Wound care is a field with many treatment methods and products on the market. The healing period varies, some wounds become difficult to heal and chronic, in many cases a connection can be drawn to underlying diseases. Diabetes is a disease that could cause foot ulcers that are difficult to heal. Bioactive materials in wound care have not yet been studied to a greater extent, however it is of interest for development of new products with improved functions. Fibroblasts in the connective tissue have an important role in building and regenerating the tissue. Former studies show that the bio-ceramic calcium silicate (CS) induce tissue regeneration and promote reepithelization. It has also shown improvement of the biological functions of human epidermal stem cells and positive effects on cells in in vitro studies. The purpose of this project is to be a pre-study for further analysis of CS in wound care. The aim is to investigate additive material’s potential role in wound healing, one part will be a literature study to get an overview of the healing process of wounds and wound treatment. The other part of the study is based on three minor experiment to obtain information about how calcium silicate (CS) and CS/ β-tricalcium phosphate (β-TCP) effect human dermal fibroblasts. The method and results of literature study: The litterature study gathers information from literature and studies within the subject using the searchwords: wound, healing, biomaterials, calcium silicate, alamar blue, cell migration, recent trends, skin regeneration and diabetes. The results from the literature study demonstrates that the wound healing process is very complex and many factors must interact for good healing, some factors accelerate and inhibit healing. Furthermore, healing products with additives are already used for treatment of wounds with antibacterial and pain-relieving effects. However, only a little information about bioactive materials can be found which shows that there is lack of studies in this field. The method and results of experiments: Preparation of the two main samples: [1:10] CS in PBS together with pure water and [1:10] CS + β-TCP in PBS and pure water. The first experiment was the Inductively Coupled Plasma Optic Emission Spectroscopy (ICP-OES) made in an Optical Emission Spectrometer which detected the elements Ca 317,933 (mg/L) and Si 251,611 (mg/L) in the main samples. The second experiment was Alamar Blue which produce data about the cell survival in quantitative numbers to determine the toxicity of the diluted samples. One pre-test and two final tests (24 h apart) was made. The pre-test used the dilutions 1:2, 1:10, 1:100, and two Control Media, the pre-test indicated that CS diluted 1:2 is slightly toxic. The first final test used the dilutions 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 and one Control Media. The first final test indicated that CS diluted 1:2 is almost toxic. The second final used the dilutions 1:2, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000 and one Control Media. The second final test indicated that CS diluted 1:2 is toxic. The third experiment was a Scratch Healing assay. This experiment struggled with learning how to count cells which made the analysis of this experiment difficult. The results of the Scratch healing assay shows cell migration through a before-picture right after the simulated scratch is made and a picture 24 hours after. In conclusion, two important parameters while investigating the direction of further research are toxicity and cell survival. CS as a bioactive material and additive in wound treatment could be possible but should be avoided when diluted 1:2 due to its toxicity shown in the Alamar blue test. The scratch healing assay showed that the fibroblasts migrate to some extent while interacting in solutions of CS.

A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, estes biomateriais sofrem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com sua superfície, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto. O objetivo deste estudo foi avaliar se as alterações no padrão de marcação para as proteínas citoesqueléticas actina e tubulina observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Células osteogênicas foram obtidas a partir da digestão enzimática de calvárias de ratos Wistar recémnascidos e plaqueadas sobre superfícies de Bioglass® 45S5, Biosilicato® e borosilicato (controle bioinerte) para a avaliação dos seguintes parâmetros: 1) detecção de actina e tubulina por microscopia de fluorescência; 2) expressão de RNAm para actina e tubulina por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real time PCR); 3) quantificação de actina e tubulina por ensaio imunoenzimático direto (ELISA), e 4) análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Aos 3 e 7 dias, células crescidas sobre borosilicato exibiam padrões de marcação para actina e tubulina típicos de células aderidas e espraiadas sobre substratos planos in vitro, enquanto que sobre Bioglass® 45S5 e Biosilicato® as células apresentavam áreas circulares destituídas de marcação para essas proteínas. Nos mesmos períodos, culturas crescidas sobre os materiais bioativos apresentavam alterações significantes da expressão de RNAm para actina e tubulina, embora fossem observadas apenas discretas variações na quantidade das proteínas correspondentes em relação ao borosilicato. Além disso, apenas para culturas crescidas sobre borosilicato observava-se correlação positiva entre RNAm e proteína e correspondência entre as observações por epifluorescência e os dados quantitativos. Aos 3 dias, imagens de MEV revelaram células aderidas e espraiadas sobre os materiais bioativos, parcial ou totalmente recobertas por acúmulos de material de aspecto semelhante ao da topografia do substrato, por vezes impedindo a visualização dos limites celulares. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as superfícies bioativas de Bioglass® 45S5 e Biosilicato® afetam a expressão de RNAm para actina e tubulina, mas não de proteína. Assim, as alterações nos padrões de marcação por fluorescência para essas proteínas devem ser atribuídas, pelo menos em parte, a acúmulos de material sobre as células, possivelmente decorrentes das reações de superfície a que estão submetidos Bioglass® 45S5 e Biosilicato® quando em contato com fluidos biológicos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been successfully applied in various therapeutic strategies to promote the formation of mineralized matrix in bone defects. The exposure of these materials to biological fluids results in chemical and topographical modifications that may affect the interactions of cells with the biomaterial surface, with potential effects on cytoskeletal protein expression and/or organization and cell spreading. The aim of the present study was to evaluate whether changes in the labelling pattern for the cytoskeletal proteins actin and tubulin in osteogenic cells cultured on bioactive Bioglass® 45S5 and Biosilicate® are due to altered mRNA and protein expression levels. Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn Wistar rat calvarial bone and plated on Bioglass® 45S5, Biosilicate® and borosilicate (bioinert control) for periods of up to 7 days. The following parameters were assayed: i) qualitative epifluorescence analysis of actin and tubulin distribution; ii) quantitative mRNA expression for actin and tubulin by real time polymerase chain reaction (real time PCR); iii) quantitative actin and tubulin expression by enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA), and iv) qualitative analysis of cell morphology by scanning electron microscopy (SEM). At days 3 and 7, cells grown on borosilicate showed typical actin and tubulin labeling patterns of adherent and spread cells on flat, rigid substrates, whereas those on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® showed dark areas devoid of fluorescent signals for the cytoskeletal proteins. At the same time points, cultures grown on the bioactive materials showed significant changes in mRNA expression for actin and tubulin, although only slight differences in the amount of actin and tubulin were detected compared with borosilicate. Moreover, a positive correlation between mRNA and protein expression levels as well as a correspondence between epifluorescence imaging and the quantitative data were only detected for cultures grown on borosilicate. SEM analysis revealed that cells cultured on bioactive surfaces were partly or totally covered with material accumulations, whose characteristics resembled the ones for the substrate topography, and which, in some cases, prevented the visualization of the cell limits. In conclusion, Bioglass® 45S5 and Biosilicate® affect actin and tubulin mRNA levels, but not the corresponding protein expression, in osteogenic cell cultures. Thus, the observed changes in the labeling pattern for these proteins should be attributed, at least in part, to the accumulation of materials on the cell surface, likely due to substrate reactions that take place on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® when exposed to the cell culture medium.

A implantação de materiais vítreos e vitrocerâmicos bioativos representa estratégia terapêutica importante para se promover a formação de matriz extracelular mineralizada em defeitos ósseos críticos. Quando expostos a fluidos biológicos, estes biomateriais sofrem alterações químicas e topográficas de superfície que afetam as interações de células com sua superfície, reduzindo o espraiamento celular e alterando o padrão de marcação de proteínas do citoesqueleto. O objetivo deste estudo foi avaliar se as alterações no padrão de marcação para as proteínas citoesqueléticas actina e tubulina observadas in vitro em células osteogênicas sobre superfícies do vidro Bioglass® 45S5 e da vitrocerâmica Biosilicato®, são decorrentes de redução quantitativa na expressão do RNAm e das proteínas correspondentes. Células osteogênicas foram obtidas a partir da digestão enzimática de calvárias de ratos Wistar recémnascidos e plaqueadas sobre superfícies de Bioglass® 45S5, Biosilicato® e borosilicato (controle bioinerte) para a avaliação dos seguintes parâmetros: 1) detecção de actina e tubulina por microscopia de fluorescência; 2) expressão de RNAm para actina e tubulina por reação em cadeia da polimerase em tempo real (Real time PCR); 3) quantificação de actina e tubulina por ensaio imunoenzimático direto (ELISA), e 4) análise da morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Aos 3 e 7 dias, células crescidas sobre borosilicato exibiam padrões de marcação para actina e tubulina típicos de células aderidas e espraiadas sobre substratos planos in vitro, enquanto que sobre Bioglass® 45S5 e Biosilicato® as células apresentavam áreas circulares destituídas de marcação para essas proteínas. Nos mesmos períodos, culturas crescidas sobre os materiais bioativos apresentavam alterações significantes da expressão de RNAm para actina e tubulina, embora fossem observadas apenas discretas variações na quantidade das proteínas correspondentes em relação ao borosilicato. Além disso, apenas para culturas crescidas sobre borosilicato observava-se correlação positiva entre RNAm e proteína e correspondência entre as observações por epifluorescência e os dados quantitativos. Aos 3 dias, imagens de MEV revelaram células aderidas e espraiadas sobre os materiais bioativos, parcial ou totalmente recobertas por acúmulos de material de aspecto semelhante ao da topografia do substrato, por vezes impedindo a visualização dos limites celulares. Com base nos resultados obtidos, conclui-se que as superfícies bioativas de Bioglass® 45S5 e Biosilicato® afetam a expressão de RNAm para actina e tubulina, mas não de proteína. Assim, as alterações nos padrões de marcação por fluorescência para essas proteínas devem ser atribuídas, pelo menos em parte, a acúmulos de material sobre as células, possivelmente decorrentes das reações de superfície a que estão submetidos Bioglass® 45S5 e Biosilicato® quando em contato com fluidos biológicos. / Bioactive glasses and glass-ceramics have been successfully applied in various therapeutic strategies to promote the formation of mineralized matrix in bone defects. The exposure of these materials to biological fluids results in chemical and topographical modifications that may affect the interactions of cells with the biomaterial surface, with potential effects on cytoskeletal protein expression and/or organization and cell spreading. The aim of the present study was to evaluate whether changes in the labelling pattern for the cytoskeletal proteins actin and tubulin in osteogenic cells cultured on bioactive Bioglass® 45S5 and Biosilicate® are due to altered mRNA and protein expression levels. Osteogenic cells were obtained by enzymatic digestion of newborn Wistar rat calvarial bone and plated on Bioglass® 45S5, Biosilicate® and borosilicate (bioinert control) for periods of up to 7 days. The following parameters were assayed: i) qualitative epifluorescence analysis of actin and tubulin distribution; ii) quantitative mRNA expression for actin and tubulin by real time polymerase chain reaction (real time PCR); iii) quantitative actin and tubulin expression by enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA), and iv) qualitative analysis of cell morphology by scanning electron microscopy (SEM). At days 3 and 7, cells grown on borosilicate showed typical actin and tubulin labeling patterns of adherent and spread cells on flat, rigid substrates, whereas those on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® showed dark areas devoid of fluorescent signals for the cytoskeletal proteins. At the same time points, cultures grown on the bioactive materials showed significant changes in mRNA expression for actin and tubulin, although only slight differences in the amount of actin and tubulin were detected compared with borosilicate. Moreover, a positive correlation between mRNA and protein expression levels as well as a correspondence between epifluorescence imaging and the quantitative data were only detected for cultures grown on borosilicate. SEM analysis revealed that cells cultured on bioactive surfaces were partly or totally covered with material accumulations, whose characteristics resembled the ones for the substrate topography, and which, in some cases, prevented the visualization of the cell limits. In conclusion, Bioglass® 45S5 and Biosilicate® affect actin and tubulin mRNA levels, but not the corresponding protein expression, in osteogenic cell cultures. Thus, the observed changes in the labeling pattern for these proteins should be attributed, at least in part, to the accumulation of materials on the cell surface, likely due to substrate reactions that take place on Bioglass® 45S5 and Biosilicate® when exposed to the cell culture medium.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2923.pdf: 9264279 bytes, checksum: 86047341701bdb7e402b715fb158961b (MD5) Previous issue date: 2009-12-21 / Financiadora de Estudos e Projetos / Fractures of delayed consolidation and fractures with non-union are commonly found in medical practice and are associated with high morbidity and mortality. Within this context, biochemical and biophysical resource have been studied in an attempt enhance bone healing. Among these may be highlighted the use of bioactive materials and low level laser therapy (LLLT). Several studies suggest that both resources are able to stimulate proliferation of osteoblasts and osteogenesis at the fracture site, promoting a greater deposition of bone mass and accelerating the process of consolidation. So the main purpose of the present work was to evaluate the effects of low-intensity laser (λ = 830nm), with fluencies of 60J/cm² and 120J/cm² and a bioactive ceramic, Biosilicato®, used alone or associated on bone consolidation of the tibial fractures in healthy rats. For the study 60 male Wistar rats were randomly divided in 6 groups: group bone defect control (GCF); group bone defect irradiated with LLLT, at 60 J/cm2 (GL60); group bone defect irradiated with LLLT, at 120 J/cm2 (GL120); group bone defect filled with Biosilicate® (GB); group bone defect filled with Biosilicate® , irradiated with LLLT, at 60 J/cm2 (GB60); and group bone defect filled with Biosilicate®, irradiated with LLLT, at 120 J/cm2 (GB120). A low-energy GaAlAs 830nm, CW, 100 mW, 60 and 120 J.cm² was used in this study. The rats were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine and xylazine 2% and a standardized 2.0-mm-diameter bone defect was created by using a motorized drill under copious irrigation with saline solution. Laser irradiation was initiated immediately after the surgery procedure and it was performed every 48 h for 14 days. After 14 day post-surgery, biomechanical analysis revealed no statistical differences between experimental groups. However, the morphological and morphometric analysis showed that the laser, in the two fluencies evaluated showed values statistically higher than control group and the Biosilicate®. Interestingly, the groups treated with Biosilicate® and laser, in two fluencies, showed statistically lower values of newly formed bone in the area of the defect even when compared with the control group. The scanning electron microscopy showed an intense presence of the biomaterial in bone defects of their animals. From the results obtained in this study, we concluded that the low-intensity laser was more effective in the process of bone repair when compared with biomaterial or the two resources associated. / Fraturas com atraso na consolidação e fraturas com não-união óssea são comumente encontradas na prática médica e estão associadas a altos índices de morbidade e mortalidade. Dentro deste contexto, recursos biofísicos e bioquímicos têm sido estudados na tentativa de minimizar o tempo de consolidação óssea. Dentre estes, podem ser destacados o uso dos materiais bioativos e do laser terapêutico de baixa potência (LLLT). Vários estudos sugerem que ambos os recursos são capazes de estimular a proliferação de osteoblastos e a osteogênese no local da fratura, promovendo uma maior deposição de massa óssea e acelerando o processo de consolidação. Diante disso, este estudo teve o objetivo de verificar os efeitos do laser de baixa intensidade (λ = 830nm), com fluências de 60J/cm² e 120J/cm² e de uma vitrocerâmica bioativa, Biosilicato®, utilizados independentemente ou associados na consolidação óssea de fraturas tibiais em ratos saudáveis. Para o estudo, foram utilizados 60 ratos, da linhagem Wistar, distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos: grupo GCF: controle, com fratura e sem tratamento; grupo GL60: fratura tratado com LLLT, fluência de 60J/cm²; grupo GL120: fratura tratado com LLLT, fluência de 120J/cm²; grupo GB: fratura tratado com Biosilicato®; grupo GB60: fratura tratado com Biosilicato® e LLLT, fluência de 60J/cm² e grupo GB120: fratura tratado com Biosilicato® e LLLT, fluência de 120J/cm². Foi utilizado um laser de baixa potência As-Ga-Al, 830nm, CW, 100 mW, 60 e120 J/cm². Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitonial de Ketamina e Xilasina. Em seguida, realizou-se defeitos ósseos de 2mm de diâmetro nas tíbias dos animais. A irradiação laser iniciou-se imediatamente após a cirurgia e a cada 48 horas totalizando, 7 aplicações em 14 dias. O sacrifício foi realizado no 14º dia. A análise biomecânica das tíbias não revelou diferenças estatísticas entre os grupos experimentais. No entanto, a análise morfológica e morfométrica revelaram que o grupo laser, nas duas fluências avaliadas, apresentou valores estatisticamente maiores que o grupo controle e o grupo Biosilicato®. Interessante, os grupos tratados com a associação do biomaterial e laser, nas duas fluências, apresentaram valores estatisticamente menores de osso neoformado, mesmo quando comparados ao grupo controle. A microscopia eletrônica de varredura mostrou uma intensa presença do biomaterial nos defeitos ósseos dos respectivos animais. A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que o laser terapêutico de baixa potência foi mais eficaz no processo de reparo ósseo quando comparado ao biomaterial, ou mesmo com as duas modalidades de tratamento associadas.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2329.pdf: 1318463 bytes, checksum: 91365257065327c5dbaf7e6100a4e5b1 (MD5) Previous issue date: 2009-12-21 / Universidade Federal de Sao Carlos / Fractures of delayed consolidation and fractures with non-union are commonly found in medical practice and are associated with high morbidity and mortality. Within this context, biochemical and biophysical resource have been studied in an attempt enhance bone healing. Among these may be highlighted the use of bioactive materials and low level laser therapy (LLLT). Several studies suggest that both resources are able to stimulate proliferation of osteoblasts and osteogenesis at the fracture site, promoting a greater deposition of bone mass and accelerating the process of consolidation. So the main purpose of the present work was to evaluate the effects of low-intensity laser (λ = 830nm), with fluencies of 60J/cm² and 120J/cm² and a bioactive ceramic, Biosilicato®, used alone or associated on bone consolidation of the tibial fractures in healthy rats. For the study 60 male Wistar rats were randomly divided in 6 groups: group bone defect control (GCF); group bone defect irradiated with LLLT, at 60 J/cm2 (GL60); group bone defect irradiated with LLLT, at 120 J/cm2 (GL120); group bone defect filled with Biosilicate® (GB); group bone defect filled with Biosilicate® , irradiated with LLLT, at 60 J/cm2 (GB60); and group bone defect filled with Biosilicate®, irradiated with LLLT, at 120 J/cm2 (GB120). A low-energy GaAlAs 830nm, CW, 100 mW, 60 and 120 J.cm² was used in this study. The rats were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine and xylazine 2% and a standardized 2.0-mm-diameter bone defect was created by using a motorized drill under copious irrigation with saline solution. Laser irradiation was initiated immediately after the surgery procedure and it was performed every 48 h for 14 days. After 14 day post-surgery, biomechanical analysis revealed no statistical differences between experimental groups. However, the morphological and morphometric analysis showed that the laser, in the two fluencies evaluated showed values statistically higher than control group and the Biosilicate®. Interestingly, the groups treated with Biosilicate® and laser, in two fluencies, showed statistically lower values of newly formed bone in the area of the defect even when compared with the control group. The scanning electron microscopy showed an intense presence of the biomaterial in bone defects of their animals. From the results obtained in this study, we concluded that the low-intensity laser was more effective in the process of bone repair when compared with biomaterial or the two resources associated. / Fraturas com atraso na consolidação e fraturas com não-união óssea são comumente encontradas na prática médica e estão associadas a altos índices de morbidade e mortalidade. Dentro deste contexto, recursos biofísicos e bioquímicos têm sido estudados na tentativa de minimizar o tempo de consolidação óssea. Dentre estes, podem ser destacados o uso dos materiais bioativos e do laser terapêutico de baixa potência (LLLT). Vários estudos sugerem que ambos os recursos são capazes de estimular a proliferação de osteoblastos e a osteogênese no local da fratura, promovendo uma maior deposição de massa óssea e acelerando o processo de consolidação. Diante disso, este estudo teve o objetivo de verificar os efeitos do laser de baixa intensidade (λ = 830nm), com fluências de 60J/cm² e 120J/cm² e de uma vitrocerâmica bioativa, Biosilicato®, utilizados independentemente ou associados na consolidação óssea de fraturas tibiais em ratos saudáveis. Para o estudo, foram utilizados 60 ratos, da linhagem Wistar, distribuídos aleatoriamente nos seguintes grupos: grupo GCF: controle, com fratura e sem tratamento; grupo GL60: fratura tratado com LLLT, fluência de 60J/cm²; grupo GL120: fratura tratado com LLLT, fluência de 120J/cm²; grupo GB: fratura tratado com Biosilicato®; grupo GB60: fratura tratado com Biosilicato® e LLLT, fluência de 60J/cm² e grupo GB120: fratura tratado com Biosilicato® e LLLT, fluência de 120J/cm². Foi utilizado um laser de baixa potência As-Ga-Al, 830nm, CW, 100 mW, 60 e120 J/cm². Os ratos foram anestesiados por injeção intraperitonial de Ketamina e Xilasina. Em seguida, realizou-se defeitos ósseos de 2mm de diâmetro nas tíbias dos animais. A irradiação laser iniciou-se imediatamente após a cirurgia e a cada 48 horas totalizando, 7 aplicações em 14 dias. O sacrifício foi realizado no 14º dia. A análise biomecânica das tíbias não revelou diferenças estatísticas entre os grupos experimentais. No entanto, a análise morfológica e morfométrica revelaram que o grupo laser, nas duas fluências avaliadas, apresentou valores estatisticamente maiores que o grupo controle e o grupo Biosilicato®. Interessante, os grupos tratados com a associação do biomaterial e laser, nas duas fluências, apresentaram valores estatisticamente menores de osso neoformado, mesmo quando comparados ao grupo controle. A microscopia eletrônica de varredura mostrou uma intensa presença do biomaterial nos defeitos ósseos dos respectivos animais. A partir dos resultados obtidos neste estudo, pode-se concluir que o laser terapêutico de baixa potência foi mais eficaz no processo de reparo ósseo quando comparado ao biomaterial, ou mesmo com as duas modalidades de tratamento associadas.