Vor etwas mehr als 20 Jahren wurden erstmals an das Myokard bindende beta1-Rezeptorantikörper im Zusammenhang mit der Chagas-Krankheit beschrieben. Die Arbeiten der beiden folgenden Jahrzehnte konnten zeigen, dass solche beta1-Rezeptorantikörper mit einer Prävalenz von ca. 30 bis 95% (in Abhängigkeit vom verwendeten Nachweisverfahren) v.a. auch bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (DCM) nachgewiesen werden können. Insbesondere Antikörper gegen die zweite extrazelluläre Domäne des beta1-adrenergen Rezeptors (beta1-ECII) scheinen dabei in der Lage zu sein, den Rezeptor funktionell zu beeinflussen und zu aktivieren. Beta1-ECII wurde in der Folge als potentes Autoantigen mit T- und B-Zell-Epitopen identifiziert. Erste klinische Untersuchungen an Patienten mit DCM haben gezeigt, dass das Vorhandensein zirkulierender b1-ECII-Antikörper mit einer schlechteren linksventrikulären Funktion, dem Auftreten ventrikulärer Arrhythmien sowie mit einer erhöhten kardiovaskulären Mortalität verbunden ist. Der Verdacht, dass beta1-Antikörper bei der DCM nicht nur ein Epiphänomen, sondern bei einem Teil der betroffenen Patienten auch mögliche Krankheitsursache darstellen könnten, verstärkten dann in jüngster Zeit die Bestrebungen, ein Tiermodell für die Antikörper-induzierte Genese einer Kardio-myopathie zu generieren. So fanden 1997 Matsui et al. im Kaninchenmodell nach Immunisierung mit einem beta1-ECII-homologen Peptid über 12 Monate eine biventrikuläre Dilatation und kompensatorische Hochregulation der beta-Adrenozeptoren im Myokard. Im Gegensatz dazu fanden Iwata et al. wenige Jahre später im gleichen Tiermodell nach 6-monatiger Immunisierung eine linksventrikuläre Hypertrophie bei beta1-ECII-Antikörper-positiven Tieren und eine Downregulation der beta-Rezeptoren. Diese Diskrepanzen ließen das Kaninchenmodell daher als fraglich geeignet erscheinen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit wurde die Lewis-Ratte zur Generierung eines Kardiomyopathiemodells gewählt, da die beta1-ECII-Sequenz bei Ratte und Mensch 100% homolog ist. Zur Immunisierung verwendeten wir ein Fusionsprotein aus GST und der humanen beta1-ECII-Sequenz. Der Schwerpunkt des Vorhabens lag auf der Charakterisierung der durch die Immunisierung induzierten morphologischen und funktionellen Veränderungen am Herzen der Versuchstiere. Echokardiographisch konnte bei immunisierten Tieren bereits nach 9 Monaten eine linksventrikuläre Erweiterung nachgewiesen werden, die sich nach 12 bzw. 15 Immunisierungsmonaten durch das Auftreten einer progredienten linksventrikulären Dysfunktion (Echokardiographie/Herzkatheteruntersuchung) auch funktionell manifestierte. Makroskopisch-morphometrisch ließ sich an Paraffinschnitten eine Erweiterung des linken Ventrikels bei relativer Abnahme der Wanddicke nachweisen und bestätigte somit histologisch die echokardiographischen Messungen. Die mikroskopische Analyse zeigte eine relative Vergrößerung der Kardiomyozytenkerne ohne signifikante Zellhypertrophie. Durch Radioligandenbindungsversuche konnte zudem in beta1-ECII-immunisierten Tieren eine Downregulation der kardialen beta1-Rezeptoren nachgewiesen werden. Durch die Immunisierung mit beta1-ECII-Antigen konnte der Phänotyp einer DCM somit erstmals in der Ratte induziert werden. Dieser Phänotyp ist vermutlich überwiegend auf die agonist-ähnliche funktionelle Aktivität der durch spezifische Immunisierung induzierten beta1-Rezeptorantikörper zurückzuführen. Das vorgestellte Tiermodell erfüllt dabei einerseits die immunologischen Kriterien des 1. Koch’schen Postulats für den „indirekten“ Nachweis einer Kardiomyopathieinduktion durch Antikörper, die gegen die zweite extrazelluläre Domäne des b1-adrenergen Rezeptors gerichtet sind. Andererseits lieferte es im Anschluss auch die direkte Evidenz für eine kausale Rolle solcher Antikörper bei der Induktion einer Autoimmunkardiomyopathie durch den Transfer induzierter Antikörper auf genetisch identische, herzgesunde Ratten (Nachahmen von Rezeptor-Autoantikörpern). Zukünftig könnte dieses Tiermodell auch dazu dienen, weitere immunologische Faktoren, die an der Entwicklung einer Autoimmunkardiomyopathie durch beta1-Rezeptor-antikörper beteiligt sind, zu untersuchen. Ferner können mit diesem Modell neue therapeutische Ansätze für die Behandlung der Rezeptorantikörper-positiven Kardiomyopathie entwickelt werden, mit dem Ziel einer späteren Anwendung im Tiermodell erprobter Strategien auch bei Antikörper-positiven Patienten. / About 20 years ago antibodies binding to the beta1-adrenergic receptor have been described in Chagas disease. In following decades different authors were able to prove, that these beta-1-adrenergic receptor antibodies are prevalent especially in patients with dilated cardiomyopathy (DCM) in 30 to 95%, depending on the proving method. Especially antibodies directed against the second extracellular loop of the beta-1-receptor (beta1-ECII) seemed to be able to modulate and to activate the receptor. In the past years the second extracellular loop could be identified as a potent (auto-)antigen containing T- and B-cell epitopes. Clinical studies in DCM-patients associated a significant poorer left ventricular function, a higher prevalence of serious ventricular arrhythmias and a higher cardiovascular mortality with the presence of anti-beta1-ECII-antibodies. In the following it was necessary to develop sufficient animal model proving that the presence of these antibodies might not be a side effect and furthermore to prove that these antibodies might causal in developing a DCM. In 1997 Matsui et al. could show a biventricular dilatation and a up-regulation of beta1-receptors in the myocard using rabbits immunised over 12 months with a synthetic peptides corresponding to beta1-ECII. Using the same animal model few years later Iwata et al. recognized a left-ventricular hypertrophy after 6 months of immunisation and a downregulation of beta-receptors. Actually it is not sure, if this animal model might be sufficient to answer question for the causal role of beta1-receptor-antibodies. Therefore, in the present sudy we attempted to create experimental immune-cardiomyopathy in the rat using human beta1-ECII (100% sequence identity human/rat) fused to bacterial GST as an antigen. The main aspect in our study was to characterize the different morphological und functional findings in the rat heart. Compared with the control animals, echocardiographic follow-up revealed significant left ventricular dilatation from the ninth study-month on, which slowly and steadily progressed in the course of the study. The final echocardiographic findings were furthermore supported by left ventricular pressure curves obtained in the left heart catheterization at study end (fifteenth month). The anatomic measurements, performed in hematoxylin an eosin-stained paraffin sections, showed a left ventricular dilatation and a relative increase in left ventricular wall-thickness which furthermore emphasized the echocardiographic results. Histomorphological analysis revealed significantly enlarged polymorphous nuclei, but not a cardiomyocyte-hypertrophy. The radioligand-binding studies showed a down-regulation of the beta1-adrenergic receptor in the cardiomyocyte membrane. We were able to show the first time the phenotype of DCM in the rat by immunization against the second extracellular loop of the beta1-adrenoceptor. It seems conceivable that the generated cardiomyopathic phenotype has to be attributed mainly to the sustained sympathomimetic activity of the produced activating anti-beta1-ECII-antibodies. Our animal model fulfills the first Witebsky postulate for autoimmune disease (indirect evidence) including antibodies against an identified corresponding (auto-)antigen. Furthermore it is the basis for the direct evidence proving a causal role of these beta1-ECII-antibodies in developing a autoimmune cardiomyopathy by transferring induced antibodies on healthy animals of the same strain. In the future this animal model might be used to detect further immunological elements that might be causal to develop a autoimmune cardiomyopathy associated with the evidence of beta1-adrenoceptor-antibodies. Furthermore this animal model might be useful to develop new strategies in the treatment of the beta1-adrenoceptor-positive DCM.

Functionally active (conformational) autoantibodies directed against the β1-adrenergic receptor (β1-AR) are supposed to have a pathogenic relevance in human heart failure, particularly in idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). Prevalence of anti-β1-autoantibodies (anti-β1-aabs) in the healthy population is almost negligible, whereas it amounts to up to 30% in heart failure patients with idiopathic DCM. As β1-ARs are not restricted to the heart and are also highly expressed in particular segments of the nephron, it is conceivable that such autoantibodies might also affect kidney function to some extent through the activation of renal β1-ARs. In the kidney, β1-ARs are highly abundant in the juxtaglomerular apparatus, the distal convoluted tubules, the collecting duct, and the renal arteries. However, the functional significance of β1-ARs at these particular sites along the nephron is poorly understood, as are the effects of conformational stimulating anti-β1-aabs on renal β1-ARs. From the available literature, it is well known that the β1-adrenergic system is involved in, e.g., the regulation of renin-secretion from juxtaglomerular cells. In addition, the β1-adrenergic system is thought to be involved in the regulation of the urine pH via type B-intercalated cells in the collecting duct. In contrast, the regulation of salt- and fluid-secretion in the medullary collecting duct appears to occur independently from the SNS. As a consequence, the present work aimed to unravel the potential pathophysiological links between renal function, alterations in the cardiovascular system, and circulating agonist-like anti- β1-abs. We analyzed possible renal effects of anti-β1-abs in a human-analogous rat model. After immunization with a GST-fusion protein containing the second extracellular loop (β1-ECII) of the human β1-AR, Lewis-rats develop functionally active, stimulating, conformational anti-β1-ECII-abs. Within the first 6 months, anti-β1-ECII-ab-positive animals develop a hypertensive phenotype, which after 9 months evolves into a DCM phenotype. In n=40 GST/ β1-ECII-immunized Lewis rats and n=40 age-matched, 0.9% NaCl-injected control animals, we sequentially (i.e. at months 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15, and 18 after start of immunization) analyzed the changes in renal function on a molecular, functional, and structural level. We could show that the presence of stimulating anti-β1-ECII-abs – even though having detrimental effects on the heart – has only a minor impact on kidney function and structure. Within the first 3 months after induction of anti-β1-ECII-abs, the levels and activity of renin were significantly increased in immunized compared to corresponding control animals, which was confirmed by experiments on isolated perfused kidneys, in which anti-β1-ECII-abs were able to directly induce the liberation of renin. However, within several weeks the initial anti-β1-ECII-ab-mediated RAAS activation was counter-regulated by auto-regulatory mechanisms activated in the kidney. Similarly, glomerular filtration rate (GFR) and renal blood flow (RBF) were initially decreased in the presence of the stimulating anti-β1-ECII-abs, but returned to control values within 3 months after immunization of the animals. Although expression of several pro-fibrotic markers was significantly up-regulated in anti-β1-ECII-ab-positive rats, no significant differences were noted on a histomorphological level with regard to the occurrence of renal fibrosis, glomerular damage, tubular damage, and perivascular fibrosis. Only a mild decrease in glomerular filtration function was observed in the kidneys of anti-β1-ECII-ab-positive animals from immunization-month 12 on, apparent by increased levels of urinary protein. Even though anti-β1-ECII-abs were able to induce mild changes in renal function, their effects were not strong enough to critically damage the kidneys in our rat-model. Differences between immunized anti-β1-ECII-ab-positive and corresponding control rats at later time-points (that is, from immunization-month 12 on) are most likely secondary to the progressive heart failure phenotype that immunized animals develop in the course of the experiment. The present study is the first to focus on the effects of stimulating anti-β1-ECII-abs on the kidney, and on the prevalence of these effects for the heart (referred to as cardio-renal crosstalk). Although our results were obtained in a rat model, they might contribute to better understand the situation in anti-β1-AR-aab-positive human patients. Following the results of our experiments, treatment of such patients should focus on direct and specific neutralization/elimination of stimulating anti-β1-ECII-aab or at least comprise therapeutic strategies that counteract the anti-β1-ECII-aab-effects on the heart by standard treatment for heart failure (i.e. ACE inhibitors, AT1-receptor blockers, and β-blockers) according to current guidelines. / Funktionell aktive, konformationelle Autoantikörper, die gegen den β1-adrenergen Rezeptor (β1-AR) gerichtet sind, sind vermutlich pathologisch relevant bei Herzinsuffizienz, insbesondere bei der idiopathischen Dilativen Kardiomyopathie (DCM). Die Prävalenz solcher Antikörper ist in der gesunden Population vernachlässigbar, wohingegen sie bei der idiopathischen DCM 30% erreicht. Da β1-AR nicht nur im Herzen, sondern auch in der Niere stark exprimiert werden, ist naheliegend, dass solche Antikörper über eine Stimulation renaler β1-AR auch die Nierenfunktion beeinflussen können. In der Niere werden β1-AR überwiegend im juxtaglomerulären Apparat, im distalen Tubulus, in den Sammelrohren und in den renalen Arterien exprimiert. Die Bedeutung der in diesen Bereichen hohen Expression von β1-AR für die Nierenfunktion ist noch nicht vollständig geklärt, ebenso wie die renalen Effekte von stimulierenden β1-AR-Antikörpern. Aus der Literatur ist bekannt, dass das β1-adrenerge System unter anderem an der Renin-Sekretion der juxtaglomerulären Zellen beteiligt ist. Außerdem wird vermutet, dass das β1-adrenerge System in die Regulation des pH-Wertes des Urins über die Typ B-interkalierenden Zellen des Sammelrohrs eingreift, wohingegen die Regulation der Salz- und Wasserexkretion im medullären Sammelrohr wahrscheinlich unabhängig vom sympathischen Nervensystem abläuft. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab, die potentiellen pathophysiologischen Zusammenhänge zwischen renaler Funktion, Änderungen innerhalb des kardiovaskulären Systems und zirkulierenden, agonist-ähnlichen anti-β1-Autoantikörpern darzustellen. Wir haben die möglichen renalen Effekte der anti-β1-AK in einem human-ähnlichen Ratten-Modell untersucht. Nach Immunisierung mit einem GST-Fusionsprotein, welches den zweiten extrazellulären Loop des β1-AR beinhaltet, entwickeln Lewis-Ratten funktionell aktive, stimulierende Antikörper gegen β1-ECII. Anti-β1-ECII-AK-positive Tiere entwickeln nach ca. 6 Monaten einen hypertensiven Phänotyp, welcher nach 9 Monaten in einen DCM Phänotyp übergeht. Wir haben Änderungen der renalen Funktion auf molekularer, funktioneller, und struktureller Ebene in n=40 GST/ β1-ECII-immunisierten Lewis-Ratten und n=40 altersgleichen 0.9% NaCl-injizierten Kontrolltieren sequenziell (d.h. 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 und 18 Monate nach Beginn der Immunisierung) analysiert. Wir konnten zeigen, dass die stimulierenden anti-β1-ECII-Antikörper – obwohl sie eine schädigende Wirkung auf das Herz haben – die Nierenfunktion und -Struktur nur gering beeinflussen. In den ersten Monaten nach Induktion der anti-β1-ECII-AK stieg die Reninkonzentration und -aktivität in den immunisierten Tieren im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen signifikant an. Dieses Ergebnis konnte im Model der isolierten perfundierten Niere bestätigen werden, in dem anti-β1-ECII-AK eine direkte Freisetzung von Renin induzierten. Diese frühe AK-vermittelte Aktivierung des RAAS wurde jedoch innerhalb weniger Wochen durch autoregulatorische Mechanismen der Niere aufgehoben. Ebenso waren anfangs die glomeruläre Filtrationsrate und der renale Blutfluss in anti-β1-ECII-AK-positiven Ratten vermindert, kehrten jedoch nach 3 Monaten zu den Werten der Kontrolltiere zurück. Obwohl die Expression mehrerer pro-fibrotischer Marker signifikant erhöht war, konnten keine signifikanten Veränderungen auf histomorphologischer Ebene hinsichtlich des Auftretens renaler Fibrose, glomerulärer und tubulärer Schädigung, oder perivaskulärer Fibrose festgestellt werden. Lediglich die glomeruläre Filtrationsfunktion war ab dem 12. Immunisierungsmonat zunehmend beeinträchtigt, was sich an einer progredienten Proteinurie zeigte. Obwohl anti-β1-ECII-AK durchaus einen gewissen Effekt auf die Nierenfunktion haben, ist ihr Einfluss nicht stark genug um die Niere kritisch zu schädigen. Unterschiede zwischen immunisierten und Kontrolltieren, welche zu späteren Zeitpunkten (d.h. ab dem 12. Immunisierungsmonat) auftreten, sind wahrscheinlich sekundäre Effekte der progredienten Herzinsuffizienz, die die immunisierten Tiere im Verlauf des Experiments entwickeln. Unsere Studie ist die Erste, die sich mit den Effekten von stimulierenden anti-β1-AK auf die Niere und ihre Zusammenhänge mit der antikörper-induzierten Herzinsuffizienz (dem sogenannten kardio-renalen „Crosstalk“) befasst. Obwohl unsere Ergebnisse in einem Tiermodell erzielt wurden, könnten sie von großem Nutzen sein, um die Krankheitsentwicklung von anti-β1-Autoantikörper-positiven Patienten besser zu verstehen. Unseren Ergebnissen zufolge sollte die Behandlung von Autoimmun-DCM auf eine möglichst direkte und spezifische Neutralisierung/Eliminierung von anti-β1-Autoantikörpern abzielen und gleichzeitig alle kardio- und renal-protektiven Elemente der Standard-Therapie der Herzinsuffizienz (d.h. Gabe von ACE-Hemmern, AT1-Rezeptor-Inhibitoren und β-Blockern) einschließen.

Die ETiCS-Studie (Etiology, Titre-Course, and effect on Survival) ist die bisher größte prospektive europäische Studie, die Ursachen und Entstehungsmechanismen kardialer Autoimmunphänomene untersucht. Ziel dieser Dissertation war die umfassende Charakterisierung der beiden prospektiven ETiCS-Kollektive sowie der Vergleich ihrer demographischen, klinischen, laborchemischen und apparativen Charakteristika zum Zeitpunkt des Studieneinschlusses. Die prospektive ETiCS-Studie umfasste im FAMI-Kollektiv (erster akuter Myokardinfarkt) insgesamt n=180 Patienten und im AMitis-Kollektiv (erste akute Myokarditis) n=96 Patienten. Die demographischen Daten, das kardiovaskuläre Risikoprofil sowie die klinische Symptomatik unserer Patienten entsprachen im Wesentlichen den in der Literatur bereits beschriebenen ähnlichen Vergleichskollektiven, mit dem interessanten Unterschied, dass unsere Infarkt-Patienten deutlich jünger waren (57 ± 8 Jahre), als der Durchschnittspatient mit erstmaligem Myokardinfarkt. Als Schlussfolgerung dieser Arbeit für die klinische Praxis lässt sich durch akribische Erhebung der Anamnese und des kardiovaskulären Risikoprofils eines Patienten mit unklaren kardialen Beschwerden mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit ein akuter Myokardinfarkt oder eine akute Myokarditis vorhersagen. Das führende klinische Symptom ist mit Thoraxschmerz und Dyspnoe bei beiden Krankheitsbildern recht ähnlich, jedoch sollte bei führender Belastungsdyspnoe und zeitgleich typischen Nebenkriterien (Fieber, Palpitationen, Infektanamnese) primär an eine Myokarditis gedacht werden. Anhand der Ischämiemarker ist der Ausschluss einer akuten Myokardischämie oder einer akuten Herzmuskelentzündung zwar mit großer Sicherheit möglich, bei erhöhten Werten muss jedoch für eine weitere Differenzierung auch die Klinik, die EKG-Diagnostik und die Echokardiographie mit betrachtet werden. Auch bei nicht eindeutigem EKG-Befund sollte die Indikation zur Koronarangiographie nur in Zusammenschau der genannten Befunde gestellt werden. Sobald sich jedoch der Verdacht auf ein akutes Infarktgeschehen erhärtet, sollte ohne Zeitverzögerung eine invasive Diagnostik erfolgen. / The ETiCS study (Etiology, Titre-Course, and effect on Survival) is the largest prospective European study to date to investigate the causes and mechanisms of cardiac autoimmune phenomena. The aim of this dissertation was the comprehensive characterization of the two prospective ETiCS collectives and the comparison of their demographic, clinical, laboratory and instrumental characteristics at the time of study inclusion. The prospective ETiCS study included n=180 patients in the FAMI (first acute myocardial infarction) and n=96 patients in the AMitis (first acute myocarditis) group. The demographic data, cardiovascular risk profile, and clinical symptoms of our patients were broadly similar to those of the other collectives described in the literature, with the interesting difference that our infarction patients were significantly younger (57 ± 8 years) than the average patient with first myocardial infarction. As a conclusion of this work for clinical practice, meticulous evaluation of the medical history and cardiovascular risk profile of a patient with unclear cardiac symptoms allows to predict with a certain probability an acute myocardial infarction or acute myocarditis. The leading clinical symptom is quite similar with chest pain and dyspnea, but in case of leading exercise dyspnea and at the same time typical secondary criteria (fever, palpitations, history of infection) myocarditis should be considered primarily. Although laboratory markers allow the exclusion of acute myocardial ischemia or acute myocarditis with a high degree of certainty, in the case of elevated values, clinical presentation, ECG diagnostic and echocardiography must also be considered for further differentiation. Even if the ECG findings are inconclusive, the indication for coronary angiography should only be made in conjunction with the above-mentioned findings. However, as soon as the suspicion of an acute infarction is confirmed, invasive diagnostics should be performed without delay.

Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. / Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte.

Die Funktionalität β1- und β2-adrenerger Rezeptoren wird durch Polymorphismen in ihrer kodierenden Region moduliert. Wir haben uns die Technik des Fluoreszenz-Resonanz- Energie-Transfers (FRET) zu Nutze gemacht, um den Einfluss der am häufigsten vorkommenden Polymorphismen (Ser49Gly und Gly389Arg im β1AR, Arg16Gly und Gln27Glu im β2AR) auf die Rezeptorkonformation nach Aktivierung zu untersuchen. Dafür wurden FRET-Sensoren für die beiden βAR-Subtypen mit einem gelb-fluoreszierenden Protein (YFP) sowie einem cyan-fluoreszierenden Protein (CFP oder Cerulean) in der dritten intrazellulären Schleife bzw. am C-Terminus verwendet. Nach Stimulierung der βARSensoren konnte die Aktivierung der polymorphen Rezeptorvarianten in lebenden Zellen in Echtzeit untersucht werden. Dabei behielten die FRET-Sensoren sowohl die Bindungsaffinitäten der nativen Rezeptoren als auch eine intakte Funktionalität hinsichtlich der Bildung von sekundären Botenstoffen. Der Vergleich der Aktivierungskinetiken der verschieden polymorphen Varianten des β1AR und β2AR ergab keine signifikanten Unterschiede nach einer einmaligen Stimulation. Es zeigte sich jedoch, dass Rezeptorpolymorphismen die Aktivierungskinetik vorstimulierter βAR erheblich beeinflussen. So konnten wir im Vergleich zur ersten Aktivierung eine schnellere Aktivierung der Gly16-Varianten des β2AR sowie des Gly49Arg389-β1AR feststellen, während die Arg16-β2AR-Variante und der Ser49Gly389-β1AR dagegen bei einer wiederholten Stimulation langsamer aktiviert wurden. Diese Ergebnisse lassen auf ein "Rezeptorgedächtnis" schließen, das spezifisch für bestimmte polymorphe Rezeptorvarianten ist und eine βAR-Subtyp-spezische Ausprägung zeigt. Die Ausbildung der unterschiedlichen Aktivierungskinetiken hing von der Interaktion des Rezeptors mit löslichen intrazellulären Faktoren ab und bedurfte einer Phosphorylierung intrazellulärer Serin- und Threonin-Reste durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen. Die Interaktion mit löslichen intrazellulären Faktoren scheint für den β1AR weniger stark ausgeprägt zu sein als für den β2AR. Die cAMP-Produktion war für die schneller werdenden, “hyperfunktionellen” Gly16-β2ARVarianten signifikant um mehr als 50% höher im Vergleich zur “hypofunktionellen” Arg16- Variante. Die unterschiedliche Funktionalität spiegelte sich im Therapieausgang bei Tokoysepatientinnen wider, dessen Erfolg mit dem Arg16Gly Polymorphismus verknüpft war. Die Daten implizieren eine intrinsische, polymorphismusabhängige Eigenschaft der βAR, die die Aktivierungskinetik der Rezeptoren bei wiederholten Stimulationen determiniert. Diese könnte auch für die zwischen Individuen variierende Ansprechbarkeit auf β-Agonisten und β-Blocker mitverantwortlich sein. / Signaling through G protein-coupled receptors is known to be influenced by receptor polymorphisms, yet the molecular basis for the functional differences is unclear. To investigate the impact of the most frequent polymorphic sites of the β1- and the β2– adrenergic receptor (Ser49Gly and Gly389Arg for β1AR, Arg16Gly and Gln27Glu for β2AR) on receptor conformation we used a fluorescence resonance energy transfer (FRET) based approach. We made use of βAR-FRET sensors with a yellow fluorescent protein (YFP) inserted into the third intracellular loop and a cyan fluorescent protein (CFP or Cerulean) fused to the C-terminal tail of the βAR. These sensors retained key pharmacological and functional characteristics of the native receptors. Upon stimulation of the sensors we determined the activation characteristics of the polymorphic receptors in real time and in living cells and found that βAR respond to repeated activation with a change of their activation kinetics during subsequent stimulations. This phenomenon differed between polymorphic variants of the βAR. The “hyperfunctional” Gly16-β2AR variants as well as the Gly49Arg389-β1AR became faster in their activation kinetics, while the “hypofunctional” Arg16-β2AR and the Ser49Gly389-β1AR became slower compared to their initial activation. These differences depended on the interaction with soluble cytosolic factors that occurred after the initial activation, and on the phosphorylation of agonist-bound receptors through G protein-coupled receptor kinases. The “memory“ of previous activation is formed already after a first stimulation of only five seconds, whereas the β1AR memory necessitates prestimulation for five minutes and seems to be based on a less stable interaction with intracellular proteins compared to the β2AR. Assuming short-lived and repetitive receptor-ligand interaction under native conditions, we hypothesized that faster activation during single ligand-receptor interaction represents the basis for more effective signaling to downstream effectors. Indeed, the extent of cAMP formation was enhanced by 50% upon stimulation of the Gly16-β2AR compared to the Arg16 variant. The different functionality reflected the outcome of tocolysis treatment with the β2-agonist fenoterol whose success correlated with the Arg16Gly genotype of the patients. Our findings suggest an intrinsic, polymorphism-specific property of the βAR that alters activation kinetics upon continued stimulation and that might account for individual drug responses.