Plant growth regulators have a vital role in plant growth and development. The cellular response to these regulators depends on the presence and the action of specific receptors. The plant growth regulators and their receptors act together in complexes which determine the final effects of the plant growth regulators. In the research reported here, emphasis has been given to the regulation of the activity of the receptors themselves. The regulation of the N-l-naphthylphthalamic acid (N~A) receptor through phosphorylation and dephosphorylation and the regulation of the auxin binding protein (ABP) through gene manipulation have been investigated. NPA, an auxin transport inhibitor, was found to bind specifically to a crude membrane preparation from sugar beet seedling leaf cell suspension cultures. The in vitro binding was optimal at pH 4.5 and 4?C. Binding parameters for NP A binding were determined by Scatchard analysis. The dissociation constant (Kd) and binding protein concentration were found to be 1.71 x 10-7 mol dm-3 and 220 pmoles g-I membrane protein respectively. It was found that the amount of specific 3H-NPA binding was significantly increased by adding Mg2+ A TP to the binding assay solution; treatment of membrane preparations with acid phosphatase, prior to the NP A binding assay, resulted in lower specific binding. A TP activation and phosphatase inactivation were culture stage dependent. Although a considerable effect could be detected when using cells from day 8 (representing the linear phase), the same treatment did not alter the binding if cells from day I (representing lag phase) or day 14 (representing the stationary phase) were used. These observations have strongly highlighted the possible involvement of a phosphorylation and dephosphorylation mechanism in vivo in the regulation of the activity of the NP A receptor. High phosphatase activity was found in the supernatant, but not in the membrane pellet, after 50,000 g centrifugation. The presence of a membrane-bound auxin receptor, ABP, was demonstrated by Scatchard analysis in sugar beet seedlings. The Kd value and the receptor concentration were found to be 2.15 x 10-6 mol dm-3 and 68 pmoles g-I membrane protein. The protein could be solubilised either with the detergent Triton X-I 00 or by acetone-washing, with a recovery of about 40%. An acetone-solubilised ABP preparation could be partially purified by DEAE-Sephacel ion exchange chromatography, NAA-linked AH-Sepharose 4B affmity chromatography or Sephadex G-200 gel filtration. The recovery after any of these chromatographic treatments was very low so that successive chromatography for further purification was unsuccessful. The low level of detectable binding after purification resulted mainly from the low abundance of ABP in the plant material. Non-radioactive labelling and detection techniques were used to show that an ABP-probe hybridized to sugar beet genomic DNA during dot blotting. The present study has indicated that receptor activity could be regulated by a phosphorylation and dephosphorylation mechanism in plants. The investigation has also suggested that the effect of plant growth regulators on plant development could be regulated through the manipulation of the expression of their receptor genes.

Cette thèse avait pour but de déterminer les facteurs de contrôle du bactérioplancton suivant un gradient d'entrophisation. Dans une première étape des données de dynamiques saisonnières bactériennes, biologiques et physicochimiques ont été collectées. Puis, dans une seconde étape, l'impact des facteurs ascendants (ressources) et descendants (prédateurs) a été déterminé par des expériences in situ. La dynamique saisonnière bactérienne apparaît identique quel que soit le niveau trophique et les facteurs ascendants apparaissent prépondérants. Les expérimentations in situ ont montré que les dynamiques bactériennes sont fortement contrôlées par les ressources, même dans le milieu eutrophe. Alors que les prédateurs ont peu d'impact sur ces dynamiques. Les activités enzymatiques semblent dépendre plus des nutriments que de la diversité bactérienne. La prédation apparaît tel un contrôle de maintient de la diversité en limitant l'abondance des bactéries les plus compétitives

Au sein des cellules eucaryotes, l'ADN est compacté sous la forme de chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. Cette structure protéique protège l'ADN des agressions oxydantes et a un rôle essentiel dans la régulation des processus nucléaires. Ce travail a pour objectif de mieux comprendre les mécanismes de remodelage de la chromatine. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'interaction entre les protéines du nucléosome que sont les histones H3 et H4 et le chaperon d'histones Asf1. Nous avons résolu par RMN la structure du complexe entre Asf1 et les histones. Ce travail a constitué une base pour, d'une part, analyser la fonction de cette interaction in vivo et, d'autre part, initier la conception de peptides inhibiteurs spécifiques de cette interaction et anti-tumoraux potentiels. Au cours de ce travail, nous avons également développé une méthode in vitro d'étude des mécanismes moléculaires d'assemblage et de désassemblage de nucléosomes par Asf1.

Les canaux ioniques occupent une place primordiale dans les mécanismes du vivant, et leurs dysfonctionnements sont à l'origine de nombreuses pathologies. Dans l'optique d'envisager un traitement efficace de ces maladies, la compréhension des mécanismes de fonctionnement des canaux ioniques constitue un objectif majeur à atteindre. Les toxines animales actives sur les canaux ioniques apparaissent aujourd'hui comme un outil de choix pour mieux comprendre le fonctionnement de ces canaux. Au travers de son introduction bibliographique, ce manuscrit présente les canaux K+, Na+ et Ca2+ et les toxines animales dont ces canaux sont les cibles naturelles. Ces toxines s'organisent majoritairement autour de deux motifs structuraux distincts : le motif CsΑΒ (Cystine stabilized ΑΒ motif), décrit principalement dans les toxines de scorpion actives sur les canaux K+ et Na+, et le motif ICK (Inhibitor Cystine Knot) qui est rencontré dans certaines toxines de cônes et d'araignées actives sur les canaux K+, Na+ ou Ca2+. Le travail effectué au cours de cette thèse est sous-tendu par un objectif, améliorer encore la connaissance et la compréhension de l'interaction d'une toxine et de sa cible, le canal. Les résultats obtenus s'articulent autour de la détermination de la structure RMN de plusieurs toxines. Concernant le motif CsΑΒ, nos résultats montrent que, par conception de protéines chimères, nous pouvons modifier la spécificité et/ou la sélectivité des toxines envers les canaux K+. Concernant le motif ICK, nos résultats pour les toxines actives sur les canaux K+ doivent être confirmés par des études complémentaires puisque la structure indique que ces toxines semblent interagir au niveau du pore du canal, hypothèse en contradiction avec les données biologiques ; pour les toxines actives sur les canaux Ca2+, la spécificité envers les différents types de canaux et l'influence de l'anisotropie de répartition des charges électrostatiques sur l'interaction toxine/canal sont discutées.

La peau constitue la première barrière de défense de l'organisme face aux agressions physiques, chimiques et biologiques de l'environnement. Le rôle protecteur de la peau face aux rayonnements solaires ultraviolets, qui constituent la source majeure de dommages de l'ADN des cellules de l'épiderme, est généralement obtenu par la synthèse de la mélanine. La réponse pigmentaire repose ainsi sur la coopération cellulaire observée principalement entre les mélanocytes et les kératinocytes avoisinants. Les mécanismes moléculaires mis en jeu font intervenir les voies classiques de la pigmentation constitutive, déterminant le phototype propre à chaque individu ainsi qu'une voie de signalisation spécifique de la réponse UV. L'implication de la voie de signalisation p38, stress-dépendante, et du facteur de transcription USF-1 dans la régulation de l'expression du gène Tyrosinase, nous a conduit à étudier le rôle du facteur de transcription dans la réponse pigmentaire (Galibert et al., EMBO, 2001). Un ensemble d'expériences (RT-PCR-Quantitative, Immuno-Précipitation de la chromatine, Transfection transitoire...) réalisé in vitro et in vivo (culture cellulaire ou biopsies humaines) et complété d'une approche génétique utilisant une lignée mélanocytaire invalidé pour le gène USF-1, nous a permis d'établir un modèle de régulation de la pigmentation UV induite (Corre et al., JBC, 2004 ; Corre et al., soumis). Enfin, la mise en évidence d'une nouvelle modification post-traductionnelle de la protéine USF-1 en réponse à un stress, dose et temps dépendant, permet d'envisager un nouveau mode de régulation des gènes régulés par USF- 1 (Corre et Galibert, PCR, 2005 ; Corre et al, en préparation). L'ensemble des données obtenues au cours de ma thèse complètent et précisent la fonction du facteur de transcription USF-1 dans la réponse aux stress et suggère un rôle dans le processus tumoral des mélanomes.

Tétracyclines (TC) sont une famille d'antibiotiques important, qui se lient SPECI ャ ... allié aux protéines du ribosome et solidaire. Le mécanisme le plus important de la résistance à la tétracycline est régie par sa reliure en Tc: Mg2 + complexe à la protéine Tet Repressor (TetR). Il est donc d'intérêt pour améliorer notre compréhension des deux Tc: TetR et Tc: liaison au ribosome. Les structures cristallines des tétracyclines dans plusieurs complexes avec les protéines et les ribosomes ont fourni des informations essentielles. Une approche complémentaire consiste à développer des modèles de simulation par ordinateur, qui peut être utilisée pour étudier la structure, la dynamique et la thermodynamique de Tc: protéines ou Tc: complexes ribosome. Malgré son importance, à la tétracycline a rarement été soumis à la modélisation informatique, en partie en raison de la nécessité de ャ> St développer un modèle de mécanique moléculaire pour le TC. Ici, nous avons développé un tel modèle, de manière à être compatible avec le ャ CHARMM27 force »ld pour les protéines et les acides nucléiques, de 12 analogues de tétracycline importants, notamment la tétracycline plaine. paramètres ld ャ forces intermoléculaires ont été dérivées de supermolécule une approche standard. Le modèle reproduit la géométrie ab initio et Fxibility ャ de chaque Tc. Comme les tests, nous avons fait des simulations d'un cristal de Tc, Tc: Mg2 + et Tc: complexes Ca2 + en solution aqueuse, et d'un complexe solvaté entre TC: Mg2 + et le TetR. Le modèle se compare bien avec un large corpus de données expérimentales. Nous ャ> St utilisé notre modèle pour l'étude Tc: reconnaissance TetR qui est un problème complexe. Nous avons utilisé des simulations d'énergie libre pour étudier les interactions électrostatiques entre la protéine et ligand et le rôle éventuel de ャ induite "en Tc contraignant. Nous avons constaté que la tétracycline préfère une étendue, l'état zwitterioniques fois en solution et en complexe avec la protéine. Tc est donc préorganisés pour la reliure. En l'absence de Tc, TetR est étroitement liée à son ADN opérateur; lors de la liaison de Tc il se dissocie de l'ADN, permettant l'expression des gènes réprimés. Son contrôle serré par Transports Canada fait TetR largement utilisables dans le génie génétique. Le Tc site de liaison est plus de 20 ヒ A partir de l'ADN, de sorte que le signal de liaison doivent se propager sur une longue distance. Nous utilisons des simulations de dynamique moléculaire et calculs continuum électrostatique pour élucider le mécanisme allostérique. Lorsque [TC: Mg] lie +, l'ion Mg2 + permet des interactions avec hélice 8 de TetR un monomère et Helix 6 de l'autre monomère, et Helix 6 est tiré en direction du noyau central de la structure. Hy- interactions drophobic avec hélice 6 puis tirez hélice 4 dans un mouvement pendulaire, avec un déplacement maximum à son extrémité N-terminale: l'interface de l'ADN. Le résidu N-terminal de l'hélice 4, Lys48, est très conservée dans l'ADN de liaison des protéines régulatrices de la classe TetR et fait la plus grande contribution de tout acide aminé à l'TetR: l'ADN d'énergie libre contraignant. Ainsi, les changements de conformation conduire à une réduction drastique de la TetR: la liaison d'un ADN lité ャハ, permettant TetR se détacher de l'ADN. Nous avons ensuite utilisé le modèle pour l'étude Tc liaison au ribosome et de facteur d'élongation Tu (EF-Tu). Les structures cristallines de Tc lié à la Thermus thermophilus 30S sous-unité montrer le même site Tc primaire obligatoire (appelé TET1), avec la plus forte densité d'électrons Tc, à proximité du site A-, compatible avec un rôle inhibiteur. Un site secondaire Tc-contraignant, TET5 appelé a également été observée dans les deux structures. Nous avons fait de la dynamique moléculaire (MD) des simulations de sous-unités 30S du ribosome pour caractériser Tc contraignant et aider à résoudre l'ambiguïté en ce qui concerne le nombre et la force de Tc sites de liaison. Nous avons présenté des preuves pour les lier à TET1 prédominante, indiquant que d'autres sites de liaison signalés sont plus faibles et pas très occupés à des concentrations physiologiques Tc. Récemment, la structure cristalline d'un complexe entre le facteur d'allongement Tu (EF-Tu) et Tc a été résolu, ce qui soulève la question de savoir si Tc 窭 冱 contraignant à EF-Tu a un rôle dans l'inhibition de la synthèse protéique. Nous montrons que la contribution directe de EF-Tu à l'énergie libre de Tc contraignant à l'EF-Tu: PIB: complexe Mg est négligeable, mais plutôt la liaison peut être attribuée uniquement à Tc interactions avec l'ion Mg et le phosphate PIB groupes . Nous montrons aussi que EF-Tu ne présente pas de préférence contraignant pour le TC sur la non-antibiotiques, 4-dedimethyl-Tc, et EF-Tu ne lie pas la tigécycline analogique Tc, qui est un antibiotique puissant. Globalement, nos résultats appuient l'idée que les EF-Tu n'est pas la cible principale de la tétracycline. Les articles présentés ci-dessous comprennent à la fois de calcul et les résultats expérimentaux. Tout le travail expérimental a été réalisé par Winfried Hinrichs et ses collabora-teurs. Tout le travail de calcul a été fait par moi-même. Les connaissances acquises dans ce travail et les techniques de modélisation employées doivent être d'intérêt pour l'amélioration des techniques antibiotiques Tc et TetR protéines améliorées pour la régulation des gènes.

La maturation des ARN pré-messagers est le fruit d'un ensemble de processus nucléaires interconnectés qui sont soumis à de nombreuses régulations. L'épissage alternatif des exons 3' terminaux joue un rôle majeur dans l'expression des gènes car il permet de réguler qualitativement et quantitativement leur expression. Nous étudions les déterminants de la régulation tissulaire de l'épissage et de la polyadénylation en utilisant comme modèle le gène de la tropomyosine α de xénope. Ce gène contient, dans sa région 3' terminale, un exon composite interne/3' terminal nommé 9A9' qui est utilisé comme exon 3' terminal dans les somites et est sauté dans les tissus non musculaires dans l'embryon de xénope. L'utilisation de minigènes contenant une portion de la région 3' terminale du gène de la tropomyosine α placée sous le contrôle de promoteurs tissuspécifiques a permis d'identifier deux éléments introniques régulant l'utilisation de l'exon 9A9'. L'un nommé 150PY est répresseur, l'autre appelé UTE est activateur. L'élément 150PY réprime l'utilisation de l'exon 9A9' dans les cellules non musculaires. Des approches biochimiques et in vivo ont montré que la protéine PTB se fixe sur cet élément et inhibe les réactions d'épissage et de clivage/polyadénylation de l'exon 9A9'. Afin de caractériser la fonction de l'élément activateur UTE, nous avons bloqué son accessibilité dans les embryons à l'aide d'oligonucléotides morpholinos antisens. Nos résultats montrent que l'UTE active l'utilisation de l'exon 9A9' en tant qu'exon 3' terminal en favorisant la reconnaissance du site 3' d'épissage, du signal de polyadénylation et du point de branchement. Ces résultats suggèrent que l'UTE favorise la fixation de la snRNPU2 sur le point de branchement qui à son tour stabilise la liaison du complexe de clivage/polyadénylation sur le signal de polyadénylation permettant ainsi la définition de l'exon 9A9' en tant qu'exon terminal. La PTB prévient l'utilisation de l'UTE dans les cellules non musculaires à l'inverse de certaines protéines SR qui favorisent la sélection de l'exon 9A9' de manière dépendante de cette séquence. Pour caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la fonction de l'UTE nous avons recherché les facteurs recrutés sur cette séquence. Ces expériences montrent que la protéine ESRP2 est spécifiquement recrutée sur un ARN contenant l'UTE en présence de PTB. ESRP2 est exprimée uniquement dans les cellules épithéliales et pourrait participer avec la PTB à la spécificité tissulaire de la répression de l'exon 9A9'. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la régulation tissulaire de l'exon 9A9' est basée sur une compétition de fixation entre des facteurs activateurs et inhibiteurs sur la séquence régulatrice UTE.

Ces travaux portent sur la production de caroténoïdes aromatiques par des bactéries non photosynthétiques. Les trois bactéries retenues pour cette étude sont Brevibacterium linens, Streptomyces mediolani et Mycobacterium aurum. Ces bactéries sont connues pour produire les mêmes caroténoïdes aromatiques à savoir l'isoréniératène et ses dérivés hydroxylés. La voie de biosynthèse de ces pigments est décrite jusqu'au stade isoréniératène, l'étape ultérieure permettant la formation de caroténoïdes hydroxylés constitue le sujet de cette étude.<br />Dans un premier temps, les pigments produits par ces bactéries sont étudiés par HPLC et LCMS. Ces études ont montré que B. linens et S. mediolani synthétisent majoritairement du 3,3'-di-hydroxy-isoréniératène. Elles ont également révélé l'absence de ce composé chez M. aurum. Contrairement à ce qui est décrit dans la littérature cette bactérie accumule un caroténoïde de masse moléculaire supérieure à celle du di-hydroxy-isoréniératène. Une purification a été entreprise pour une analyse en RMN mais les faibles quantités obtenues n'ont pas permis la détermination de la structure. <br />Dans un second temps, la réaction d'hydroxylation, dernière étape dans la biosynthèse de ces caroténoïdes a été étudiée. On cherche à identifier le type d'enzyme et le substrat de cette étape. L'utilisation d'inhibiteurs spécifiques de cytochrome P450 dans les cultures bactériennes se traduit par l'accumulation d'isoréniératène et la disparition des formes hydroxylées chez B. linens et S. mediolani. Ces résultats montrent l'implication d'un cytochrome P450 dans l'hydroxylation de l'isoréniératène pour ces bactéries. <br />Le cluster de la caroténogénèse a été récemment séquencé et identifié chez les trois bactéries étudiées. Seul le cluster de B. linens comporte un gène (orf 10) pouvant coder une hydroxylase qui présente un motif caractéristique d'un cytochrome P450, cependant son implication dans l'hydroxylation des caroténoïdes aromatiques n'est pas précisée. <br />Une série de mutagénèse aléatoire par rayonnement U.V. a été entreprise sur B. linens. Elle a permis d'obtenir un mutant noté BLMJ. Les analyses HPLC et LCMS des pigments produits par BLMJ montrent qu'il accumule très majoritairement de l'isoréniératène. Le système responsable de l'hydroxylation de l'isoréniératène de BLMJ apparaît défectueux. L'analyse de la séquence de l'ORF 10 de BLMJ révèle la présence d'une mutation au niveau de l'acide aminé 84 où la phénylalanine est remplacée par une sérine. Après comparaison avec des structures 3D de P450 connus il semblerait que cet acide aminé soit important dans la stabilisation du groupement prosthétique de l'enzyme. Sa mutation entraînerait donc une perte d'activité de l'enzyme. <br />Pour s'assurer de l'implication de l'ORF 10 dans l'hydroxylation de l'isoréniératène chez B. linens, nous avons électroporé B. linens avec l'orf 10 muté de BLMJ. Un mutant (noté BLE7J) accumulant majoritairement de l'isoréniératène a pu être isolé. L'analyse de la séquence de l'ORF 10 de BLE7J révèle la présence d'une mutation au niveau de l'acide aminé 267 où l'acide glutamique est remplacé par une glutamine. Après comparaison de séquences, il apparaît que cet acide aminé appartient à un motif conservé dans les séquences de P450 car impliqué dans la stabilisation du groupement prosthétique de l'enzyme. Sa mutation entraînerait donc une perte d'activité de l'enzyme.<br />Les mutants BLMJ et BLE7J montrent que le P450 responsable de l'hydroxylation de l'isoréniératène en 3,3'-di-hydoxy-isoréniératène est codé par l'orf 10 du cluster crt de B. linens.

Les ATPases de type P1 assurent le transport d'ions métalliques lourds tels que le Cu+, le<br />Cd2+ ou le Zn2+ à travers une membrane. Ce transport, qualifié d'actif parce que s'exerçant<br />en sens inverse du gradient électrochimique de l'ion transporté, utilise l'énergie libérée lors<br />de l'hydrolyse de l'ATP. Une étude accomplie en 1992 indique que 36% des Listeria<br />monocytogenes sont résistantes à de hautes concentrations de Cd2+. Cette résistance est<br />associée à la présence de plasmides, parmi lesquels pLm74 qui présente une séquence de<br />2136 paires de bases codant pour un polypeptide de 711 acides aminés nommé CadA. Ce<br />polypeptide possède les 3 séquences signatures des ATPases de type P, les motifs DKTGT,<br />MxTGD et TGDGxNDxP et les 2 séquences signatures des ATPases de type P1, les motifs<br />CXXC et CPC. L'objectif de cette thèse était la recherche des acides aminés constituant la<br />voie de passage du Cd2+ au sein du domaine transmembranaire de CadA. Ce travail a<br />nécessité l'expression de CadA dans la levure Saccharomyces cerevisiae et la<br />caractérisation du phénotype de sensibilité au Cd2+ induit par la présence de CadA. Il a aussi<br />nécessité une étude enzymatique de CadA au cours de laquelle nous avons montré que le<br />Cd-ATP pouvait remplacer le Mg-ATP dans le cycle enzymatique de la protéine. Quatre<br />hélices transmembranaires (3, 4, 6 et 8) constitueraient la voie de passage du Cd2+ dans<br />CadA. Au sein de ces hélices, les acides aminés M149, C354 et T684 pourraient faire partie<br />du site de liaison tandis que E164 et C356 pourraient être importants dans le processus de<br />dissociation du métal. P355 et D692 seraient nécessaires à la phosphorylation de l'enzyme.<br />L'étude des domaines cytoplasmiques N (liaison des nucléotides) et P (phosphorylation) de<br />CadA a été aussi abordée au cours de cette thèse. La caractérisation fonctionnelle<br />d'ATPases chimériques a mis en évidence la possibilité d'échanger le domaine de<br />phosphorylation entre différentes ATPases de type P.

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