Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-07-19T18:24:12Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Ferreira, Ana Linda(DISSERTAÇÃO)CCB2009.pdf: 1144954 bytes, checksum: b5eed6f792e3bf8f3955d20456a59951 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-19T18:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Ferreira, Ana Linda(DISSERTAÇÃO)CCB2009.pdf: 1144954 bytes, checksum: b5eed6f792e3bf8f3955d20456a59951 (MD5) Previous issue date: 2009-02-27 / CAPES / A β-Galactosidase de Aspergillus oryzae foi imobilizada covalentemente em Sephadex G-50 revestido com polianilina (Sephadex-PANI), via glutaraldeído e disposta em coluna vertical (2cm x 10 cm). A microscopia eletrônica de varredura e a analise elementar mostrou a superfície rugosa das pérolas do Sephadex alteradas e a presença de nitrogênio respectivamente após o revestimento com PANI. O fluxo da coluna foi testado (0,125-1,25 mL min-1) e 0,8 mL min-1 foi estabelecido como sendo a melhor condição. A atividade da coluna do derivado enzimático (Sephadex-PANI-β-Galactosidase) foi realizada circulando na coluna uma solução de ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG; 3 mL) a um fluxo de 0,8 mL min-1 e o derivado enzimático (Sephadex-PANI-β-Galactosidase) apresentou um pH ótimo (4,5) e temperatura ótima (50 °C) semelhante ao da enzima livre. A quantidade de enzima imobilizada e a retenção específica de atividade enzimática comparada com a enzima solúvel foram 100% e 90%, respectivamente. O derivado enzimático foi reutilizado 10 vezes retendo cerca de 100% da atividade inicial e armazenado por aproximadamente dois anos mantendo 90% da sua atividade. A lactose do leite foi parcialmente convertida em glicose e galactose ao ser circulado na coluna de Sephadex-PANI-β-Galactosidase. Assim, a coluna do derivado enzimático (Sephadex-PANI-β-Galactosidase) pode ser proposta para a remoção contínua de lactose do leite. Futuramente, outras enzimas poderão ser covalentemente imobilizadas em colunas de Sephaedx-PANI e usadas em aplicações biotecnológicas. / β-Galactosidase from Aspergillus oryzae was covalently immobilized onto Sephadex G-50 coated with polyaniline (Sephadex-PANI), via glutaraldehyde, and arranged in a vertical column. The scanning electron microscopy and elemental analyses showed the rugose surface of the Sephadex beads altered and the presence of nitrogen, respectively, after PANI coating. The activity of the Sephadex-PANI-β-Galactosidase column (2cm x 10 cm) was assayed by circulating a solution of ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG; 3 mL) at a flow rate of 0.8 mL min-1 and its optima pH and temperature were found to be 4.5 and 50 °C, respectively, similar to those estimated for the free enzyme. The amount of immobilized protein and retention of specific enzymatic activity compared with the free enzyme were 100% and 90%, respectively. The enzymatic column was reused 10-times retainning about 100% of its initial activity. When stored for almost two years the derivative retained about 90% of its initial activity. Milk lactose was partially converted to glucose and galactose by circulating it through the Sephadex-PANI-β-Galactosidase column. Therefore, column of Sephadex-PANI-β-Galactosidase can be proposed for the continuos remotion of lactose from milk. Furthermore, other enzymes can be covalently immobilized on Sephaedx-PANI column and applied in biotechnology.

Orientador: Helia Harumi Sato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T08:10:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_GiselledeArruda_M.pdf: 925514 bytes, checksum: 300372a4285d7efd417f8a717a850023 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A enzima ß-1,3-glucanase da bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 é capaz de lisar a parede celular de diversas leveduras dentre elas as linhagens de Kluyveromyces sp., produtoras da enzima intracelular ß-galactosidase. Este trabalho visou a produção de ß-1,3-glucanase lítica de Cellulosimicrobium cellulans 191 para obtenção das preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada com alta atividade lítica para aplicação na obtenção de protoplastos de leveduras e lise das células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus para extração de b-galactosidase. A ß-1,3-glucanase extracelular foi produzida pela bactéria Cellulosimicrobium cellulans 191 em meio otimizado composto de 10g/L de parede celular de levedura, 2,0g/L de (NH4)2SO4; 0,2g/L de MgSO4.7H2O em tampão fosfato 0,2M, pH 7,5 como descrito por SCOTT e SCHEKMAN (1980) e modificado por SOARES (2002). Foi obtida maior produção da ß-1,3-glucanase na fermentação do microrganismo em frascos aletados a 30ºC, 200rpm por 24 horas do que em fermentador contendo o mesmo meio a 30ºC, 1,5vvm por 24 horas, obtendo-se 0,724 e 0,351U/mL, respectivamente. Os sobrenadantes dos meios fermentados em frascos agitados e em fermentador de 5L apresentaram atividade de 0,120 e 0,064U/mL de protease, respectivamente. Foi estudada a influência dos compostos sacarose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glicerol (10mM), gelatina (125mg/mL), albumina de ovo (125mg/mL), sulfato de amônio (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoetanol (10mM) e cisteína (10mM) na preservação da atividade de ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta a 45ºC, 50ºC e 55ºC, no entanto, nenhum dos compostos testados aumentou a estabilidade da enzima. Foi testada a concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase por liofilização, ultrafiltração, fracionamento com sulfato de amônio, pela remoção de água com carboximetilcelulose (CMC) e precipitação com os solventes orgânicos acetona e etanol. A concentração da preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase utilizando-se sacos de diálise e CMC em pó para a adsorção da água mostrou-se como o método mais eficiente, sendo que a enzima foi concentrada 6,38 vezes com manutenção de 96% da atividade inicial. A preparação enzimática bruta de ß-1,3-glucanase foi purificada aproximadamente 2 vezes por fracionamento com sulfato de amônio 30% de saturação. A ß-1,3-glucanase da preparação enzimática bruta foi purificada aproximadamente 6,66 vezes através de fracionamento com sulfato de amônio a 30% de saturação, dessalinização em coluna de exclusão Sephadex PD10 e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 18%. Dentre as linhagens das leveduras Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromyces marxianus NRRL7571, Kluyveromyces marxianus NRRL1196, a primeira foi selecionada como maior produtora da enzima b-galactosidase. As preparações enzimáticas bruta concentrada e purificada de ß-1,3-glucanase apresentaram capacidade de lisar as células de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus a 37ºC. Para a formação de protoplastos foi utilizado 0,1U de ß-1,3-glucanase por mL de suspensão de levedura equivalente a 1,3mg de massa celular seca, durante 1 hora a 37ºC. A extração da ß-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi testada pelos métodos químico (solventes orgânicos), enzimático (ß-1,3-glucanase) e físico (ultrasonicação). O método de pré-tratamento enzimático e posterior aplicação de ultrasonicação apresentou melhores resultados seguido pelos métodos de permeabilização com etanol 50%, b-1,3-glucanase purificada, ultrasonicação, permeabilização com tolueno 20% e ß-1,3-glucanase bruta, obtendo-se, respectivamente, atividades de ß-galactosidade (massa celular seca) iguais a 25,13U/mg/min; 14,00U/mg/min; 13,11U/mg/min; 10,95U/mg/min; 10,75U/mg/min e 7,25U/mg/min utilizando-se lactose como substrato. A b-galactosidase bruta apresentou atividade ótima em pH 7,0 e 32ºC e mostrou-se estável na faixa de 30 a 35ºC após 3 horas em pH 7,0 e na faixa de pH entre 6,5 e 7,5 após 3 horas a 35ºC. A b-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus foi purificada 2,3 vezes após fracionamento com sulfato de amônio a 60% de saturação, diálise e cromatografia em coluna de troca iônica DEAE-Sephacelè, com rendimento de 31%. As preparações enzimáticas bruta e purificada da ß-glucanase lítica da bactéria Cellulosimicrobium cellulans podem ser utilizadas na obtenção de protoplastos de leveduras e extração de enzimas intracelulares de leveduras / Abstract: The enzyme ß-1,3-glucanase from the bacteria Cellulosimicrobium cellulans 191 is capable of lysing the cell wall of various yeasts including strains of Kluyveromyces sp., producers of the intracellular enzyme ß-galactosidase. This work aimed to produce lytic ß-1,3-glucanase from Cellulosimicrobium cellulans 191 in order to obtain crude, concentrated and purified enzyme preparations with high lytic activity, for application in the obtaining of yeast protoplasts and in the lysis of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus to extract ß-galactosidase. Extracellular ß-1,3-glucanase was produced by the bacteria Cellulosimicrobium cellulans 191 in an optimised culture medium composed of 10g/L yeast cell wall, 2.0g/L (NH4)2SO4 and 0.2g/L MgSO4.7H2O in 0.2M phosphate buffer, pH 7.5. The production of ß-1,3-glucanase from the microorganism was greater in flasks with flaps incubated at 30ºC and 200rpm for 24 hours than in a fermenter containing the same medium and incubated at 30ºC and 1.5vvm for 24 hours, obtaining yields of 0.724U/mL and 0.351U/mL, respectively. The supernatants from the media fermented in the shaken flasks and in the 5L fermenter presented protease activities of 0.120U/mL and 0.064U/mL, respectively. The influences of sucrose (10mM), lactose (10mM), maltose (10mM), glycerol (10mM), gelatine (125mg/mL), egg albumin (125mg/mL), ammonium sulphate (10mM), EDTA (10mM), b-mercaptoethanol (10mM) and cysteine (10mM) in the preservation of the ß-1,3-glucanase activity of the crude enzyme preparation at 45ºC, 50ºC and 55ºC, were studied, but none of the compounds tested increased the stability of the enzyme. Concentration of the crude ß-1,3-glucanase preparation was tested using freeze drying, ultrafiltration, ammonium sulphate fractionation, by the removal of water using carboxymethylcellulose (CMC) and by precipitation with the organic solvents acetone and ethanol. Concentration of the crude ß-1,3-glucanase preparation using dialysis bags and powdered CMC to adsorb the water was shown to be the most efficient method, the enzyme being concentrated 6.38 times with 96% maintenance of the initial activity. The crude ß- 1,3- glucanase preparation was purified about two-fold by ammonium sulphate fractionation at 30% saturation. The ß-1,3-glucanase of the crude enzyme preparation was purified about 6.66 times using ammonium sulphate fractionation at 30% saturation, desalting in a Sephadex PD10 exclusion column and ion exchange column chromatography using DEAE-Sephacelè, with an 18% yield. Of the following yeast strains, Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus, Kluyveromyces marxianus var. lactis, Kluyveromyces drosophilarium, Kluyveromycesmarxianus NRRL7571 and Kluyveromyces marxianus NRRL1196, the first one was selected as the greatest producer of the enzyme ß-galactosidase. The crude, concentrated and purified ß-1,3-glucanase preparations were capable of lysing the cells of Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus at 35ºC. In order to form protoplasts a ß-1,3-glucanase preparation with 0.1U activity was used per mL yeast suspension equivalent to 1.3mg dry cell mass, for 1 hour at 35ºC. Physical (ultrasound), chemical (organic solvents) and enzymatic (ß-1,3-glucanase) methods were tested for their efficiency in extracting ß-galactosidase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus. The method using an enzymatic pre-treatment followed by the application of ultrasound gave the best results, followed by methods of permeabilization by ethanol 50%, purified ß-1,3-glucanase, ultrasonication, toluene 20% and crude ß-1,3- glucanase, obtaining ß-galactosidase activities (dry cell mass) of, respectively, 25.13U/mg/min, 14.00U/mg/min, 13.11U/mg/min, 10.95U/mg/min, 10.75U/mg/min e 7.25U/mg/min using lactose as the substrate. The crude ß-galactosidase preparation showed optimum activity at pH 7.0 and 32ºC and was stable in the range from 30-35ºC after 3 hours at pH 7.0 and between pH 6.5 and 7.5 after 3 hours at 35ºC. The ß-galactosidase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus was purified 2.3 fold after ammonium sulphate fractionation at 60% saturation, dialysis and ion exchange column chromatography on DEAE-Sephacelè, with a 31% yield. The crude and purified lytic ß-glucanase preparations of Cellulosimicrobium cellulans bacteria can be used to obtaining yeast protoplasts and extraction of intracellular enzymes of yeasts / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T22:31:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Rosangelados_D.pdf: 1329629 bytes, checksum: 3c51b0ca511ea2a0133affa7ea5d0039 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A maioria dos estudos que envolvem prebióticos têm sido realizados comfrutooligossacarídeos (FOS) e galactooligossacarídeos (GOS) devido a segurança, estabilidade, propriedades sensoriais, resistência à digestão na parte superior do intestino e fermentabilidade no cólon, bem como suas capacidades em promover o crescimento das bactérias benéficas no trato gastrintestinal. Assim, esta pesquisa teve como objetivo estudar a produção e aplicação do prebiótico galactooligossacarídeo (GOS) em estudos in vitro e in vivo. A produção de GOS foi realizada utilizando a enzima ß-galactosidase, extraída de Scopulariopsis sp., na forma livre e imobilizada no suporte orgânico DEAE-celulose. Por meio do estudo in vitro avaliou-se o efeito do GOS sobre a produção de citocinas em culturas de células tumorais, utilizando interferon gama (INF-?) como marcador. Verificou-se também o efeito bifidogênico do GOS, utilizando as culturas probióticas Lactobacillus acidophillus (LA05) e Bifidobacterium animalis (Bb12), bem como a ação dos metabolitos, resultantes da fermentação por estes micro-organismos probióticos, em relação à atividade antiproliferativa em modelos de células tumorais. Foi realizado ainda o estudo in vivo com ratas adultas, com o objetivo de avaliar o impacto fisiológico dos prebióticos FOS e GOS no intestino (ceco) dos animais, através das análises de pH fecal e técnicas de morfometria intestinal. O rendimento da produção de GOS foi de 30% em 12 horas e 24% em 15 dias para a enzima livre e imobilizada, respectivamente. Nos estudos in vitro, a ação direta do GOS apresentou indícios de atividade antiproliferativa na linhagem HT-29 (adenocarcinoma de cólon), todavia, não foi capaz de reduzir em pelo menos 50% o crescimento das células tumorais. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre as células tumorais estudadas em relação à concentração de IFN-?. O efeito bifidogênico do GOS foi demonstrado pelas diferenças observadas entre as contagens iniciais e finais ( logUFC.mL-1) utilizando o meio MRS+GOS, que foram de 3,98 logUFC.mL-1 para LA05 e de 4,6 logUFC.mL-1 para Bb12. Os metabólitos resultantes da fermentação da linhagem LA05 foram testados quanto à atividade antiproliferativa em linhagens tumorais humanas. Verificou-se que o meio sem dextrose (MRS-mínimo) apresentou atividade antiproliferativa para as linhagens UACC-62 (melanoma), MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário), 786-0 (renal), NCI-H460 (pulmão) e HT-29 (cólon). O meio de cultura acrescido com GOS, por sua vez, apresentou efeito citostático apenas para duas linhagens (UACC-62 e HT-29). Os resultados obtidos sugerem que os metabólitos bacterianos provenientes da LA05 cultivada em meio sem GOS exercem efeito antiproliferativo e que o GOS reduz a produção desses compostos resultando em diminuição da atividade antiproliferativa. Quanto aos estudos in vivo, os animais que consumiram ração com os prebióticos tiveram um discreto aumento de peso, sem aumento no consumo de ração; além disso, não foi observado decréscimo relevante em relação ao pH do ceco. Os animais alimentados com FOS ou com GOS apresentaram aumento na altura das vilosidades intestinais em relação ao grupo controle (p<0.05). Foi verificado que apenas as vilosidades intestinais dos animais que consumiram FOS apresentavam-se mais largas, quando comparado com o grupo controle. Por outro lado, quanto à altura dos enterócitos, as ratas que consumiram GOS apresentaram média maior que o grupo padrão, enquanto as alimentadas com FOS não apresentaram diferença significativa (p<0,05). Embora os mecanismos envolvidos em relação à atividade metabólica do GOS não estejam totalmente esclarecidos, sugere-se que este oligossacarídeo tenha potencial de modulação no epitélio intestinal das células. Não é possível, no entanto, excluir o efeito mediado pelos ácidos graxos de cadeia curta, estimulados a partir da ingestão dos prebióticos, em relação à nutrição dos enterócitos / Abstract: Most studies involving prebiotic have been performed with fructooligossacarídeos (FOS) and galactooligosaccharides (GOS), due to security, stability, sensory properties, resistance to digestion in the upper bowel and fermentability in the colon as well as their ability to promote beneficial bacteria growth in the gastrointestinal tract. Thus, the aim of this research was to study the prebiotic galactooligosaccharide (GOS) production and application in vitro and in vivo. GOS production was performed using ß-galactosidase enzyme extracted from Scopulariopsis sp. in free form and immobilized on an organic DEAE-cellulose. The in vitro study GOS effect on cytokine production was evaluated on human cancer cell lines, using interferon gamma (INF-?) as a marker. GOS bifidogenic effect was determined using probiotic cultures Lactobacillus acidophillus (LA05) and Bifidobacterium animalis (Bb12) and the antiproliferative activity of metabolites resulting from these probiotics microorganisms fermentation was studied in human cancer cell lines. An in vivo study was also performed with adult female rats in order to evaluate the physiological impact of prebiotics FOS and GOS in the cecum of animals by analyzing fecal pH and intestinal morphology was done. The yield of GOS production was 30% at 12 hours and 24% at 15 days for free and immobilized enzyme, respectively. The direct action of GOS in vitro showed evidence of antiproliferative activity in HT-29 line (colon adenocarcinoma), however, it was not able to reduce at least 50% growth of tumor cells. There was no significant difference (p> 0.05) between tumor cells studied in IFN-? concentration. GOS bifidogenic effect was demonstrated by differences between initial and final scores ( logUFC.mL-1) when MRS + GOS was used. The difference was 3,98 logUFC.mL-1 for LA05 and 4,6 logUFC.mL-1 for Bb12. The metabolites resulting from LA05 fermentation were tested for antiproliferative activity on human cancer cell lines. The medium without dextrose (MRS-minimum) showed antiproliferative activity for the cell lines UACC-62 (melanoma), MCF-7 (breast), NCI-ADR/RES (ovary), 786-0 (renal) NCI-H460 (lung) and HT-29 (colon). The culture medium supplemented with GOS, in turn, showed only a cytostatic effect for two cell lines (UACC-62 and HT-29). The results suggest that bacterial metabolites from LA05 grown in medium without GOS exert antiproliferative effect while GOS supplementation propably reduced the active metabolites concentration. Animals fed with diet supplemented by prebiotics showed slight weight gain with no changes in fed intake and no significant decrease on cecal pH. Animals fed with FOS or GOS showed an increase in villus height in comparison with control group (p <0.05). It was found that only the villi of the animals fed with FOS were wider when compared with control group. Moreover, the enterocytes height was larger in rats that consumed GOS in comparison of control group, while those fed with FOS did not differ significantly (p<0.05). Although the mechanisms involved in GOS metabolic activity are not entirely clear, our results suggested that this oligosaccharide has a potential as intestinal epithelial cells modulator. It is not possible, however, to exclude the effect mediated by short-chain fatty acids, stimulated by prebiotics ingestion in enterocytes nutrition / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos