Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-14T14:33:21Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 21140 bytes, checksum: f257be804d9a30cfb29d742fcc325158 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-14T14:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 21140 bytes, checksum: f257be804d9a30cfb29d742fcc325158 (MD5) Previous issue date: 2005-01-14 / O objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação de basidiósporos de Pisolithus sp., bem como os eventos de meiose, mitose pós-meiótica e o acúmulo de reservas lipídicas durante o desenvolvimento dos basidiocarpos fúngicos. Os estudos foram conduzidos em corpos de frutificação frescos, coletados sob florestas de Eucalyptus spp., na Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. Os eventos envolvidos na formação dos basidiósporos foram analisados utilizando-se técnicas de microscopia ótica, microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de varredura e cromatografia gasosa. Pisolithus sp. produz oito esporos por basídio, envolvidos em matriz gelatinosa, no interior dos peridíolos constituintes do basidioma. Os esporos apresentam de 6 a 8 μm de diâmetro, são globosos, equinatos, com espículas embotadas. Previamente à formação dos basidiósporos, as células das hifas constituintes do peridíolo diferenciam-se em basídios clavados com 12 a 18 μm de comprimento e 6 a 8 μm de diâmetro. Os basidiocarpos apresentam abundante quantidade de lipídeos totais distribuídos nos basídios e nos esporos. A análise da composição de ácidos graxos revelou a presença de 17 compostos com cadeias de 14 a 20 carbonos, na maioria insaturados, contendo uma ou duas insaturações. A composição e o conteúdo em ácidos graxos variou de acordo com o estádio de desenvolvimento dos peridíolos. Nos basidiósporos livres, os ácidos graxos predominantes foram 16:0, 16:1w5c, 18:1w9c e a mistura 18:2w6,9c/18:0ante, sugerindo que o ácido oléico seja o principal ácido graxo constituinte das reservas lipídicas dos basidiósporos. Na formação do diplóide, a cariogamia pode ocorrer tanto no basídio quanto nas células das hifas sub- basidiais ou sub-apicais, seguindo-se os eventos característicos da divisão meiótica. Após a formação da tétrade meiótica nos basídios, há a ocorrência de uma rodada de divisão nuclear mitótica, resultando na produção de oito núcleos na célula basidial. Os núcleos formados migram para dentro dos basidiósporos de forma assincrônica. Durante os eventos de migração, os núcleos haplóides adquirem a forma de fuso, sugerindo a participação de microtúbulos no transporte dessas organelas. Este estudo constitui o primeiro relato dos processos de divisão e migração nuclear em Pisolithus durante a formação dos basidiósporos e da presença e distribuição de ácidos graxos no basidiocarpo desse fungo. O conhecimento das etapas de formação dos basidiósporos e das características das reservas de carbono presentes nesses propágulos permitirá o desenvolvimento de estratégias que visem elucidar os fatores que influenciam o processo de germinação dos basidiósporos de Pisolithus sp., viabilizando a utilização desses esporos como inoculantes, em viveiros florestais, e na pesquisa genética focalizada na associação ectomicorrízica. / The objective of this work was to characterize the formation of Pisolithus sp. basidiospores as well as the events of meiosis, post-meiotic mitosis, and the accumulation of lipid reserves during the development of the fungal basidiocarps. This study was conducted in fresh fruit bodies collected under Eucalyptus spp. forests at Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. The events involved in the development of the basidiospores were analyzed using light microscopy, fluorescent microscopy, scanning electron microscopy, and gas chromatography. Pisolithus sp. produces eight spores per basidium imbibed in a gelatinous matrix inside the peridioles constituting the basidiome. The spores are, approximately, 6 to 8 μm in diameter, globose, echinate, with blunt spines. Previously to the formation of the basidiospores, hyphal cells forming the peridioles differentiate into clavate basidia with 12 to 18 μm in length, and 6 to 8 μm in width. The basidiocarps present abundant quantities of total lipids distributed in hyphae, basidia, and basidiospores. Composition analyses of fatty acids revealed the presence of 17 compounds with 14 to 20 carbon atoms, mostly insaturated, containing one or two insaturations. The composition and content of fatty acids varied according to the developmental stage of the peridioles. Inside free basidiospores, the predominant fatty acids were 16:0, 16:1w5c,18:1w9c, and the mixture 18:2w6,9c/18:0ante, suggesting that oleic acid is the main fatty acid making up the lipid reserves of the spores. ixDuring diploid formation, karyogamy can take place either in the basidia as well as in subbasidial or subapical hyphal cells, followed by the typical events of meiotic division. After the formation of the meiotic tetrad in the basidia, one round of mitotic nuclear division occurs, resulting in the production of eight nuclei per basidial cell. The newly-formed nuclei migrate into basidiospores asynchronously. During the migration events, the haploid nuclei acquire a fusiforme shape, suggesting the participation of microtubules in the nuclear transport into spores. This work is the first report on the nuclear division and migration in Pisolithus during the formation of basidiospores and on the presence and distribution of fatty acids in the basidiomata of this fungus. A thorough understanding of the main stages of basidiospore formation and of the main characteristics of the carbon reserves present within these spores will allow the development of strategies aiming at the elucidation of the factors that influence the germination of Pisolithus sp. basidiospores. This will ultimately make possible the use of these spores as inoculants in forest nurseries and in the genetic research focused on the ectomycorrhizal association.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 528396 bytes, checksum: 2b516aa2ea3ea48bfb173971c8b65f4c (MD5) Previous issue date: 2010-08-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The low germination percentages of P. microcarpus basidiospores represents a major drawback for obtaining monokaryotic strains for quantitative genetic studies on the mycorrhizal associations, the use of spores in mutagenesis experiments aiming at the identification of genes important to the symbiosis, and the use of these propagules as inoculants in forest nurseries. The characterization of the mRNA present within the fungal basidiospores may provide information on the level of preparedness of the spores to germinate and sustain initial hyphal growth. The aim of this work was to characterize the mRNA present in the basidiospores of the ectomycorrhizal fungus P. microcarpus after basidiosporogenesis. Total RNA was extracted from the mature basidiospores and mycelium and mRNA was used for cDNA synthesis. An analysis of the presence of 14 gene transcripts involved in lipid metabolism, glycogen mobilization, trehalose mobilization, nitrogen assimilation, glycolysis, pentose phosphate pathway and glucan degradation using cDNA from the fungal basidiospores and dikaryotic mycelium was done. qPCR analysis was performed to compare the amount of transcripts of the genes d15fa, ntrh, and ag13 which code respectively, for Δ15 fatty acid desaturase, neutral α-trehalase, and α-1,3-glucosidase in the dikaryotic mycelium and basidiospores. The 14 transcripts studied were present both in the dikaryotic mycelium and in the basidiospores, indicating a preparedness of these propagules to initiate and sustain germination. qPCR analysis indicated a higher amount of transcripts of genes the d15fa, ntrh, and ag13 inside the basidiospores when compared to the dikaryotic mycelium. These results suggest a higher need for enzymes involved in the synthesis of unsaturated fatty acids, trehalose mobilization, and glucan degradation during basidiospore germination. A cDNA library was constructed from basidiospore mRNAs and 288 clones were sequenced. One hundred and nineteen sequences were obtained, resulting in a total of 12 ESTs (expressed sequence tags). The amino acid sequence deduced from the EST corresponding to clone 277 showed significant similarity to a protein involved in respiratory metabolism and may be important during the germination process. Other ESTs showed significant identity to unknown ESTs deposited in the NCBI database. These ESTs may code for proteins that are specific of the basidiospores of P. microcarpus. However, to confirm this hypothesis, other clones must be sequenced to better characterize the cDNA library. / As baixas percentagens de germinação dos basidiósporos do fungo ectomicorrízico Pisolithus microcarpus dificultam a obtenção de estirpes monocarióticas, material para estudos de genética quantitativa da associação micorrízica, inviabilizam a utilização de esporos em experimentos de mutagênese visando à identificação de genes importantes para a simbiose, além de dificultar a utilização desses propágulos como inoculantes em viveiros florestais. A caracterização do mRNA presente no interior desses basidiósporos poderá fornecer informações sobre o nível de preparação que têm para iniciar o processo de germinação e sustentar o crescimento inicial das hifas. O objetivo deste trabalho foi o de caracterizar os mRNA presentes nos basidiósporos do fungo ectomicorrízico P. microcarpus após a basidiosporogênese. O RNA total foi extraído de basidiósporos maduros e micélio, procedendo posteriormente a obtenção mRNA para a síntese de cDNA. Determinou-se a presença de transcritos de 14 genes envolvidos no metabolismo de lipídeos, na mobilização de glicogênio, na mobilização de trealose, na assimilação de nitrogênio, na via glicolítica, na via das pentoses fosfato e na degradação de glicanas. A análise por qPCR foi realizada visando comparar a quantidade de transcritos dos genes d15fa, ntrh e ag13 que codificam respectivamente as enzimas ácido graxo-Δ15 desaturase, α- trealase neutra e 1,3-α-glicosidase, nos basidiósporos e no micélio dicariótico. Os 14 x transcritos avaliados foram encontrados tanto no micélio dicariótico quanto nos basidiósporos, sugerindo a preparação desses propágulos para iniciar e sustentar o processo de germinação. A análise por qPCR indicou maior quantidade de transcritos dos genes d15fa, ntrh e ag13 no interior dos basidiósporos quando comparado ao micélio dicariótico. Esse resultado sugere a participação de enzimas responsáveis pela síntese de ácidos graxos insaturados, mobilização de trealose e degradação de glicanas durante o processo de germinação. Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir dos fragmentos de cDNA dos basidiósporos, sendo caracterizada por meio do sequenciamento de 288 clones. Foram obtidas 119 sequências que, ao serem agrupadas, resultaram em 12 ESTs (expressed sequence tags). A sequência de aminoácidos deduzida da EST referente ao clone 277 apresentou similaridade significativa com proteína envolvida no metabolismo respiratório, podendo ser importante durante o processo de germinação. Outras ESTs apresentaram identidade significativa com ESTs depositadas no banco de dados do NCBI ainda não identificadas. Alternativamente, sugere-se que essas ESTs possam ser codificadoras de proteínas específicas dos basidiósporos de P. microcarpus, importantes para a etapa de germinação desses propágulos.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1165886 bytes, checksum: 9908ee426c5cfd8f17fea52b7f132085 (MD5) Previous issue date: 2011-08-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The basidiospores of Pisolithus show low germination percentages despite possessing conspicuous reserve compounds for the provision of carbon and energy during the initial growth of the fungal hyphae. The highly hydrophobic and resistant cell wall of the basidiospore can contribute to basidiospores recalcitrance to germination. Thus, this study aimed at demonstrating the presence of glycogen, polysaccharides, lipids, RNA and proteins in mature basidiospores of Pisolithus microcarpus, determining the fatty acid profile of the basidiospores of ectomycorrhizal fungi, and evaluating methods of permeabilization of the basidiospore cell wall. Hystochemical techniques used in the detection of different reserve compounds in the basidiospores revealed the presence of glycogen, polysaccharides, proteins, RNA, lipids, lipoproteins, neutral lipids, and acidic lipids. The presence of 11 different fatty acids in the basidiospores of P. microcarpus, nine in those of Scleroderma sp. and 16 in the basidiospores of Suillus sp. was observed in our study. The most abundant fatty acids in the fungal basidiospores were 18:1w9c and 16:0. Besides oleic and palmitic acids, the following fatty acids showed significant contents: 16:1w5c 16:0, 18:1w5c for P. microcarpus; 12:1 AT11-12, 18:00 for Scleroderma sp.; 15:00 and 18:00 for Suillus sp. The fatty acid profile of the basidiospores of P. microcarpus showed 36.8 % similarity to that of Scleroderma sp. The fatty acid profile of these two species showed a similarity of only 5.2 % compared to that of Suillus sp. The use of chitinase, cellulase, and lyticase for 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, and 24 h, at 30 °C, under stirring at 80 rpm, and of sulfuric acid at concentrations of 5, 10, 25, 50 % (v / v) for 5, 10, 25, 50 or 80s did not promote cell wall permeability. The treatment with sodium hypochlorite at concentrations of 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 90 and 100 % of original concentration of active chlorine (20 g L-1) and contact times of 5, 10 , 20, 30, 40, 50, 60, 70, and 80s promoted the permeabilization of the basidiospore cell wall as evaluated by the staining of internal fatty acids with Sudan Black B. The highest percentage of permeabilized basidiospores, 97 %, was obtained with the treatment with hypochlorite at 100 % for 80s. However, the viability tests and the observation of basidiospores by scanning electron microscopy revealed the loss of viability and cell wall integrity. The exposure of the basidiospores to sodium hypochlorite at 5 % for 40s promoted the highest percentages of permeabilized basidiospores, 83 %, without loss of viability and morphological damages to the spore cell wall. These results contribute to the understanding of the variables that may play a role in the process of germination of basidiospores of P. microcarpus and allow the development of strategies to improve the isolation of monokaryons in vitro. / Os basidiósporos Pisolithus apresentam baixas percentagens de germinação, embora disponham de compostos de reserva para a provisão de carbono e energia durante o crescimento inicial das hifas. Neles, a parede celular altamente hidrofóbica e resistente pode contribuir para a recalcitrância à germinação. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo demonstrar a presença de glicogênio, polissacarídeo, lipídeos, RNA e proteínas em basidiósporos maduros de Pisolithus microcarpus, determinar o perfil de ácidos graxos de basidiósporos de fungos ectomicorrízicos e avaliar métodos de permeabilização da parede celular dos basidiósporos. As técnicas histoquímicas utilizadas na detecção de diferentes compostos de reserva nos basidiósporos evidenciaram a presença de glicogênio, polissacarídeos, proteínas, RNA, lipídeos totais, lipoproteínas, lipídeos neutros e lipídeos ácidos. Detectou-se a presença de onze ácidos graxos distintos nos basidiósporos de P. microcarpus, nove nos de Scleroderma sp. e dezesseis nos de Suillus sp. Os ácidos graxos mais abundantes nas estruturas fúngicas analisadas foram o 18:1w9c e o 16:0. Além do ácido oléico e ácido palmítico, destacaram-se os seguintes ácidos graxos: 16:1w5c, 18:1w5c para P. microcarpus; 12:1at11-12 e 18:00 para Scleroderma sp.; 18:00 e 15:00 para Suillus sp. O perfil de ácidos graxos dos basidiósporos de P. microcarpus apresentou similaridade de 36,8 % com o de Scleroderma sp. O perfil de ácidos graxos dessas duas espécies apresentou similaridade de somente 5,2 % em relação àquele de Suillus sp. O uso de quitinase, liticase e celulase por 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 e 24 h, sob agitação a 80 rpm e a 30 °C, não resultou na permeabilização da parede celular dos basidiósporos. O tratamento dos basidiósporos com ácido sulfúrico nas concentrações de 5, 10, 25, 50 % (v/v), por 5, 10, 25, 50 ou 80 s, também não resultou na permeabilização dos basidiósporos. Os tratamentos com hipoclorito de sódio em concentrações de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 90 e 100 % da concentração original de cloro ativo (20 g L- 1) e tempos de contato de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80 s promoveram a permeabilização da parede celular dos basidiósporos avaliada pela penetração do corante Negro Sudão B. A maior percentagem de basidiósporos permeabilizados, 97 %, foi obtida com o tratamento com hipoclorito a 100 % pelo tempo de 80 s. No entanto, os testes de viabilidade e a observação dos basidiósporos por microscopia eletrônica de varredura evidenciaram a perda da integridade da parede celular e da viabilidade dos esporos quando submetidos a esse tratamento. A exposição dos basidiósporos ao hipoclorito de sódio a 5 % pelo tempo de 40 s foi o tratamento que resultou em maiores percentagens (83 %) de basidiósporos permeabilizados, sem prejuízos na viabilidade e da morfologia desses propágulos. Os resultados obtidos contribuem para a compreensão das variáveis que atuam no processo de germinação dos basidiósporos de P. microcarpus e permitirão o desenvolvimento de estratégias visando melhorar a obtenção de monocários in vitro.