PML is involved in many cellular processes. It organizes nuclear structures PML nuclear bodies (PML NBs) and it associates with nucleolus in response to ribosomal stress to form PML nucleolar associations (PNAs). The function of PNAs is unclear. To elucidate this question, one can attempt to identify proteins interacting with PML at nucleolus. The common method is co- immunoprecipitation, however, this approach cannot be used for PML due to its low solubility. To defeat this, an alternative way of proximity-dependent biotin labelling could be used. The goal of this work was to explore a suitability of biotin labelling for identification of PML nucleolar partners. For this purpose I prepared constructs of wild type or mutated PML with GFP and biotin ligase for transient and stable expression and analysed their propensity to form PML NBs and doxorubicin-induced PNAs, and biotinylate their vicinity. In transient expression, both fusion proteins formed PML NBs and only wild type but not mutated PML IV formed PNAs after doxorubicin treatment with preserved biotinylation capability. In stable expression of fusion proteins in cells with PML knockout the number and composition of PML NBs was aberrant and no PNAs were observed. However, this system was utilized for optimization of solubilisation of biotinylated...

Cette étude a été conçue pour identifier les protéines qui interagissent potentiellement avec Déméthylase 4A spécifique de la lysine (KDM4A) dans le contexte du cancer en utilisant l’essai d'identification de la biotine dépendante de la proximité 2 (BioID2). KDM4A est une lysine déméthylase et un régulateur épigénétique qui joue un rôle dans la carcinogenèse en favorisant la prolifération. Nous avons cherché à identifier l'interactome protéique de KDM4A dans la lignée cellulaire du cancer du col de l'utérus HeLa. Ces interactions protéiques ont été caractérisées en fonction de leur dépendance à l’activité catalytique de KDM4A et / ou au domaine Tandem Tudor. De nouveaux interactants de KDM4A ont été détectés, tout en observant des partenaires protéiques précédemment identifiés, comme FBXO22. KDM4A semble interagir avec certains membres du complexe de remodelage de la chromatine pBAF, en particulier, ARID2, BRD7 et SMARCA2. Le complexe pBAF facilite ou empêche l'accessibilité à l'ADN en restructurant le nucléosome. Une analyse plus approfondie est nécessaire pour valider si l'interaction complexe KDM4A-pBAF est directe ou indirecte. Cette étude suggère également l’importance du domaine Tandem Tudor dans le rôle de KDM4A dans la réparation de bris double brin. Enfin, nous proposons également une implication potentielle de KDM4A dans l'épissage de l'ARNm et le transport d'anions organiques. Cette étude fournit de nouvelles informations sur le rôle de KDM4A dans le développement du cancer. / This study was designed to identify potential interacting proteins of Lysine-specific demethylase 4A (KDM4A) in the context of cancer using proximity-dependent biotin identification 2 (BioID2) assay. KDM4A is a lysine demethylase and an epigenetic regulator that plays a role in carcinogenesis by promoting proliferation. Herein, we sought out to identify the protein interactome of KDM4A in cervical cancer cell line HeLa. These protein interactions were characterized by their dependency on KDM4A’s catalytic activity and/or Tandem Tudor domain. It succeeded at detecting novel interactors of KDM4A as well as previously studied interactions, such as FBXO22. KDM4A seems to be interacting with some members of the pBAF chromatin remodeling complex, specifically, ARID2, BRD7, and SMARCA2. The pBAF complex facilitates or prevents accessibility to DNA by restructuring the nucleosome. Further analysis is required to validate whether the KDM4A-pBAF complex interaction is direct or indirect. This study also implied the importance of the Tandem Tudor domain in KDM4A’s role in the double stranded break repair. Finally, we also propose the potential involvement of KDM4A in mRNA splicing and organic anion transport. This study provides new insights into KDM4A’s role in cancer development.

Les cellules présentatrices d'antigène (CPAs) font le lien entre le système immunitaire inné et adaptatif en présentant des antigènes (Ags) étrangers aux cellules T CD4+. Pour être efficace, cette présentation nécessite que les Ags soient apprêtés et chargés de manière adéquate dans le sillon des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII). C'est uniquement dans ce contexte que les cellules T CD4+, via leur récepteur (TCR), peuvent reconnaître l'Ag et engager pleinement la réponse immunitaire adaptative. Ce processus doit être finement contrôlé pour diminuer les risques de réaction auto- immune. L'expression de CMHII est régulée à la fois au niveau transcriptionnel par le trans- activateur du CMHII (CIITA) et au niveau post-traductionnel via l’ubiquitination d'un seul résidu de lysine, situé dans la queue cytoplasmique de sa chaîne b. Dans les cellules dendritiques (DCs) et les cellules B, cette ubiquitination est dépendante de la E3 ubiquitine ligase MARCH1. La baisse d’expression de MARCH1 contribue à l'acquisition de propriétés immuno-stimulatrices qui accompagnent la maturation des DCs humaines. De plus, il a été démontré que l'absence d'ubiquitination du CMHII entraîne son accumulation excessive au niveau de la membrane plasmique, ce qui perturbe les radeaux lipidiques et les réseaux de tétraspanines chez les DCs de souris. Ces structures membranaires sont connues pour interagir avec des molécules de signalisation régulant de nombreux processus biologiques dans les cellules B, comme le récepteur des cellules B (BCR) et CD19. De surcroît, dans les cellules B naïves, les molécules de CMHII sont fortement exprimées à la surface cellulaire, même si elles sont constitutivement ubiquitinées par MARCH1. Il est également intéressant de noter que les lymphocytes B présentent l'expression la plus élevée de MARCH1 parmi toutes les cellules immunitaires et que cette expression augmente au cours de leur développement. L'impact qu’a l’ubiquitination des molécules de CMHII à la surface membranaire des lymphocytes B sur leur développement, leur activation et leurs fonctions n'a pas encore été pleinement étudié. Ici, nous montrons d'abord que l'absence d'ubiquitination du CMHII modifie fortement le pool de cellules B de la zone marginale (MZBs). Nous soutenons que cette altération peut résulter en partie de la protéotoxicité du CMHII sur les réseaux de tétraspanines contenant CD81, ce qui influe sur la dynamique de CD19 à la surface cellulaire et affecte sa capacité à activer la cascade PI3K / Akt induite par les signaux BCR dits « toniques ». L’altération du pool de cellules MZBs a également des répercussions sur la réponse immunitaire aux Ags T-indépendants de type 2 (TI-2 Ags) et sur la formation de centre germinatifs (GCs) dans la rate. Ensemble, ces effets atténuent la réponse humorale et peuvent conférer un effet protecteur contre les infections. Par exemple, nous montrons ici que les infections parasitaires à Leishmania donovani, dont l’établissement nécessite la présence de cellules B pleinement fonctionnelles, sont beaucoup mieux contrôlées en l’absence de MARCH1. Ces résultats démontrent qu’un contrôle fin de l'expression de surface du CMHII est nécessaire pour l'établissement d'un pool de cellules B variées et pleinement fonctionnelles pouvant répondre à une large gamme d'Ags. En second lieu, nous avons décrit une approche expérimentale que nous avons adaptée pour produire des outils moléculaires permettant d’identifier des partenaires d’interaction potentiels de MARCH1 dans des lignées cellulaires et des cellules B primaires. Cette approche repose sur la production de protéine de fusion qui pourront être utilisées dans des tests de liaison de proximité (BioID2). Ce projet a permis de mettre en lumière les effets importants de l'ubiquitination du CMHII sur le développement, l'activation et les fonctions des lymphocytes B. Il a également permis d’établir des bases solides pour de futures études sur de nouvelles cibles de MARCH1 qui permettront de mieux comprendre les effets biologiques de cette E3 ubiquitine ligase et leurs impacts sur la santé et les maladies. / Antigen-presenting cells (APCs) link the innate and adaptive immune system by presenting foreign antigens to CD4+ T cells. To be efficient, this presentation requires antigens to be adequately processed and loaded in the peptide groove of the major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules. It's solely in this context that CD4+ T cells, via their T cell receptor (TCR), can recognize the antigen and fully engage the adaptative immune response. This process needs to be tightly regulated to avoid autoimmunity. MHCII expression is regulated both transcriptionally by the MHCII transactivator (CIITA) and post- translationally by ubiquitination of a single lysine residue located in the cytoplasmic tail of its b-chain. This is carried out by the MARCH1 E3 ubiquitin ligases in dendritic cells (DCs) and B cells. The down-regulation of MARCH1 contributes to the acquisition of potent immunostimulatory properties that coincides with the maturation of human DCs. Accordingly, the lack of MHCII ubiquitination has been shown to result in its excessive accumulation at the plasma membrane and in the disruption of lipid rafts and tetraspanin webs in mice DCs. These membrane structures are known to interact with signaling molecules that regulate numerous biological processes in B cells, such as the B cell receptor (BCR) and CD19. Moreover, in naïve B cells, MHCII molecules are highly expressed at the cell surface even if they are constitutively ubiquitinated by MARCH1. Interestingly, B lymphocytes exhibit the highest expression of MARCH1 among all immune cells and this expression is increasing during B cells development. The impact of the ubiquitin-dependent MHCII turnover on B lymphocytes development, activation, and functions have yet to be fully addressed. Here, we first show that the absence of MHCII ubiquitination strongly alter the marginal zone (MZ) B cell pool. We provide evidence that this alteration may in part be due to the previously described MHCII proteotoxicity on the CD81-containing tetraspanin web, which impacted CD19 surface dynamic and its capacity to activate the PI3K/Akt cascade during “Tonic” BCR signaling. The altered MZ B cell pool also affected the immune response to a type 2 T-independent antigen (TI-2 Ag) and the germinal center (GC) reaction in the spleen, which dampens humoral response and may confer a protective effect against infections. As per example, we show here that parasitic infections with Leishmania donovani, the establishment of which requires the presence of fully functional B cells, are better controlled in the absence of MARCH1. These results demonstrate the need for a tight control over MHCII surface expression for the establishment of a varied and fully functional B cell pool, which are mandatory for proper responses to a broad range of antigens. Secondly, we described an experimental approach that we adapted to produce molecular tools that will allow the identification of potential interacting partners of MARCH1 in cell lines and primary B cells. This approach is based on the production of fusion proteins that can be used in proximity binding assays (BioID2). This project shed light on the important effects of MHCII ubiquitination on the development, activation, and function of B lymphocytes. It also laid the groundwork for valuable future studies on novel MARCH1 targets which will provide a better understanding of the biological effects of this E3 ubiquitin ligase and their impact on health and disease.