Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5267_1.pdf: 3744071 bytes, checksum: 7b6206d71da118c5b5587baa7e4fac35 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Kluyveromyces marxianus é uma levedura considerada não-convencional que produz 􀈕-galactosidase, enzima que hidrolisa a lactose em glicose e galactose, e que apresenta grande aplicabilidade industrial, sendo utilizada, principalmente, na redução do teor de lactose do leite e seus derivados destinados a pessoas portadoras de intolerância à lactose. A produção de biomassa e de 􀁅-galactosidase pela linhagem CBS 6556 de K. marxianus foi avaliada sob diferentes condições de cultivo. A atividade da enzima 􀁅- galactosidase não parece ser diretamente afetada pela taxa de oxigênio dissolvido, sendo mais importante a fonte de carbono utilizada. Em relação a fonte de nitrogênio, o aumento da atividade enzimática foi mais alta em meio contendo fosfato de amônia, a 34oC (4517,19 U/mg prot). Todavia, a velocidade específica de crescimento foi mais alta na temperatura de 30ºC nesta mesma fonte de nitrogênio (􀁐=40h-1). O coeficiente de partição da enzima 􀁅-galactosidase produzida em soro de queijo coalho foi avaliado em sistema bifásico aquoso (SBA) polietileno glicol(PEG)/Fosfato de potássio. A partição desta enzima foi afetado tanto pelo tamanho da cadeia do PEG quanto pela concentração dos componentes do sistema. O aumento da concentração do polímero (de 14% para 19,7%) demonstrou exercer grande influência na partição da enzima, resultando em inversão do coeficiente de partição (de K=0,008 para K=2,88) quando PEG 3350 foi utilizado para formar o SBA. A maior seletividade foi encontrada utilizando PEG 3350 (4,96); e a melhor recuperação da atividade enzimática foi obtida na fase superior do sistema PEG 8000/fosfato de potássio (76%).

In den letzten Jahren gerieten phenolische Substanzen, wie z.B. Chlor-, Nitrophenol oder Alkylphenolethoxylate aufgrund ihrer Toxizität sowie ihres kanzerogenen und endokrinen Potentials in das Interesse der Öffentlichkeit. Diese Substanzen gelangen in großen Mengen, z.B. aus industriellen Prozessen (Papier-, Kunststoff-, oder Lederindustrie) oder als Abbauprodukte von Pflanzenschutzmitteln in die Umwelt.<br /> <br /> Ziel dieser Arbeit war es, einfache biochemische Bestimmungsmethoden für verschiedene phenolische Umweltschadstoffe auf Basis biochemischer Erkennungselemente zu entwickeln. Diese sollten als Screeningmethoden in der Vor-Ort-Analytik einsetzbar sein. Die Anwendung sollte kostengünstig und einfach durchzuführen sein, so dass die Messung kein hochwissenschaftliches Personal erfordert. Daher stand im Hintergrund der Arbeit die Integration der Analysenmethode in ein kompaktes Handgerät.<br /> <br /> Zu diesem Zweck wurde ein Biosensor entwickelt der zur direkten Messung und in Kombination mit einem Immunoassay einsetzbar ist:<br /> <br /> 1.) Elektrochemischer Biosensor<br /> Ein elektrochemischer Biosensor stellt die Verbindung zwischen einer Elektrode und der biologischen Komponente dar. Als Messprinzip wurde die Amperometrie gewählt. Hierbei wird die Präsenz des nachzuweisenden Stoffes durch die angelegte Spannung am Sensor visualisiert, da beim Vorhandensein ein Stromfluss gemessen wird.<br /> <br /> Um die Signalintensität zu erhöhen können Enzyme als Katalysatoren genutzt werden, die in der Lage sind die Rückreaktion der Elektrodenreaktion zu realisieren. In diesem Fall wurde Glucose-Dehydrogenase (GDH) verwendet, die oxidierte phenolische Verbindungen reduzieren kann. Zusammen mit der Oxidation an der Sensoroberfläche bildet sich ein Verstärkungszyklus aus, der das ursprüngliche Signal vielfach erhöht.<br /> <br /> Wir waren in der Lage, GDH durch Einbetten in ein Polymerennetzwerk auf der Oberfläche einer gedruckten Platin-Dickschicht-Elektrode zu immobilisieren. Als Resultat erhielten wir einen sehr empfindlichen und äußerst stabilen Biosensor. Seine schnelle Ansprechzeit ermöglicht den Einsatz in automatisierten Fließsystemen zur Messung großer Probenzahlen. Der Einsatz in einem manuell betriebenen Handgerät konnte ebenfalls realisiert werden und brachte nur geringe Beeinträchtigungen in bezug auf die Empfindlichkeit der Messung. Die erfolgreiche Implementierung des Biosensors in das Handgerät wurde in Rahmen eines internationalen Workshops in Barcelona, anhand der Überprüfung der Reinigungsleistung von Klärwerken, gezeigt.<br /> <br /> 2.) Kombination mit Immunoassays<br /> Der Einsatzbereich der GDH-Biosensoren lässt sich durch die Kombination mit anderen Techniken erweitern, wobei der Sensor zur Visualisierung der Nachweisreaktion dient. In diesem Fall kann der Sensor zur Bestimmung der Enzymaktivität von ß?Galactosidase (ßGal) verwendet werden. Der Nachweis geringster Enzymmengen wurde realisiert. Die ßGal wird zur Markierung eines Analytanalogen in Immunoassays verwendet, um die Bindung von Antikörper und Analytmolekül sichtbar zu machen. Im Immunoassay bildet sich ein Gleichgewicht zwischen Antikörper, unmarkiertem Analyt und markiertem Analytanalog (Tracer) aus. Über die Bestimmung der Enzymaktivität kann man die Analytkonzentration in der Probe errechnen.<br /> <br /> Wir haben unseren GDH-Biosensor erfolgreich mit zwei Techniken kombiniert. Zum Einen mit einem Assay zur Bestimmung von Nitrophenol, der in einem automatisiertem Fließsystem realisiert wurde. Hier wird die Mischung aus Antikörpern, Analyt und Tracer über eine Säule gegeben und gespült. Die gebundenen Bestandteile werden durch den GDH-Biosensor quantifiziert.<br /> <br /> Zum Anderen wurde ein Kapillarimmunoassay entwickelt, der in das Handgerät integriert werden kann. Dabei wird der Antikörper direkt an der Kapillare fixiert. Die Probe wird mit Tracer vermischt und in die Kapillare gegeben. Dort bildet sich das Gleichgewicht aus und weitere Probenbestandteile werden im Spülschritt eliminiert. Die Analytkonzentration wird durch die Bestimmung des gebunden Tracers (Aktivität der ßGal) mit Hilfe des GDH-Biosensors realisiert. / The development of fast and reliable biochemical tools for on-site screening in environmental analysis was the main target of the present work. Due to various hazardous effects such as endocrine disruption and toxicity phenolic compounds are key analytes in environmental analysis and thus were chosen as model analytes.<br /> <br /> Three different methods were developed:<br /> <br /> For the enzymatic detection of phenols in environmental samples an enzyme-based biosensor was developed. In contrast to reported work using tyrosinase or peroxidases, we developed a biosensor based on glucose dehydrogenase as biorecognition element. This biosensor was devoted for an application in a laboratory flow system as well as in a portable device for on-site measurements.<br /> <br /> This enzymatic detection is applicable only for a limited number of phenols due to substrate specificity of the enzyme. For other relevant compounds based on a phenolic structure (i.e. nitrophenol, alkylphenols and alkylphenol ethoxylates) immunological methods had to be developed. The electrochemical GDH-biosensor was used as the label detector in these immunoassays.<br /> <br /> Two heterogeneous immunoassays were developed where ßGal was used as the label. An electrochemical method for the determination of the marker enzyme activity was processed. The separation step was realized with protein A/G columns (laboratory flow system) or by direct immobilization of the antibodies in small disposable capillaries (on-site analysis). <br /> <br /> All methods were targeted on the contemporary analysis of small numbers of samples.

Orientador: Glaucia Maria Pastore / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T22:31:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_Rosangelados_D.pdf: 1329629 bytes, checksum: 3c51b0ca511ea2a0133affa7ea5d0039 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A maioria dos estudos que envolvem prebióticos têm sido realizados comfrutooligossacarídeos (FOS) e galactooligossacarídeos (GOS) devido a segurança, estabilidade, propriedades sensoriais, resistência à digestão na parte superior do intestino e fermentabilidade no cólon, bem como suas capacidades em promover o crescimento das bactérias benéficas no trato gastrintestinal. Assim, esta pesquisa teve como objetivo estudar a produção e aplicação do prebiótico galactooligossacarídeo (GOS) em estudos in vitro e in vivo. A produção de GOS foi realizada utilizando a enzima ß-galactosidase, extraída de Scopulariopsis sp., na forma livre e imobilizada no suporte orgânico DEAE-celulose. Por meio do estudo in vitro avaliou-se o efeito do GOS sobre a produção de citocinas em culturas de células tumorais, utilizando interferon gama (INF-?) como marcador. Verificou-se também o efeito bifidogênico do GOS, utilizando as culturas probióticas Lactobacillus acidophillus (LA05) e Bifidobacterium animalis (Bb12), bem como a ação dos metabolitos, resultantes da fermentação por estes micro-organismos probióticos, em relação à atividade antiproliferativa em modelos de células tumorais. Foi realizado ainda o estudo in vivo com ratas adultas, com o objetivo de avaliar o impacto fisiológico dos prebióticos FOS e GOS no intestino (ceco) dos animais, através das análises de pH fecal e técnicas de morfometria intestinal. O rendimento da produção de GOS foi de 30% em 12 horas e 24% em 15 dias para a enzima livre e imobilizada, respectivamente. Nos estudos in vitro, a ação direta do GOS apresentou indícios de atividade antiproliferativa na linhagem HT-29 (adenocarcinoma de cólon), todavia, não foi capaz de reduzir em pelo menos 50% o crescimento das células tumorais. Não houve diferença significativa (p>0,05) entre as células tumorais estudadas em relação à concentração de IFN-?. O efeito bifidogênico do GOS foi demonstrado pelas diferenças observadas entre as contagens iniciais e finais ( logUFC.mL-1) utilizando o meio MRS+GOS, que foram de 3,98 logUFC.mL-1 para LA05 e de 4,6 logUFC.mL-1 para Bb12. Os metabólitos resultantes da fermentação da linhagem LA05 foram testados quanto à atividade antiproliferativa em linhagens tumorais humanas. Verificou-se que o meio sem dextrose (MRS-mínimo) apresentou atividade antiproliferativa para as linhagens UACC-62 (melanoma), MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário), 786-0 (renal), NCI-H460 (pulmão) e HT-29 (cólon). O meio de cultura acrescido com GOS, por sua vez, apresentou efeito citostático apenas para duas linhagens (UACC-62 e HT-29). Os resultados obtidos sugerem que os metabólitos bacterianos provenientes da LA05 cultivada em meio sem GOS exercem efeito antiproliferativo e que o GOS reduz a produção desses compostos resultando em diminuição da atividade antiproliferativa. Quanto aos estudos in vivo, os animais que consumiram ração com os prebióticos tiveram um discreto aumento de peso, sem aumento no consumo de ração; além disso, não foi observado decréscimo relevante em relação ao pH do ceco. Os animais alimentados com FOS ou com GOS apresentaram aumento na altura das vilosidades intestinais em relação ao grupo controle (p<0.05). Foi verificado que apenas as vilosidades intestinais dos animais que consumiram FOS apresentavam-se mais largas, quando comparado com o grupo controle. Por outro lado, quanto à altura dos enterócitos, as ratas que consumiram GOS apresentaram média maior que o grupo padrão, enquanto as alimentadas com FOS não apresentaram diferença significativa (p<0,05). Embora os mecanismos envolvidos em relação à atividade metabólica do GOS não estejam totalmente esclarecidos, sugere-se que este oligossacarídeo tenha potencial de modulação no epitélio intestinal das células. Não é possível, no entanto, excluir o efeito mediado pelos ácidos graxos de cadeia curta, estimulados a partir da ingestão dos prebióticos, em relação à nutrição dos enterócitos / Abstract: Most studies involving prebiotic have been performed with fructooligossacarídeos (FOS) and galactooligosaccharides (GOS), due to security, stability, sensory properties, resistance to digestion in the upper bowel and fermentability in the colon as well as their ability to promote beneficial bacteria growth in the gastrointestinal tract. Thus, the aim of this research was to study the prebiotic galactooligosaccharide (GOS) production and application in vitro and in vivo. GOS production was performed using ß-galactosidase enzyme extracted from Scopulariopsis sp. in free form and immobilized on an organic DEAE-cellulose. The in vitro study GOS effect on cytokine production was evaluated on human cancer cell lines, using interferon gamma (INF-?) as a marker. GOS bifidogenic effect was determined using probiotic cultures Lactobacillus acidophillus (LA05) and Bifidobacterium animalis (Bb12) and the antiproliferative activity of metabolites resulting from these probiotics microorganisms fermentation was studied in human cancer cell lines. An in vivo study was also performed with adult female rats in order to evaluate the physiological impact of prebiotics FOS and GOS in the cecum of animals by analyzing fecal pH and intestinal morphology was done. The yield of GOS production was 30% at 12 hours and 24% at 15 days for free and immobilized enzyme, respectively. The direct action of GOS in vitro showed evidence of antiproliferative activity in HT-29 line (colon adenocarcinoma), however, it was not able to reduce at least 50% growth of tumor cells. There was no significant difference (p> 0.05) between tumor cells studied in IFN-? concentration. GOS bifidogenic effect was demonstrated by differences between initial and final scores ( logUFC.mL-1) when MRS + GOS was used. The difference was 3,98 logUFC.mL-1 for LA05 and 4,6 logUFC.mL-1 for Bb12. The metabolites resulting from LA05 fermentation were tested for antiproliferative activity on human cancer cell lines. The medium without dextrose (MRS-minimum) showed antiproliferative activity for the cell lines UACC-62 (melanoma), MCF-7 (breast), NCI-ADR/RES (ovary), 786-0 (renal) NCI-H460 (lung) and HT-29 (colon). The culture medium supplemented with GOS, in turn, showed only a cytostatic effect for two cell lines (UACC-62 and HT-29). The results suggest that bacterial metabolites from LA05 grown in medium without GOS exert antiproliferative effect while GOS supplementation propably reduced the active metabolites concentration. Animals fed with diet supplemented by prebiotics showed slight weight gain with no changes in fed intake and no significant decrease on cecal pH. Animals fed with FOS or GOS showed an increase in villus height in comparison with control group (p <0.05). It was found that only the villi of the animals fed with FOS were wider when compared with control group. Moreover, the enterocytes height was larger in rats that consumed GOS in comparison of control group, while those fed with FOS did not differ significantly (p<0.05). Although the mechanisms involved in GOS metabolic activity are not entirely clear, our results suggested that this oligosaccharide has a potential as intestinal epithelial cells modulator. It is not possible, however, to exclude the effect mediated by short-chain fatty acids, stimulated by prebiotics ingestion in enterocytes nutrition / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4514.pdf: 2385637 bytes, checksum: 89b533535415a993d655f83f1387c6f0 (MD5) Previous issue date: 2012-06-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / The selection of cellulase-producing fungi is one of the possible estrategies for obtaining necessary enzymes to hydrolyze the lignocellulosic material of plant biomass and thereby contribute to the viability of cellulosic ethanol production. The aim of this study was achive a screening of isolated fungi from the Amazon region to assess the production of enzymes related to plant biomass degradation, in order to select a line for production, purification and biochemical, kinetical and and structural biology characterizationof the ß-Galactosidase enzyme. Therefore, this work was undertaken in three stages, first of all it was performed a screening of 40 fungal strains isolated from the Amazon region through the cultivation in solid state fermentation (FES) at 35ºC for 240 hours, using as substrate wheat bran. It was evaluated the production of xylanase, endoglucanase, FPase, pectinase, ß-Glicosidase and total protein, and the fungi that stood out were: P6B2, the best producer of xylanase, P47C3 (Aspergillus niger), the best producer endoglucanase and ß-Glicosidase and P40B3, the best producer of FPase. These three fungi were selected for the second phase of this work for assessment in the production of xylanase, FPase, endoglucanase, ß-Glicosidase and total protein by submerged fermentation (FSm). The fermentation took place for 5 days at 30ºC and 200 rpm with a source of carbon: 1% of wheat bran washed and nutrient medium. The fungi P47C3, which was identified as Aspergillus niger, showed the best production of these enzymes, being selected for the third stage of this project. This last step involved the selection of an enzyme that has not been elucidated its structural biology. Given this fact, we carried out a study of selection of the medium, purification and biochemicalkinetical characterization of ß-Galactosidase. The Aspergillus niger (P47C3) was subjected to submerged for 5 days at 200 rpm at 30ºC. Purification occured in three steps using: ion exchange column SP-Sephadex C-50 and SP TSK-5PW column, and gelfiltration, with the resin Sephacryl S-200. The enzyme ß-Galactosidase showed a molecular weight of 125 kDa, being stable at pH 4,0, with anoptimum temperature of 55ºC. It was evaluated theKmap e Vmáxap of two substrates, PNPG and lactose, being: 2,204 mM-0,285 mM/min and 2,101 mM-0,75mM/min, respectively. The inhibition of hydrolasis of the substrate PNPG by ß-Galactosidase in the presence of galactose inhibitor product showed a Ki value of 5,01 mM. Finally, the ß-Galactosidase was subjected to crystallization conditions, the best conditions occurred in buffer 0,2M Tris- HCl, with the precipitation agent, 12% PEG 4000 at pH 8,6. Therefore, the unpublished protocol for purification of ß-Galactosidase was efficient and it is possible to crystallize this enzyme of isolated fungi from the Amazon region, which showed great potencial for the production of this enzyme and that the future can be used in industrial application and biotechnological innovations. / A seleção de fungos produtores de celulases é uma das possíveis estratégias para a obtenção das enzimas necessárias para hidrolisar o material lignocelulósico da biomassa vegetal e com isso contribuir para a viabilização da produção de etanol celulósico. O objetivo desse trabalho foi realizar um screening dos fungos isolados da região amazônica para a avaliação da produção de enzimas relacionadas à degradação da biomassa vegetal, a fim de selecionar uma linhagem para produção, purificação e caracterização bioquímica, cinética e biologia estrutural da enzima ß-Galactosidase. Dessa forma, esse trabalho foi realizado em três etapas, primeiramente foi realizado um screening de 40 linhagens fúngicas isoladas da região amazônica, através do cultivo em fermentação em estado sólido (FES), a 35°C, por 240 horas, utilizando como substrato o farelo de trigo. Avaliou-se a produção de xilanase, endoglucanase, FPase, pectinase, ßglicosidase e proteínas totais, sendo que os fungos que mais se destacaram foram o: P6B2, melhor produtor de xilanase, P47C3 (Aspergillus niger), melhor produtor de endoglucanase e ß-glicosidase e o P40B3, melhor produtor de FPase. Esses três fungos, foram selecionados para a segunda fase do trabalho para avaliação na produção de xilanase, FPase, endoglucanase, ß-glicosidase e proteínas Totais por fermentação submersa (FSm). A fermentação ocorreu por 5 dias, à 30ºC e 200 rpm tendo como fonte de carbono: 1% de farelo de trigo lavado e meio nutriente. O fungo P47C3, identificado como Aspergillus niger, apresentou melhor produção dessas enzimas, sendo selecionado para a terceira etapa desse projeto. Essa última etapa, envolveu a escolha de uma enzima que não estivesse sua biologia estrutural elucidada. Diante desse fato, realizou-se um estudo de seleção do meio de cultivo, purificação e caracterização bioquimico-cinética da ß-Galactosidase. O fungo Aspergillus niger (P47C3) foi submetido a fermentação submersa, durante 5 dias, à 200 rpm em 30ºC. A purificação ocorreu em três etapas utilizando: colunas de troca iônica SP - Sephadex C-50 e a coluna SP -TSK 5PW; e gel filtração, com a resina Sephacryl S-200. A enzima ß-Galactosidase apresentou uma massa molecular de 125 kDa, sendo estável em pH 4,0, e com temperatura ótima de 55ºC. Avaliou-se a Kmap e Vmáxap de dois substratos, o PNPG e a lactose, sendo: 2,204 mM - 0,285 mM/min e 2,101 mM 0,750 mM/min, respectivamente. A inibição da hidrólise do substrato PNPG pela ß-Galactosidase na presença do produto inibidor galactose apresentou um valor de Ki de 5,01 mM. Por fim, a ß-Galactosidase foi submetida a condições de cristalização, as melhores condições ocorreram em tampão 0,2M Tris-HCl, tendo como agente precipitante, PEG 4000 12% em pH 8,6. Portanto, o protocolo inédito de purificação da ß-Galactosidase foi eficiente, sendo possível cristalizar essa enzima do fungo isolado da região amazônica, o qual apresentou grande potencial para a produção dessa enzima e que futuramente possa ser utilizado em aplicações industriais e inovações biotecnológicas.