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The cholesterol-lowering effect of mixed linkage (1→3) (1→4)-β-D-glucans (β-glucan) from barley has been documented, yet the underlying mechanism responsible for this action and factors influencing it, such as physicochemical properties of β-glucan and genetic background of an individual, remain unclear.As a component of dietary fibre, β-glucan also has the potential to shift the gut microbial community, however, whether alterations in the gut microbiota are associated with the physiological effects of β-glucan have yet to be determined. This study was designed to assess the effects of β-glucan molecular weight (MW) and dose on loweringserum cholesterol levels and to elucidate its mechanism of action in human subjects. Additionally, this study examined gene-diet interactions as well as changes in the gut microbiota profile following consumption of barley foods. In a controlled four phase crossover trial, mildly hypercholesterolemic but otherwise healthy subjects (n =30) were randomly assigned to receive breakfasts containing 3g high MW (HMW), 5g low molecular weight (LMW), 3g LMW barley β-glucan or a control diet with wheat and rice (WR control), each for 5 weeks. The washout period between the phases was 4 weeks. The consumption of 3g/d HMW diet lowered total cholesterol (TC) compared with WR control diet (P =0.0046), but not the LMW diet at either 3g/d or 5g/d. Individuals with the SNP rs3808607-G allele of CYP7A1 had greater TC reduction in response to 3g/d HMW β-glucan diet compared to the individuals carrying homozygous TT alleles (P<0.01). Cholesterol absorption and synthesis were not changed, but bile acid synthesis increased by 3g/d HMW diet compared to the control. Consuming 3g HMW/d β-glucan altered gut microbiota at the phylum and genus levels and the impacted microbial members was correlated with favorable shifts of cardiovascular disease risk factors. In conclusion, physicochemical properties of β-glucan play critical roles in the cholesterol-lowering effect and gut microbiota alteration ability of β-glucan. The results suggest the increasing bile acid synthesis rather than inhibiting cholesterol absorption and synthesis is the mechanism responsible for the cholesterol reducing property of β-glucan.The altered microbiota profile by HMW β-glucan is associated with its physiological effect. / February 2016

L’homéostasie glucidique est, durant un jeûne normal, maintenue grâce à un réseau de régulation complexe contrôlé principalement par le glucagon, produit par le pancréas. S’opposant aux effets de l’insuline, celui-ci orchestre notamment l'utilisation, le stockage et la synthèse du glucose par le foie, principal organe de production du glucose au cours du jeûne. Cette dernière s’effectue d’abord suite à la dégradation du glycogène ou glycogénolyse puis par la synthèse de novo de glucose ou néoglucogenèse. La néoglucogenèse hépatique est contrôlée par la modulation de l’activité et/ou de l’expression de différentes enzymes-clefs selon des mécanismes allostériques ou transcriptionnels.De multiples facteurs de transcription sont impliqués dans la régulation, au niveau transcriptionnel, de la néoglucogenèse hépatique. Le récepteur nucléaire des acides biliaires FXR est exprimé dans le foie et dans plusieurs organes impliqués dans le maintien de l’homéostasie glucidique. FXR participe à la régulation de nombreuses fonctions hépatiques essentielles, en contrôlant notamment les métabolismes des acides biliaires et lipidique. Le rôle exact de FXR sur la néoglucogenèse reste toujours débattu. L’objectif de cette thèse a donc été d’étudier le rôle de FXR dans le contrôle de la néoglucogenèse hépatique dans des conditions expérimentales reflétant certains aspects du jeûne. Nous avons démontré que FXR, en présence de glucagon, régulait positivement la néoglucogenèse selon deux mécanismes.Le premier mécanisme implique la phosphorylation de FXR par la PKA, une kinase activée par le glucagon. Cette modification post-traductionnelle de FXR permet une induction synergique de l’expression des enzymes-clefs de la néoglucogenèse par FXR et le facteur de transcription CREB. L’identification de ce mécanisme constitue la majeure partie des travaux présentés dans cette thèse. Ceux-ci ont été intégrés à des travaux menés précédemment dans le laboratoire qui nous ont permis d’identifier un mécanisme additionnel de régulation de la gluconéogenèse. L’interaction directe de FXR avec le facteur de transcription FOXA2, lui-même activé par le glucagon, inhibe la capacité de FXR à induire l’expression de SHP, un récepteur nucléaire inhibiteur de la néoglucogenèse.Ce travail a donc permis d’identifier pour la première fois que la néoglucogenèse hépatique est régulée positivement par FXR dans le cadre de la voie de signalisation du glucagon. Pour cela, FXR intègre le signal « glucagon » par deux mécanismes distincts: via une modification post-traductionnelle, sa phosphorylation par la PKA sur les sérines S325 et S357 et via une interaction protéine-protéine avec FOXA2. / Glucose homeostasis is maintained during normal fasting through a complex regulatory network controlled mainly by glucagon, a pancreatic hormone. Opposing the effects of insulin, it orchestrates the glucose use, storage and synthesis by the liver, the main organ that produces glucose during fasting. The latter is carried out first by the degradation of glycogen or glycogenolysis and then by de novo glucose synthesis or gluconeogenesis. Hepatic gluconeogenesis is controlled by modulation of various key enzymes activity and/or expression according to allosteric or transcriptional mechanisms.Multiple transcription factors are involved in the transcriptional regulation of hepatic gluconeogenesis. The nuclear bile acid receptor FXR is expressed in the liver and in several organs involved in glucose homeostasis. FXR regulates many essential liver functions, including controlling bile acid and lipid metabolism. The exact role of FXR on gluconeogenesis is still debated. The objective of this work was therefore to study the role of FXR in the control of hepatic gluconeogenesis under experimental conditions reflecting certain aspects of fasting. We demonstrated that FXR, in the presence of glucagon, positively regulated gluconeogenesis according to two mechanisms.The first mechanism involves phosphorylation of FXR by PKA, a glucagon-activated kinase. This FXR post-translational modification allows synergistic induction of key gluconeogenic enzymes expression by FXR and the CREB transcription factor. This mechanism identification constitutes the major part of the work presented in this thesis. These were integrated with work previously conducted in the laboratory that allowed us to identify an additional mechanism for regulating gluconeogenesis. The FXR direct interaction with the transcription factor FOXA2, itself activated by glucagon, inhibits the ability of FXR to induce the expression of SHP, a gluconeogenesis inhibitory nuclear receptor.This work has therefore identified for the first time that hepatic gluconeogenesis is positively regulated by FXR in the glucagon signalling pathway. For this, FXR integrates the "glucagon" signal by two distinct mechanisms: via post-translational modification, its phosphorylation by PKA on S325 and S357 serines and via protein-protein interaction with FOXA2.

Le foie est un organe clef dans la régulation du métabolisme énergétique de l’organisme. La superfamille des récepteurs nucléaires y joue un rôle primordial de senseur de l’environnement métabolique. Parmi ces récepteurs nucléaires, le récepteur des acides biliaires FXR participe aux mécanismes de régulation de l’activité du foie à travers son action sur les métabolismes des acides biliaires, des glucides et des lipides. FXR est devenu ainsi une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de nombreuses maladies impliquant un désordre métabolique comme les cholestases, le diabète de type 2 ou la stéatohépatite non-alcoolique. Malgré des résultats prometteurs dans le traitement de la stéatohépatite non-alcoolique, le traitement de patients avec un agoniste de FXR, le INT747, semble augmenter la concentration plasmatique du LDL-Cholestérol et diminue la concentration du HDL-Cholestérol suggérant un risque accru de développement d’athérosclérose. Ces effets sur le profil lipidique sont le frein majeur du développement clinique de ses agonistes. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation par FXR de nombreuses voies comme le métabolisme des lipides et du cholestérol sont peu explorés et peu compris. Compte-tenu de ces informations, il est d’autant plus intéressant d’approfondir les connaissances de ces mécanismes et d’identifier des facteurs ou de nouveaux partenaires capables de moduler l’activité transcriptionnelle de FXR plus spécifiquement dans le cadre du contrôle du métabolisme des lipides et du cholestérol. L’un des facteurs de transcription connu comme régulateur majeur de ces voies métaboliques dans le foie est le facteur de transcription de la famille forkhead FOXA2. Ce facteur de transcription, dont l’activité est dépendante des conditions physiologiques, est activé par le glucagon et inhibé par l’insuline. De plus, c’est également un régulateur du métabolisme des acides biliaires, du cholestérol et des lipides.L’objectif de cette thèse a été d’étudier l’interaction entre les voies de signalisation de FXR et de FOXA2 dans différentes lignées cellulaires d’hépatocytes humains ou murins et dans le foie. Nous avons établi que FOXA2 et FXR sont colocalisés sur la chromatine des cellules HepG2 et dans le foie de souris à proximité de gènes impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides et du cholestérol. Ces zones de cofixation de FXR et de FOXA2 présentent très peu de motifs de fixation de FOXA2 suggérant l’implication d’autres motifs de fixation non connus ou un mécanisme de type « tethering ». Nous avons montré que la fixation de FOXA2 à ces zones de cofixation avec FXR est augmentée par l’activation de FXR par son agoniste, le GW4064, évoquant une potentielle interaction entre ces deux facteurs. Nous avons démontré que ces deux facteurs interagissaient physiquement et que FOXA2 est un répresseur de l’activité transcriptionnelle de FXR à travers l’utilisation de différentes approches et modèles cellulaires. Finalement, dans les hépatocytes primaires de souris, FOXA2 est impliqué dans la répression de l’activité transcriptionnelle de FXR par le glucagon sur le gène Shp.L’ensemble de ce travail met en évidence pour la première fois la répression de l’activité de FXR par le facteur de transcription caractéristique du jeûne FOXA2 à travers un mécanisme moléculaire suggérant une transrépression de type «tethering». Ces résultats présentent un mécanisme inédit par lequel l’activité de FXR peut être modulée par le statut nutritionnel de façon gène-spécifique. / The liver is a key regulator of whole-body energy metabolism. The nuclear receptor super-family plays a leading role in the metabolic sensing of the liver. Among the nuclear receptors, the bile acid nuclear receptor FXR contribute to the modulation of liver activity in particular through the regulation of bile acid, lipids and glucose homeostasis. Consequently, FXR became a potential therapeutic target for many diseases implicated metabolic disorder such as cholestasis, type 2 diabete or Non-Alcoholic Steatohepatitis (NASH). Despite promising results especially on NASH, patient treatment with FXR agonist the INT747 seems to increase LDL-Cholesterol plasma concentrations together with a decreased concentration of HDL-Cholesterol suggesting a higher risk to develop atherosclerosis. These effects on plasma lipid profile are the major break against the development of agonists in clinics. Giving the poor understanding and knowledge of the molecular mechanisms which govern FXR regulation of activity on various signaling pathways, it is of major interest to find new partners and regulators of FXR and especially on lipid and cholesterol homeostasis. One of the transcription factor known to be active in the control of these signaling pathways in the liver is the forkhead box transcription factor FOXA2. This transcription factor whose activity is dependent of physiological conditions is activated by glucagon and inhibited by insulin. In addition, this factor is known to regulate bile acid, cholesterol and lipid metabolism, functions very close from FXR activities in the liver.The objective of this PhD was to study the interaction between FXR and FOXA2 signaling pathways in different hepatic cells lines from human or mouse origin and in the liver. We established that FOXA2 and FXR are colocalised in HepG2 cells and liver chromatin near genes implicated in the lipid and cholesterol metabolism. These FXR/FOXA2 cobinding zones present few consensus FOXA2 response elements suggesting the implication of non consensus binding motifs or a “tethering” mechanism. We show that FOXA2 binding to FXR/FOXA2 cobinding zones is increased when FXR is activated and/or more present in the chromatin evoking a potential interaction between these two factors. We demonstrate that FXR and FOXA2 interact physically and that FOXA2 is a repressor of FXR transcriptional activity using different approaches and cellular models. Finally, we show that FOXA2 is implicated in glucagon-induced repression of FXR transcriptional activity on Shp gene.To conclude, our results show for the first time that the fasting key regulator of lipid and cholesterol homeostasis FOXA2 is a repressor of FXR transcriptional activity through a plausible mechanism involving “tethering” process. This work gives a novel mechanism by which FXR activity can be modified by nutritional status in a gene-specific manner.

This thesis focuses on the importance of intermediate products of biosynthetic and catabolic pathway of cholesterol. The aim of the first part of the thesis is mainly to investigate, whether statins (HMG- CoA reductase inhibitors) possess antitumor properties and to compare the differences in antitumor potential of individual statins. The other part of the thesis aims at the utilization of 7α-hydroxycholest-4-en-3-one (C4), a promising marker of cholesterol 7α-monooxygenase (CYP7A1) activity and bile acid malabsorption. We demonstrated antitumor effect of statins on an experimental model of pancreatic cancer. Individual statins, however, differed significantly in their efficacy, depending on their physico-chemical properties. Our data suggests, that the most likely (but not the only) mechanism of antitumor effect of statins is decreased prenylation of signaling proteins, especially Ras protooncogene. We set up a reliable method for measurement of C4, which facilitated our research in CYP7A1 regulation. We demonstrated, that promoter polymorphism -203A>C might affect CYP7A1 activity, that diurnal variability of CYP7A1 activity might be triggered by insulin, and that insulin resistance in patients with non-alcoholic fatty liver disease impedes the feedback regulation of CYP7A1, which may lead to disease...

Les orosomucoïdes, membres de la superfamille des lipocalines, sont parmi les protéinesplasmatiques les plus abondantes. Ce sont des protéines de la phase aiguë de l’inflammationsecrétées par les hépatocytes en réponse à un stress (inflammation, cancer, cirrhose…), etutilisées couramment en clinique comme marqueur d’un état pathologique. Elles vont lorsd’un état inflammatoire inhiber la prolifération des neutrophiles et des lymphocytes. J’ai pumontrer que le récepteur nucléaire FXR, impliqué dans de nombreuses voies métaboliques etplus récemment comme ayant un rôle anti-inflammatoire dans le foie, régule l’expression desorosomucoïdes exclusivement au niveau hépatique chez la souris. Cela suggère que larégulation de certains processus inflammatoire par FXR pourrait être expliqué par larégulation transcriptionelle des orosomucoïdes.Le second sujet met en évidence une relation entre le récepteur nucléaire Rev-Erba et la OGlcNAcylationau niveau hépatique. La O-GlcNAcylation est une modification posttraductionnelledes protéines qui permet l’ajout d’un groupement O-GlcNAc. De nombreusesprotéines impliquées dans de multiples processus biologiques comme la régulation du cyclecellulaire, du rythme circadien, ou encore dans de nombreuses voies métaboliques, vont êtreO-GlcNAcylées. La dérégulation de la O-GlcNAcylation est également impliquée dans denombreuses pathologies telles que le diabète, le cancer ou encore la maladie d’Alzheimer. Lerythme circadien est un important régulateur du métabolisme. De plus en plus d’indicesindiquent que la O-GlcNAcylation est un intermédiaire essentiel dans la régulationcircadienne du métabolisme. Des modulations circadiennes de la O-GlcNAcylation deBMAL1, CLOCK et PER ont été mises en évidence. Ce lien entre la O-GlcNAcylation et lerythme circadien nous a poussé à essayer d’identifier le rôle potentiel de Rev-Erba, récepteurnucléaire impliqué dans le contrôle de la ryhtmicité circadienne, dans la régulation de la OGlcNAcylation.Nous avons pu montrer par ces travaux que Rev-Erba est un régulateurimportant de la O-GlcNAcylation. La déficience en Rev-Erba induisant une baisse importantede la O-GlcNAcylation. Rev-Erba ne régule pas le niveau de transcription des enzymesimpliquées dans la O-GlcNAcylation mais est capable d’intéragir avec l’OGT (enzymeresponsable de la O-GlcNAcylation) et d’inhiber sa dégradation par le protéasome. Par cemécanisme de stabilisation de l’enzyme OGT, Rev-Erba se révèle être un régulateurimportant de la O-GlcNAcylation. / Orosomucoïdes, members of the superfamily of lipocalines, are among proteins plasmatiques the most plentiful. They are proteins of the acute(sharp) phase of the inflammation secreted by hépatocytes in answer to a stress (inflammation, cancer, cirrhosis), and usually used in private hospital as marker(scorer) of a pathological state. They go during an inflammatory state to inhibit the proliferation of neutrophiles and lymphocytes. I was able to show that the nuclear receiver FXR, implied(involved) in numerous metabolic ways and more recently as having an anti-inflammatory role in the liver, regulates the expression of orosomucoïdes exclusively at the hepatic level to the mouse. (...]

This thesis focuses on the importance of intermediate products of biosynthetic and catabolic pathway of cholesterol. The aim of the first part of the thesis is mainly to investigate, whether statins (HMG- CoA reductase inhibitors) possess antitumor properties and to compare the differences in antitumor potential of individual statins. The other part of the thesis aims at the utilization of 7α-hydroxycholest-4-en-3-one (C4), a promising marker of cholesterol 7α-monooxygenase (CYP7A1) activity and bile acid malabsorption. We demonstrated antitumor effect of statins on an experimental model of pancreatic cancer. Individual statins, however, differed significantly in their efficacy, depending on their physico-chemical properties. Our data suggests, that the most likely (but not the only) mechanism of antitumor effect of statins is decreased prenylation of signaling proteins, especially Ras protooncogene. We set up a reliable method for measurement of C4, which facilitated our research in CYP7A1 regulation. We demonstrated, that promoter polymorphism -203A>C might affect CYP7A1 activity, that diurnal variability of CYP7A1 activity might be triggered by insulin, and that insulin resistance in patients with non-alcoholic fatty liver disease impedes the feedback regulation of CYP7A1, which may lead to disease...