNX-482 konnte kein signifikanter Einfluss auf Vesikel-Nachfüllen oder RRP festgestellt werden. Unter dem Einfluss des Cav2.2-Blockers Ω-Conotoxin GVIA zeigte sich ein interessanter Effekt: Die Nachladerate wurde durch die Toxinapplikation selektiv reduziert. Hieraus lässt sich schlussfolgern, dass die Bereitstellung von Ca2+ für das Vesikel-Nachfüllen eine Funktion des Cav2.2 an dieser Synapse darstellt. Das RRP-Dekrement blieb davon unbeeinflusst, was zu dem beschriebenen Befund passt, nach dem Cav2.2s in diesem Alter nicht an der Vesikelfreisetzung beteiligt sind. Unter Cav2.1-Block dagegen, blieben die EPSC-Amplituden am Ende verhältnismäßig unbeeinflusst, während die ersten stark reduziert waren. Dieser Befund passt zu der Annahme, dass Ω-Agatoxin-IVA pv stark verringert, während das Nachfüllen über den erhaltenen Ca2+-Einstrom durch Cav2.2 weiterläuft. Anhand unserer Daten ist allerdings nicht auszuschließen, dass ein Unterschied zwischen früh und spät im Train rekrutierten Vesikeln hinsichtlich deren Kopplung an Cav2.1 oder Cav2.2 besteht. Im Anschluss an die Trains mit 50 Stimuli wurde eine Erholungsphase aufgezeichnet. Hierbei wurde mit konsekutiv steigenden Interstimulus-Intervallen die Regeneration der EPSC-Amplituden bis etwa auf das Ausgangsniveau aufgezeichnet. Der Zeitverlauf der Erholung wurde mittels biexponentieller Funktionen gefittet. Bei der Applikation von Ω Agatoxin-IVA zeigte sich der Gleichgewichtszustand ohne Depression, während er unter Ω Conotoxin GVIA und SNX-482 eine deutliche Depression aufwies. Ω-Agatoxin-IVA führte zu einer signifikant beschleunigten Erholung. Dieser Effekt resultiert aber am ehesten aus der starken Reduktion von pv und der fehlenden Depression. Sowohl der Zeitverlauf der Erholung als auch die EPSC-Amplituden während der kurzen Aktivierung mit 5 Stimuli waren unbeeinflusst von Cav2.2- und Cav2.3-Block. Gemeinsam spricht dies für das Vorhandensein eines basalen Nachfüllens, welches zusätzlich zum Ca2+-abhängigen Nachfüllen mit Einstrom durch Cav2.1 und Cav2.2 stattfindet. Das Ziel der Studie bestand darin, die Funktion der Cav2.2- und Cav2.3-Kanäle im präsynaptischen Bouton der reifen Parallelfaser zu erforschen. Obwohl spontane Vesikelfreisetzung zumindest teilweise Ca2+-abhängig zu sein scheint, war keiner der untersuchten Cav2-Kanäle bedeutsam beteiligt. Bei Cav2.3 konnte des Weiteren keine Relevanz für das Nachfüllen festgestellt werden. Für Cav2.2-Kanäle konnte jedoch die Funktion als Ca2+-Bereitsteller für das Nachfüllen bei anhaltender synaptischer Transmission identifiziert werden. Zusammenfassend bestätigen unsere Daten den maßgeblichen Einfluss von Cav2.1 auf pv und zeigen eine wichtige Funktion von Cav2.2: die Erhaltung der synaptischen Effektivität unter anhaltender, hochfrequenter Aktivität an der Parallelfaser. Es bleibt die Frage offen, inwiefern diese Befunde auch für andere kleine glutamaterge Synapsen, beispielsweise im Neocortex, zutreffen. Auch dort konnte der entwicklungsbedingte Wechsel von gemeinsamer Steuerung der Vesikelfreisetzung durch Cav2.1 und Cav2.2 zu alleiniger Steuerung durch Cav2.1 beobachtet werden. Gleichzeitig bleibt auch hier die Ca2+-Signalgebung durch Cav2.2 erhalten.:Einleitung 1 Aufbau und Funktion chemischer Synapsen 1 Kurzzeitbahnung und Vesikel-Nachfüllen 2 Parallelfaser-Purkinjezelle-Synapse als Modellsystem 4 Experimenteller Aufbau und Auswertungsmethoden 7 Publikation 9 Zusammenfassung 24 Literaturverzeichnis 28 Darstellung des eigenen Beitrags 31 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 32 Lebenslauf 33 Danksagung 34

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