Univ., Diss., 2006--Giessen

University, Diss., 2006--Giessen.

Chronische Aktivierung von b-Adrenorezeptoren (b-ARs) durch Katecholamine ist ein Stimulus für kardiale Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Ebenso führt die Expression von b1-ARs oder Gas-Proteinen in genetisch modifizierten Mäusen zu Hypertrophie und Herzinsuffizienz. Allerdings führt die direkte Aktivierung dem Gas nachgeschalteten Komponenten des b-adrenergen Signalwegs wie z.B. die Aktivierung der Adenylylcyclase (AC) oder der Proteinkinase A (PKA) nicht im signifikanten Ausmaß zur Herzhypertrophie. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zusätzlich zu dem klassischen Signalweg, auch weitere durch Gas-Proteine aktivierte Komponenten in die b-adrenerg vermittelte Hypertrophieentwicklung involviert sind. Interessanterweise wurde vor kurzem ein hypertropher Signalweg beschrieben, der eine direkte Involvierung von Gbg-Untereinheiten bei der Induktion von Herzhypertrophie durch die extrazellulär-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) zeigt: Nach Aktivierung Gaq-gekoppelter Rezeptoren binden Gbg-Untereinheiten an die aktivierte Raf/Mek/Erk Kaskade. Die Bindung der freigesetzten Gbg-Untereinheiten an Erk1/2 führt zu einer Autophosphorylierung von Erk1/2 an Threonin 188 (bzw. Thr208 in Erk1; im folgenden ErkThr188-Phosphorylierung genannt), welche für die Vermittlung kardialer Hypertrophie verantwortlich ist. In dieser Arbeit konnte nun gezeigt werden, dass auch die Aktivierung von b-ARs in Mäusen sowie von isolierten Kardiomyozyten zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung führt. Darüberhinaus führte die Überexpression von Erk2 Mutanten (Erk2T188S und Erk2T188A), die nicht an Threonin 188 phosphoryliert werden können, zu einer deutlich reduzierten Hypertrophieantwort von Kardiomyozyten auf Isoproterenol. Auch die kardiale Expression der Erk2T188S Mutante im Mäusen verminderte die Hypertrophieantwort auf eine 2-wöchige Isoproterenol-Behandlung deutlich: Die linksventrikuläre Wanddicke, aber auch interstitielle Fibrose und Herzinsuffizienzmarker wie z.B. BNP waren signifikant reduziert. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass tatsächlich ein Zusammenspiel von Ga und Gbg-vermittelten Signalen zur Induktion von ErkThr188-Phosphorylierung und damit zur Induktion von b-adrenerg vermittelter Hypertrophie notwendig ist. Während die Hemmung von Gbg-Signalen mit dem C-Terminus der GRK2 oder die Hemmung von Adenylylzyklase eine ErkThr188-Phosphorylierung und eine Hypertrophieantwort nach Isoprenalingabe effektiv reduzierten, führt die alleinige Aktivierung von Adenylylzyklase nicht zu einer Hypertrophieantwort. Diese Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer möglicher therapeutischen Strategien zur Therapie b-adrenerg induzierter Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz helfen. / b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart.

Universiẗat, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2005.

Universiẗat, Diss., 2007--Giessen.

Univ., Diss., 2006--Frankfurt (Main)

Die idiopathische dilatative Kardiomyopathie ist eine eher seltene Herzerkrankung (Inzidenz 8/100.000 Einwohner pro Jahr), jedoch eine der häufigsten Ursache für die Entstehung einer Herzinsuffizienz bei jüngeren Patienten und geht immer mit Veränderungen sowohl des humoralen als auch des zellulären Immunsystems einher. Die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegende ETiCS-Studie untersucht besonders die Rolle von 1-adrenergen Autoantikörpern bei der Ausbildung und Entwicklung einer Herzinsuffizienz sowie deren Einfluss auf den Verlauf der kardialen Pumpfunktion nach einem ersten akuten Myokardinfarkt (FAMI) oder einer ersten Episode einer akuten Myokarditis (AMitis). Nach Studieneinschluss wurden diese beiden klar definierten Patientenkollektive über einen Zeitraum von 12 Monaten beobachtet. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der Verlauf der mittels MRT erhobenen kardialen Funktionsdaten (LVEF, EDV, ESV, SV, HI und LV-Masse, Baseline und 12 Monats-Follow Up) und ihr Zusammenhang mit Biomarkern der Herzschädigung (CK/CK-MB) sowie der Ausbildung/dem Verlauf von 1-Autoantikörpern. FAMI-Patienten wiesen innerhalb eines Jahres grundsätzlich eine Verbesserung der kardialen Pumpfunktion auf; Patienten mit erstem Hinterwandinfarkt zeigten im Vergleich zu Vorderwandinfarkt-Patienten bei generell besseren Ausgangswerten auch im Verlauf deutlich geringere Funktions- und Volumenänderungen. Patienten mit kleineren Myokardinfarkten (CK Werte <1000 U/l) zeigten, unabhängig von der Lokalisation, eine bessere Erholung der LV-Funktion, als Patienten mit größeren Herzinfarkten (CK Werte >1000 U/l). Bei den im Rahmen dieser Arbeit analysierten Infarktpatienten konnte allerdings kein wesentlicher Einfluss einer Ausbildung oder Gegenwart von herzspezifischen Autoantikörpern auf die Entwicklung der kardialen Pumpfunktion nachgewiesen werden. AMitis-Patienten wiesen innerhalb eines Jahres ebenso grundsätzlich eine Verbesserung der kardialen Pumpfunktion auf; In dieser Patienten-Kohorte scheint die mittel- und langfristige Entwicklung der kardialen Funktionsparameter jedoch stark von der Ausbildung 1-adrenerger Autoantikörper beeinflusst zu sein: Antikörper-negative AMitis-Patienten zeigten zu jedem Beobachtungszeitpunkt deutlich bessere kardiale Funktionsparameter als Antikörper-positiv getestete AMitis-Patienten. Dies bestätigt die initiale Hypothese der ETiCS-Studie und muss durch die abschließende Analyse aller ETiCS-Studienpatienten (erwartet 2019) noch bestätigt werden. Den Nachweis von 1-adrenergen Autoantikörpern in die Routine-Labordiagnostik einzuführen, erscheint aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zumindest bei Myokarditispatienten sinnvoll. Bei einem Herzinfarkt sprechen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit jedoch nicht für einen Mehrwert eines routinemäßigen 1-Autoantikörper-Screenings. / Idiopathic dilated cardiomyopathy is a relatively rare heart disease (with an incidence of 8/100.000 inhabitants per year), but is one of the most often causes of heart failure in younger adults and is known to be associated with changes in both the humoral and the cellular immune system. The here presented ETiCS-study addressed the role of 1-adrenoceptor autoantibodies in the development of heart failure and their influence on the course of cardiac function and remodeling after a first acute myocardial infarction (FAMI) or a first event of an acute myocarditis (AMitis). After inclusion into the study, these two well defined patient-cohorts were regularly followed for 12 months. The focus of the present doctoral thesis was to analyze the cardiac MRI functional data (LVEF, EDV, ESV, SV, CI and LV-mass, determined at baseline and after 12 months) and to relate them to biomarkers of cardiac damage (CK / CK-MB) and to the development/presence of 1-adrenoceptor autoantibodies. FAMI-patients within one year of follow-up showed a general improvement in cardiac pump function; however, patients with posterior myocardial infarction in general had a better cardiac performance at baseline and developed less functional and volume changes compared to patients with an anterior myocardial infarction. Patients with smaller myocardial infarctions (CK levels <1000 U/l) had a better recovery of LV function, regardless of the location, than patients with a larger myocardial infarction (CK levels >1000 U/l). In this study-cohort the development or presence of heart-directed autoantibodies (as 1-adrenergic autoantibodies) did not significantly influence the development (recovery or progression of heart failure) of cardiac functional parameters and performance. AMitis-patients within one year of follow-up equally showed a general improvement in cardiac pump function; however, in this cohort the development of cardiac functional parameters appeared to be dependent on the development/presence of 1-adrenoceptor autoantibodies: Antibody-negative AMitis-patients had significantly better functional LV-parameters than antibody-positive AMitis-patients at each follow-up. This finding is in agreement with the initial hypothesis of the ETiCS-study and is still to be confirmed by the final analysis of the data from all patients included into the ETiCS-study. Based on the preliminary data of the present thesis it appears justified to implement a screening for 1-adrenoceptor autoantibodies into routine laboratory diagnostics, at least in myocarditis patients. In acute myocardial infarction, the results of this work do not support an added value of routine autoantibody screening, however.

Dilated cardiomyopathy (DCM) represents an important subgroup of patients suffering from heart failure. The disease is supposed to be associated with autoimmune mechanisms in about one third of the cases. In the latter patients functionally active conformational autoantibodies directed against the second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (AR, β1ECII-aabs) have been detected. Such antibodies chronically stimulate the β1-AR thereby inducing the adrenergic signaling cascade in cardiomyocytes, which, in the long run, contributes to heart failure progression. We analyzed the production of cAMP after aab-mediated β1-AR activation in vitro using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay. This assay is based on HEK293 cells stably expressing human β1-AR as well as the cAMP-sensor Epac1-camps. The assay showed a concentration-dependent increase in intracellular cAMP upon stimulation with the full agonist (-) isoproterenol. This response was comparable to results obtained in isolated adult murine cardiomyocytes and was partially blockable by a selective β1-AR antagonist. In the same assay poly- and monoclonal anti-β1ECII-abs (induced in different animals) could activate the adrenergic signaling cascade, whereas isotypic control abs had no effect on intracellular cAMP levels. Using the same method, we were able to detect functionally activating aabs in the serum of heart failure patients with ischemic and hypertensive heart disease as well as patients with DCM, but not in sera of healthy control subjects. In patients with DCM we observed an inverse correlation between the stimulatory potential of anti-β1-aabs and left ventricular pump function. To adopt this assay for the detection of functionally activating anti-β1ECII-aabs in clinical routine we attempted to establish an automated large-scale approach. Neither flow cytometry nor FRET detection with a fluorescence plate reader provided an acceptable signal-to-noise ratio. It was possible to detect (-) isoproterenol in a concentration-dependent manner using two different FRET multiwell microscopes. However, due to focus problems large-scale detection of activating anti-β1ECII-abs could not be implemented. Neutralization of anti-β1-aabs with the corresponding epitope-mimicking peptides is a possible therapeutic approach to treat aab-associated autoimmune DCM. Using our FRET assay we could demonstrate a reduction in the stimulatory potential of anti-β1ECII-abs after in vitro incubation with β1ECII-mimicking peptides. Cyclic (and to a lesser extent linear) peptides in 40-fold molar excess acted as efficient ab-scavengers in vitro. Intravenously injected cyclic peptides in a rat model of DCM also neutralized functionally active anti-β1ECII-abs efficiently in vivo. For a detailed analysis of the receptor-epitope targeted by anti-β1ECII-abs we used sequentially alanine-mutated β1ECII-mimicking cyclic peptides. Our data revealed that the disulfide bridge between the cysteine residues C209 and C215 of the human β1-AR appears essential for the formation of the ab-epitope. Substitution of further amino acids relevant for ab-binding in the cyclic scavenger peptide by alanine reduced its affinity to the ab and the receptor-activating potential was blocked less efficiently. In contrast, the non-mutant cyclic peptide almost completely blocked ab-induced receptor activation. Using this ala-scan approach we were able to identify a “NDPK”-epitope as essential for ab binding to the β1ECII. In summary, neutralization of conformational activating anti-β1ECII-(a)abs by cyclic peptides is a plausible therapeutic concept in heart failure that should be further exploited based on the here presented data. / Dilatative Kardiomyopathie (DCM) stellt eine wichtige Subgruppe von Patienten mit Herzinsuffizienz dar und ist vermutlich in etwa einem Drittel der Fälle mit einem Autoimmunmechanismus assoziiert. In diesen Patienten konnten funktionell aktive konformationelle Autoantikörper gegen die zweite extrazelluläre Schleife des β1-adrenergen Rezeptors (Anti-β1ECII-AAK) nachgewiesen werden. Diese AK stimulieren chronisch den β1-AR und induzieren dadurch die adrenerge Signaltransduktionskaskade in Kardiomyozyten, was, auf lange Sicht, zur Verschlimmerung der Herzinsuffizienz beiträgt. Mittels eines Fluoreszenz-Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays analysierten wir die Bildung von cAMP nach aab-vermittelter β1-AR Aktivierung in vitro. Dieser Assay verwendet HEK293 Zellen, die den humanen β1-AR sowie den cAMP-Sensor Epac1-camps stabil exprimieren. Der Assay zeigte einen konzentrationsabhängigen Anstieg von cAMP bei Stimulation mit dem vollen Agonisten (-) Isoproterenol. Diese Antwort war mit den Ergebnissen an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten vergleichbar und konnte durch einen selektiven β1-AR Antagonist blockiert werden. In verschiedenen Tieren induzierte poly- und monoklonale Anti-β1¬ECII-abs konnten die adrenerge Signalkaskade in dem gleichen FRET Assay aktivieren, wogegen isotypische Kontroll-AK keine intrazellulären cAMP Änderungen herbeiführten. Mit dem gleichen Ansatz konnten wir funktionell aktivierende AAK im Serum von Herzinsuffizienzpatienten mit ischämischer und hypertensiver Herzerkrankung sowie bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie nachweisen, jedoch nicht im Serum von gesunden Kontrollpersonen. Bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie beobachteten wir eine inverse Korrelation zwischen dem stimulierenden Potential der Anti-β1-AAKs und der linksventrikulären Pumpfunktion. Um diesen Assay zur Detektion funktionell aktivierender Anti-β1ECII-aabs in der klinischen Routinediagnostik einzusetzen, versuchten wir ein automatisiertes Hochdurchsatzverfahren zu etablieren. Weder die Durchflusszytometrie noch die FRET Detektion mittels eines Fluoreszenz Plattenlesegeräts wiesen einen akzeptabelen Signal-zu-Rausch-Quotienten auf. Es gelang mit zwei verschiedenen FRET-Multiwell-Mikroskopsystemen die Aktivierung durch (-) isoproterenol konzentrationsabhängig zu detektieren, allerdings war es aufgrund von Fokusproblemen nicht möglich aktivierende Anti- β1¬ECII-AAKs im Hochdurchsatzverfahren zu detektieren. Einen möglichen Therapieansatz zur Behandlung der Anti-β1-AAK-assoziierten autoimmunen DCM stellt die Neutralisierung der AAKs mittels korrespondierender Epitop-imitierender Peptide dar. Wir konnten im FRET Assay eine Reduktion des aktivierenden Effekts von Anti-β1¬ECII-AAKs nach in vitro Inkubation mit β1¬ECII-imitierenden Peptiden nachweisen. Hierbei erwiesen sich zyklische (in geringerem Maß als lineare) Peptide in 40-fachem molarem Überschuss als effektive Antikörper-„Fänger“ in vitro. Eine intravenöse Gabe der Zyklopeptide in einem Rattenmodell der DCM neutralisierte funktionell aktivierende Anti-β1¬ECII-abs ebenfalls effizient in vivo. Zur genaueren Analyse des von Anti-β1¬ECII-AAK gebundenen Rezeptor-Epitops setzten wir sequentiell Alanin-mutierte β1ECII-imitierende Zyklopeptide ein. Unsere Daten zeigten, dass die Disulfidbrücke zwischen den Cysteinresten C209 und C215 des humanen β1¬AR essentiell für die Ausbildung des AAK-Epitops zu sein scheinen. Ein Austausch weiterer AK-bindungsrelevanter Aminosäuren im zyklischen Fängerpeptid durch Alanin verminderte dessen Avidität zum AK und inhibierte dessen Rezeptor-aktivierendes Potential weniger effizient. Im Gegensatz dazu verhinderte das nicht-mutierte Zyklopeptid nahezu vollständig die AK-vermittelte Rezeptoraktivierung. Durch diesen Ala-Scan Ansatz konnten wir ein „NDPK“-Epitop identifizieren, das für die AK-Bindung an β1¬ECII essentiell zu sein scheint. Zusammenfassend ist festzuhalten, dass die Neutralisation von konformationellen aktivierenden Anti-β1¬ECII-(A)AKs durch Zyklopeptide ein viel versprechendes Therapiekonzept bei Herzinsuffizienz darstellt, das im Hinblick auf die hier vorgestellten Daten weiter ausgebaut werden sollte.

Die chronisch obstruktive Bronchitis des Pferdes ist charakterisiert durch Bronchospasmus, Entzündung und Dyskrinie. Der Bronchospasmus wird als Ergebnis der direkten Wirkung von Entzündungsmediatoren und der indirekten Wirkung des autonomen Nervensystems angesehen. Vorkommen und Eigenschaften β-adrenerger und muskarin-cholinerger Rezeptoren im equinen Respirationstrakt wurden bislang nicht umfassend untersucht. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit beide Rezeptorsysteme in drei Segmenten des Respirationstraktes (Lungenparenchym, Bronchial- und Trachealepithel mit der darunter liegenden glatten Muskulatur) von gesunden und an COB erkrankten Pferden mit Hilfe von Radioligandbindungsstudien und Adenylatzyklase- bzw. Phospholipase C-Assay untersucht. Bei gesunden Pferden konnte eine Zunahme der Anzahl β-adrenerger Rezeptoren von den großen Atemwegen bis zum Lungenparenchym festgestellt werden. β-adrenerge Rezeptoren zeigten in Verdrängungsexperimenten mit Agonisten in allen drei Abschnitten einen Anteil hochaffine, an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von ca. 35 %. In allen drei Segmenten konnten die Subtypen β1 und β2 im Verhältnis von 20:80 % nachgewiesen werden. Die Dominanz des β2-Subtypes konnte außerdem durch die für den β2-Subtyp charakteristische Reihenfolge der pharmakologischen Wirkungsstärke von Agonisten ((-)-Isoprenalin > (-)- 102 Zusammenfassung Adrenalin > (-)-Noradrenalin) bestätigt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass β-adrenerge Rezeptoren in Membranpräparationen der drei Segmente in der Lage waren das Adenylatzyklase-System zu aktivieren. Muskarin-cholinerge Rezeptoren zeigten im Gegensatz zu den β-adrenergen Rezeptoren eine Abnahme der Rezeptorzahl von den großen Atemwegen bis zum Lungenparenchym. Der Anteil hochaffiner, an G-Protein gekoppelter muskarin-cholinerger Rezeptoren betrug in allen drei Segmenten ca. 35 %. Im Lungenparenchym wurden sowohl M1- (24-28 %), als auch M2- (. 50 %) und M3-Rezeptoren (. 40 %) nachgewiesen, während in den Atemwegen nur M2- und M3-Rezeptoren im Verhältnis von ungefähr 80:20 % identifiziert wurden. Während M2- Rezeptoren das Adenylatzyklase-System hemmten, aktivierten M1- bzw. M3-Rezeptoren das Enzym Phospholipase C. Bei der COB wurden keine wesentlichen Unterschiede im muskarin-cholinergen System zwischen gesunden und an COB-erkrankten Pferden festgestellt. Es konnte lediglich eine tendenzielle Abnahme der Rezeptordichte im Lungenparenchym festgestellt werden. Im Gegensatz dazu wurde bei COB-Pferden eine signifikante Abnahme der Anzahl β-adrenerger Rezeptoren im Lungenparenchym (333,4 ± 27,1 vs. 496,1 ± 23,4 fmol/mg Protein) und in den Bronchien (90,4 ± 19,0 vs. 155,1 ± 19,6 fmol/mg Protein) beobachtet, wobei beide Subtypen betroffen zu sein scheinen. Die Affinität für ICYP war dabei unverändert. Außerdem war das Vermögen der β-adrenergen Rezeptoren an die α-Untereinheit von G-Proteinen zu koppeln in beiden Segmenten vermindert (Lungenparenchym 24 % vs. 34 %, Bronchien 25 % vs. 34 %). Die Abnahme der Anzahl β-adrenerger Rezeptoren und der reduzierte Anteil hochaffiner Bindungsstellen für Isoprenalin widerspiegelten sich in der verminderten Wirkung von Isoprenalin die Adenylatzyklase zu stimulieren (Lungenparenchym 74,9 vs. 133,7 pmol/mg Protein/min, Bronchien 101,4 vs. 142,0 pmol/mg Protein/min). Das Kopplungsvermögen von Gs-Protein an die Adenylatzyklase bzw. die Aktivität der Adenylatzyklase selbst waren unverändert. An Membranen der Trachea von COB-Pferden konnten weder in der Anzahl, noch im Verhältnis der Subtypen, dem Kopplungsvermögen an Gs-Protein oder der Aktivität der Adenylatzyklase Veränderungen beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass während einer COB die inhibitorische Funktion des β-adrenergen Rezeptor-G-Protein-Adenylatzyklase-Systems vermindert ist, während das exzitatorische muskarin-cholinerge System unverändert bleibt. β-adrenerge Rezeptoren scheinen somit für die Pathophysiologie der COB von Bedeutung sein. Die Abnahme der Rezeptoren könnte auch die z. T. unzureichende Wirkung der Therapie mit β2-Sympathomimetika erklären.

Die chronisch obstruktive Bronchitis des Pferdes ist charakterisiert durch Bronchospasmus, Entzündung und Dyskrinie. Der Bronchospasmus wird als Ergebnis der direkten Wirkung von Entzündungsmediatoren und der indirekten Wirkung des autonomen Nervensystems angesehen. Vorkommen und Eigenschaften β-adrenerger und muskarin-cholinerger Rezeptoren im equinen Respirationstrakt wurden bislang nicht umfassend untersucht. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit beide Rezeptorsysteme in drei Segmenten des Respirationstraktes (Lungenparenchym, Bronchial- und Trachealepithel mit der darunter liegenden glatten Muskulatur) von gesunden und an COB erkrankten Pferden mit Hilfe von Radioligandbindungsstudien und Adenylatzyklase- bzw. Phospholipase C-Assay untersucht. Bei gesunden Pferden konnte eine Zunahme der Anzahl β-adrenerger Rezeptoren von den großen Atemwegen bis zum Lungenparenchym festgestellt werden. β-adrenerge Rezeptoren zeigten in Verdrängungsexperimenten mit Agonisten in allen drei Abschnitten einen Anteil hochaffine, an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von ca. 35 %. In allen drei Segmenten konnten die Subtypen β1 und β2 im Verhältnis von 20:80 % nachgewiesen werden. Die Dominanz des β2-Subtypes konnte außerdem durch die für den β2-Subtyp charakteristische Reihenfolge der pharmakologischen Wirkungsstärke von Agonisten ((-)-Isoprenalin > (-)- 102 Zusammenfassung Adrenalin > (-)-Noradrenalin) bestätigt werden. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass β-adrenerge Rezeptoren in Membranpräparationen der drei Segmente in der Lage waren das Adenylatzyklase-System zu aktivieren. Muskarin-cholinerge Rezeptoren zeigten im Gegensatz zu den β-adrenergen Rezeptoren eine Abnahme der Rezeptorzahl von den großen Atemwegen bis zum Lungenparenchym. Der Anteil hochaffiner, an G-Protein gekoppelter muskarin-cholinerger Rezeptoren betrug in allen drei Segmenten ca. 35 %. Im Lungenparenchym wurden sowohl M1- (24-28 %), als auch M2- (. 50 %) und M3-Rezeptoren (. 40 %) nachgewiesen, während in den Atemwegen nur M2- und M3-Rezeptoren im Verhältnis von ungefähr 80:20 % identifiziert wurden. Während M2- Rezeptoren das Adenylatzyklase-System hemmten, aktivierten M1- bzw. M3-Rezeptoren das Enzym Phospholipase C. Bei der COB wurden keine wesentlichen Unterschiede im muskarin-cholinergen System zwischen gesunden und an COB-erkrankten Pferden festgestellt. Es konnte lediglich eine tendenzielle Abnahme der Rezeptordichte im Lungenparenchym festgestellt werden. Im Gegensatz dazu wurde bei COB-Pferden eine signifikante Abnahme der Anzahl β-adrenerger Rezeptoren im Lungenparenchym (333,4 ± 27,1 vs. 496,1 ± 23,4 fmol/mg Protein) und in den Bronchien (90,4 ± 19,0 vs. 155,1 ± 19,6 fmol/mg Protein) beobachtet, wobei beide Subtypen betroffen zu sein scheinen. Die Affinität für ICYP war dabei unverändert. Außerdem war das Vermögen der β-adrenergen Rezeptoren an die α-Untereinheit von G-Proteinen zu koppeln in beiden Segmenten vermindert (Lungenparenchym 24 % vs. 34 %, Bronchien 25 % vs. 34 %). Die Abnahme der Anzahl β-adrenerger Rezeptoren und der reduzierte Anteil hochaffiner Bindungsstellen für Isoprenalin widerspiegelten sich in der verminderten Wirkung von Isoprenalin die Adenylatzyklase zu stimulieren (Lungenparenchym 74,9 vs. 133,7 pmol/mg Protein/min, Bronchien 101,4 vs. 142,0 pmol/mg Protein/min). Das Kopplungsvermögen von Gs-Protein an die Adenylatzyklase bzw. die Aktivität der Adenylatzyklase selbst waren unverändert. An Membranen der Trachea von COB-Pferden konnten weder in der Anzahl, noch im Verhältnis der Subtypen, dem Kopplungsvermögen an Gs-Protein oder der Aktivität der Adenylatzyklase Veränderungen beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass während einer COB die inhibitorische Funktion des β-adrenergen Rezeptor-G-Protein-Adenylatzyklase-Systems vermindert ist, während das exzitatorische muskarin-cholinerge System unverändert bleibt. β-adrenerge Rezeptoren scheinen somit für die Pathophysiologie der COB von Bedeutung sein. Die Abnahme der Rezeptoren könnte auch die z. T. unzureichende Wirkung der Therapie mit β2-Sympathomimetika erklären.