Biomedical study researchers using animals to model disease and treatment need fast, deep, noninvasive, and inexpensive multi-channel imaging methods. Traditional fluorescence microscopy meets those criteria to an extent. Specifically, two-photon and confocal microscopy, the two most commonly used methods, are limited in penetration depth, cost, resolution, and field of view. In addition, two-photon microscopy has limited ability in multi-channel imaging. Light sheet microscopy, a fast developing 3D fluorescence imaging method, offers attractive advantages over traditional two-photon and confocal microscopy. Light sheet microscopy is much more applicable for in vivo 3D time-lapsed imaging, owing to its selective illumination of tissue layer, superior speed, low light exposure, high penetration depth, and low levels of photobleaching. However, standard light sheet microscopy using Gaussian beam excitation has two main disadvantages: 1) the field of view (FOV) of light sheet microscopy is limited by the depth of focus of the Gaussian beam. 2) Light-sheet images can be degraded by scattering, which limits the penetration of the excitation beam and blurs emission images in deep tissue layers. While two-sided sheet illumination, which doubles the field of view by illuminating the sample from opposite sides, offers a potential solution, the technique adds complexity and cost to the imaging system. We investigate a new technique to address these limitations: Bessel light sheet microscopy in combination with incoherent nonlinear Structured Illumination Microscopy (SIM). Results demonstrate that, at visible wavelengths, Bessel excitation penetrates up to 250 microns deep in the scattering media with single-side illumination. Bessel light sheet microscope achieves confocal level resolution at a lateral resolution of 0.3 micron and an axial resolution of 1 micron. Incoherent nonlinear SIM further reduces the diffused background in Bessel light sheet images, resulting in confocal quality images in thick tissue. The technique was applied to live transgenic zebra fish tg(kdrl:GFP), and the sub-cellular structure of fish vasculature genetically labeled with GFP was captured in 3D. The superior speed of the microscope enables us to acquire signal from 200 layers of a thick sample in 4 minutes. The compact microscope uses exclusively off-the-shelf components and offers a low-cost imaging solution for studying small animal models or tissue samples.

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La tomographie est la discipline qui cherche à reconstruire une donnée physique dans son volume, à partir de l’information indirecte de projections intégrées de l’objet, à différents angles de vue. L’une de ses applications les plus répandues, et qui constitue le cadre de cette thèse, est l’imagerie scanner par rayons X pour le médical. Or, les mouvements inhérents à tout être vivant, typiquement le mouvement respiratoire et les battements cardiaques, posent de sérieux problèmes dans une reconstruction classique. Il est donc impératif d’en tenir compte, i.e. de reconstruire le sujet imagé comme une séquence spatio-temporelle traduisant son “évolution anatomique” au cours du temps : c’est la tomographie dynamique. Élaborer une méthode de reconstruction spécifique à ce problème est un enjeu majeur en radiothérapie, où la localisation précise de la tumeur dans le temps est un prérequis afin d’irradier les cellules cancéreuses en protégeant au mieux les tissus sains environnants. Des méthodes usuelles de reconstruction augmentent le nombre de projections acquises, permettant des reconstructions indépendantes de plusieurs phases de la séquence échantillonnée en temps. D’autres compensent directement le mouvement dans la reconstruction, en modélisant ce dernier comme un champ de déformation, estimé à partir d’un jeu de données d’acquisition antérieur. Nous proposons dans ce travail de thèse une approche nouvelle ; se basant sur la théorie des problèmes inverses, nous affranchissons la reconstruction dynamique du besoin d’accroissement de la quantité de données, ainsi que de la recherche explicite du mouvement, elle aussi consommatrice d’un surplus d’information. Nous reconstruisons la séquence dynamique à partir du seul jeu de projections courant, avec pour seules hypothèses a priori la continuité et la périodicité du mouvement. Le problème inverse est alors traité rigoureusement comme la minimisation d’un terme d’attache aux données et d’une régularisation. Nos contributions portent sur la mise au point d’une méthode de reconstruction adaptée à l’extraction optimale de l’information compte tenu de la parcimonie des données — un aspect typique du problème dynamique — en utilisant notamment la variation totale (TV) comme régularisation. Nous élaborons un nouveau modèle de projection tomographique précis et compétitif en temps de calcul, basé sur des fonctions B-splines séparables, permettant de repousser encore la limite de reconstruction imposée par la parcimonie. Ces développements sont ensuite insérés dans un schéma de reconstruction dynamique cohérent, appliquant notamment une régularisation TV spatio-temporelle efficace. Notre méthode exploite ainsi de façon optimale la seule information courante à disposition ; de plus sa mise en oeuvre fait preuve d’une grande simplicité. Nous faisons premièrement la démonstration de la force de notre approche sur des reconstructions 2-D+t à partir de données simulées numériquement. La faisabilité pratique de notre méthode est ensuite établie sur des reconstructions 2-D et 3-D+t à partir de données physiques “réelles”, acquises sur un fantôme mécanique et sur un patient / Computerized tomography (CT) aims at the retrieval of 3-D information from a set of projections acquired at different angles around the object of interest (OOI). One of its most common applications, which is the framework of this Ph.D. thesis, is X-ray CT medical imaging. This reconstruction can be severely impaired by the patient’s breath (respiratory) motion and cardiac beating. This is a major challenge in radiotherapy, where the precise localization of the tumor is a prerequisite for cancer cells irradiation with preservation of surrounding healthy tissues. The field of methods dealing with the reconstruction of a dynamic sequence of the OOI is called Dynamic CT. Some state-of-the-art methods increase the number of projections, allowing an independent reconstruction of several phases of the time sampled sequence. Other methods use motion compensation in the reconstruction, by a beforehand estimation on a previous data set, getting the explicit motion through a deformation model. Our work takes a different path ; it uses dynamic reconstruction, based on inverse problems theory, without any additional information, nor explicit knowledge of the motion. The dynamic sequence is reconstructed out of a single data set, only assuming the motion’s continuity and periodicity. This inverse problem is considered as a minimization of an error term combined with a regularization. One of the most original features of this Ph.D. thesis, typical of dynamic CT, is the elaboration of a reconstruction method from very sparse data, using Total Variation (TV) as a very efficient regularization term. We also implement a new rigorously defined and computationally efficient tomographic projector, based on B-splines separable functions, outperforming usual reconstruction quality in a data sparsity context. This reconstruction method is then inserted into a coherent dynamic reconstruction scheme, applying an efficient spatio-temporal TV regularization. Our method exploits current data information only, in an optimal way ; moreover, its implementation is rather straightforward. We first demonstrate the strength of our approach on 2-D+t reconstructions from numerically simulated dynamic data. Then the practical feasibility of our method is established on 2-D and 3-D+t reconstructions of a mechanical phantom and real patient data

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