Made available in DSpace on 2014-08-12T02:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460176-Texto+Completo-0.pdf: 769931 bytes, checksum: 51ce02520c2340026c784bc9ef36d15d (MD5) Previous issue date: 2014 / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequent primary tumor of the liver, and is currently one of the major neoplastic diseases, representing 85% of primary liver tumors and is the third leading cause of cancer-related death. The development of the majority of hepatocellular carcinomas related to the presence of a disease resulting from cirrhosis, such as hepatitis B and C. Its incidence has increased in recent years due to the number of patients with infections caused by hepatitis C. The aim of this study was investigate the in vitro effect of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) on the growth of HepG2 cells, used as a model to hepatocellular carcinoma. The results showed that the FBP decreases cell proliferation in a dose-dependent manner, not being caused by cell cycle arrest or apoptosis verified by flow cytometry. It was observed that at 72 h of treatment FBP decreased levels of IL-8, which is closely related to the tumor progression and the generation of reactive oxygen species. Moreover, FBP decreased oxidative stress by increasing the levels of catalase and decrease TBARS, this effect is possibly caused by the result of low IL- 8. These findings demonstrated that the FBP may be a potential anticancer agent for the treatment of HCC. / O hepatocarcinoma (HCC) é o tumor primário de fígado mais frequente, sendo atualmente uma das principais doenças neoplásicas, representando 85% dos tumores hepáticos primários e sendo a terceira maior causa de morte relacionada ao câncer. O desenvolvimento da maioria dos hepatocarcinomas relaciona-se com a presença de alguma doença decorrente do quadro de cirrose, como hepatite B e C. Sua incidência tem aumentado nos últimos anos devido ao número de pacientes com infecções por hepatite C. O objetivo deste estudo foi investigar, in vitro, o efeito da frutose-1,6-bisfosfato (FBP) sobre o crescimento das células HepG2, modelo utilizado como carcinoma hepatocelular. Os resultados demonstraram que a FBP diminui a proliferação celular em uma relação dose-dependente, não sendo essa proliferação ocasionada por parada no ciclo celular ou apoptose verificado pelos testes de citometria. Observou-se que em 72 h de tratamento a FBP diminuiu os níveis de Interleucina 8 (IL-8), sendo esta interleucina relacionada com a progressão tumoral e a geração de espécies reativas de oxigênio. Além disso, a FBP diminuiu o estresse oxidativo, aumentando os níveis de catalase e diminuindoa produção das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico(TBARS), sendo esse efeito antioxidante possivelmente ocasionado por conseqüênte diminuição de IL-8. Estes resultados demonstraram que a FBP pode ser um agente antineoplásico em potencial para o tratamento de hepatocarcinoma.

Made available in DSpace on 2014-08-30T02:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000460859-Texto+Completo-0.pdf: 2353123 bytes, checksum: dd594f361c31a6e6ca5c19cd19a8c488 (MD5) Previous issue date: 2014 / The Mycobacterium tuberculosis NADH-dependent enoyl-acyl carrier protein reductase (MtInhA) catalyzes hydride transfer to long-chain enoyl thioester substrates. MtInhA is a member of the mycobacterial type II dissociated fatty acid biosynthesis system, and is the bona fide target for isoniazid, the most prescribed drug for tuberculosis treatment. Here, a series of piperazine derivatives was synthesized and screened as MtInhA inhibitors, which resulted in the identification of compounds with IC50 values in the submicromolar range. A structure-activity relationship (SAR) evaluation indicated the importance of the chemical environment surrounding the carbonyl group for inhibition. In addition, the structure of one selected compound was supported by crystallographic studies, and experimental geometrical values were compared with semi-empirical quantum chemical calculations. Furthermore, the mode of inhibition and inhibitory dissociation constants were determined for the nine most active compounds. These findings suggest that these compounds interact with MtInhA at the enoyl thioester (2-trans-dodecenoyl-CoA) substrate binding site. Finally, two 9H-fluoren-9-yl-piperazine-containing compounds exhibited moderate antimycobacterial activity against the M. tuberculosis H37Rv strain. / A enzima 2-trans-enoil-ACP redutase de Mycobacterium tuberculosis (MtInhA) catalisa a etapa enzimática final no ciclo de alongamento da via de biossíntese de ácidos graxos, convertendo 2-trans-enoil-ACP à acil-ACP em um mecanismo dependente de NADH. Essa enzima vem sendo descrita como alvo validado para a descoberta de fármacos. Nesse trabalho uma série de piperazinas foi sintetizada e avaliada quanto ao potencial inibitório da atividade enzimática da MtInhA, resultando em compostos com valores de IC50 na faixa de inibição de nanomolar. Avaliações de relação estrutura-atividade (SAR) indicam a importância do ambiente químico adjacente à carbonila para a inibição. Além disso, a estrutura de um composto foi confirmada por estudos cristalográficos e os valores geométricos experimentais foram comparados com valores obtidos através de cálculos semi-empíricos de obitais moleculares. Experimentos para determinação do modo de inibição e obtenção dos valores das constantes de dissociação foram realizados para os nove compostos mais ativos. Os resultados sugerem que esses compostos interagem com MtInhA no sítio de ligação dos substratos acil-graxos. Finalmente, dois compostos, contendo na sua estrutura 9H-fluoren-9-il-piperazina exibiram moderada atividade antimicrobiana contra a cepa Mycobacterium tuberculosis H37Rv.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467370-Texto+Completo-0.pdf: 6072599 bytes, checksum: 169f7ff123882c0b088732b04ad1956d (MD5) Previous issue date: 2014 / Schistososmiasis is a chronic endemic infection caused by parasites of the genus Schistosoma, and it occurs in 74 countries in Africa, South America and Asia. The three main agents of this infection in humans are: Schistosoma mansoni and Schistosoma japonicum, that cause the hepatic-intestinal disease, and Schistosoma haematobium, responsible for the genitourinary infection. Despite the effective treatment like praziquantel, schistososmiasis remains as the second most prevalent parasitic disease in the world. Diagnosis of the intestinal schistososmiasis is achieved through the direct visualization of the eggs in fecal samples. The current method recommended by the World Health Organization in epidemiological studies is the Kato-Katz method. Despite it being simple and cheap, in areas of low endemicity this technique loose sensibility, leading to the occurrence of false-negative cases and underestimation of the prevalence in the studied area. Helmintex™ is a coproparasitological method highly sensitive that allows the isolation of Schistosoma eggs from 30 grams of feces, based in the interaction between the eggs and paramagnetic microspheres in a magnetic field. However, this method demands time and specialized equipment, being of difficult manipulation in work field. The mechanism that promotes the interaction between the paramagnetic spheres with the Schistosoma eggs is not known. Considering the necessity of sensitive diagnostic tools of easy applicability in epidemiological studies in low endemicity areas, this work has the purpose to study the surface physical-chemical characteristics of S. mansoni and S. japonicum eggs, in order to enhance the efficiency of the Helmintex™ method. S. mansoni and S. japonicum eggs were isolated from livers of experimentally infected mice. The eggs were submitted to morphological and structural analysis using Scanning and Transmission Electron Microscopy and elemental analysis using Energy Disperssion Spectroscopy. The magnetic susceptibility was determined using SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) and the concentration of the chemical elements was determined through Atomic Emission Spectroscopy. Experiments to elucidate the interaction properties of the eggs of the eggs and the microspheres were conducted incubating the eggs from both species with different paramagnetic microspheres. The results show that the egg surface of both species is recovered by a dense layer of microspines, being those shorter and less spaced in S. mansoni. The eggs spontaneously bind the particles, with a greater preference for magnetic material. S. japonicum eggs have a higher affinity for paramagnetic microspheres than S. mansoni eggs. The presence of streptavidin in the surface of the microspheres enhances the affinity of both species for non-magnetic material, however it decreases the affinity for paramagnetic microspheres. Despite the presence of iron in the eggshell of S. mansoni and S. japonicum, the origin of the interaction does not seem to be magnetic, but, based in the difference of electrostatic charges present in the surface of the eggs and the microspheres. The continuity of this study is important to determine the physical-chemical characteristics of eggs from human feces, and it can lead to the upgrading and optimization of the Helmintex™ method. Studies using Atomic Force Microscopy are in progress. / A esquistossomose é uma infecção crônica endêmica causada por parasitos do gênero Schistosoma, e ocorre em países 74 países na África, América do Sul e Ásia. Os três principais agentes desta infecção em humanos são: Schistosoma mansoni e Schistosoma japonicum, causadores da doença hepato-intestinal, e Schistosoma haematobium, responsável pela infecção genitourinária. Apesar de haver tratamento efetivo como o praziquantel, a esquistossomose permanece como a segunda infecção parasitária mais prevalente no mundo. O diagnóstico da esquistossomose intestinal é feito através da direta visualização dos ovos em amostras fecais. O método atualmente recomendado pela Organização Mundial de Saúde em estudos epidemiológicos é o método de Kato-Katz. Apesar de simples e barato, em áreas de baixa endemicidade esta técnica perde sensibilidade, levando à ocorrência de casos falso-negativos e subestimação da prevalência da área estudada. O Helmintex® é um método coproparasitológico altamente sensível que permite o isolamento de ovos de Schistosoma à partir de 30 gramas de fezes, baseado na interação entre os ovos e esferas paramagnéticas em um campo magnético. Entretanto, este método demanda tempo e equipamentos especializados, sendo de difícil manipulação em estudos de campo.O mecanismo que promove a interação das esferas paramagnéticas com os ovos de Schistosoma não é conhecido. Tendo em vista a necessidade de ferramentas diagnósticas sensíveis e de fácil aplicabilidade em estudos epidemiológicos em áreas de baixa transmissão, este trabalho tem por objetivo estudar características físico-químicas da superfície dos ovos de S. mansoni e S. japonicum, afim de aprimorar a eficiência do método Helmintex®. Ovos de S. mansoni e S. japonicum foram isolados de fígados de camundongos experimentalmente infectados. Os ovos foram submetidos à analise morfológica e estrutural utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão e análise elementar utilizando Espectroscopia por Dispersão de Energia. A susceptibilidade magnética foi determinada utilizando-se o SQUID (Superconducting Quantum Interference Device) e a concentração dos elementos químicos foi determinada através de Espectroscopia por Emissão Atômica. Experimentos para elucidar as propriedades de interação dos ovos e das microesferas foram conduzidos incubando ovos de ambas as espécies com diferentes microesferas paramagnéticas. Os resultados mostram que a superfície do ovo de ambas as espécies é recoberta por uma camada densa de microespinhos, sendo estes mais curtos e menos espaçados em S. mansoni. Os ovos espontaneamente ligam-se às partículas, com maior preferência por material magnético. Os ovos de S. japonicum possuem maior afinidade pelas microsesferas paramagnéticas do que os ovos de S. mansoni. A presença de estreptavidina na superfície das microesferas aumenta a afinidade de ambas as espécies por microesferas não-magnéticas, porém diminui a afinidade por microesferas paramagnéticas. Apesar da presença de ferro na casca do ovo tanto de S. mansoni quanto de S. japonicum, a origem da interação não parece ser magnética, e sim, baseada na diferença de cargas eletrostáticas presentes na superfície dos ovos e das microesferas. A continuidade deste estudo é importante para determinar as características físico-químicas de ovos provenientes de fezes humanas, e pode levar ao aprimoramento e otimização do método Helmintex®. Estudos utilizando-se Microscopia de Força Atômica encontram-se em andamento.

Made available in DSpace on 2015-04-30T14:03:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000467140-Texto+Completo-0.pdf: 2666780 bytes, checksum: 69d9316002f8596f9f09b6c05ceb6081 (MD5) Previous issue date: 2015 / Tuberculosis (TB) is the leading cause of bacterial infectious disease mortality. The etiological agent, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) is responsible for 1. 5 million deaths and 9 million people infected in 2013. The World Health Organization (WHO) estimates that one-third of the world´s population is infected with latent form of Mtb. Thus, there is a continuous need to find promising molecular targets for the development of anti-TB agents. The shikimate pathway produces an important precursor of aromatic compounds in bacteria, fungi, plants and apicomplexan parasites, chorismate. The pathway comprises seven enzymes, which convert erythrose-4-phosphate and phosphoenolpyruvate into chorismate, the precursor for the synthesis of aromatic amino acids, folic acid, ubiquinone, and many other aromatic compounds. This pathway is essential for growth of Mtb. The aroD gene, that codes for 3-dehydroquinate dehydratase (DHQase), catalyzes the reversible reaction of 3-dehydroquinate into 3-dehydroshikimate and the aroE gene, that codes for the NADP(H) dependent shikimate-5-dehydrogenase (SD), catalyzes the reduction of 3-dehydroshikimate into shikimate. The aim of the present study was to identify new dug-like molecules as inhibitors for MtbDHQase and MtbSD using structure-based modeling and virtual screening. The availability of the crystal structure bound with an inhibitor of MtbDHQase was explored using pharmacophore models based on interaction energy and docking to yield diverse leads. For MtbSD, due the absence of crystal structure and reported inhibitors, the tridimensional structure was achieved by molecular modelling. Structure-based pharmacophore and virtual screening of the in house database containing 3000 unique molecules retrieved twelve hit compounds with good docking score and interaction pattern for MtbDHQase. For MtbSD, the commercially available database Asinex, with 500,000 molecules, were used and seventeen compounds were selected based in its docking score, interaction pattern with amino acids in the active site, number of hydrogen bonds and GOLD score. MtbDHQase inhibitors were tested and, after inhibition assay, series of chemical modifications were made in the lead compound. The top two derivate presented IC50 values of 17. 1 and 31. 5 μM as well as MIC values of 25 and 6. 25 μg/mL and cytotoxicity below 15% at 100 μM respectively. The MtbSD compounds selected as possible inhibitors will be tested for inhibition, MIC value and cytotoxicity. / A Tuberculose (TB) é a principal causa de mortalidade devido a infecções bacterianas. Seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb) foi responsável por 1,5 milhões de mortes e por 9 milhões de pessoas infectadas em 2013. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que um terço da população mundial está infectada com a forma latente do Mtb. Assim, há uma contínua necessidade de buscar alvos moleculares promissores para o desenvolvimento de agentes anti-TB. A via do chiquimato produz um importante precursor de compostos aromáticos em bactérias, fungos, plantas e parasitas do filo Apicomplexa, o corismato. A via é composta por sete enzimas, as quais convertem eritrose-4-fosfato e fosfenolpiruvato em corismato, o precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos, ácido fólico, ubiquinonas e muitos outros compostos aromáticos. Esta via é essencial para o crescimento do Mtb.O gene aroD, que codifica a enzima 3-desidroquinato desidratase (DHQase), catalisa a reação reversível do 3-desidroquinato em 3-desidrochiquimato e o gene aroE, que codifica a enzima dependente de NADP(H) chiquimato-5-desidrogenase (SD), catalisa a redução do 3-desidrochiquimato em chiquimato. O objetivo do presente estudo foi identificar novas moléculas como inibidores para a MtbDHQase e MtbSD utilizando modelagem baseada em estrutura e triagem virtual. A disponibilidade da estrutura cristalográfica ligada a um inibidor da MtbDHQase foi explorada utilizando modelos farmacóforos baseados na energia de interação e docagem para gerar diversos protótipos. Para a MtbSD, devido à ausência de estrutura cristalográfica e de inibidores, foi realizado através de modelagem molecular, um modelo da estrutura. A abordagem do farmacofórico baseado na estrutura, juntamente com a triagem virtual da base de dados in house contendo 3000 estruturas inéditas geraram compostos escolhidos com bom valor de docagem e padrão de interação com aminoácidos do sítio ativo. Para a MtbSD, foi utilizada a base de dados Asinex, que contém 500000 moléculas. Dezessete compostos foram encontrados baseados nos seus valores de docagem, no padrão de interação com os aminoácidos do sítio ativo, no número de interações de hidrogênio e no valor de GOLD. Os inibidores da MtbDHQase foram testados e, após os ensaios de inibição, foram realizadas diversas derivações químicas no composto protótipo. Os dois melhores compostos derivados apresentaram um valor de IC50 de 17,1 e 31,5 μM, um valor de MIC de 25 e 6,25 μg/mL e citotoxicidade abaixo de 15% a 100μM, respectivamente. Os compostos selecionados como possíveis inibidores para a MtbSD serão futuramente testados quanto a sua inibição, valor de CIM e citotoxicidade.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431140-Texto+Completo-0.pdf: 1654374 bytes, checksum: 1465b8ac4be5cfbe78bdaa126071ddf5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Guanosine monophosphate (GMP) reductase catalyzes the reductive deamination of GMP to inosine monophosphate (IMP). GMP reductase plays an important role in the conversion of nucleoside and nucleotide derivatives of guanine to adenine nucleotides. In addition, as a member of the purine salvage pathway, it also participates in the reutilization of free intracellular bases. Here we present cloning, expression and purification of Escherichia coli guaC-encoded GMP reductase to determine its kinetic mechanism, as well as chemical and thermodynamic features of this reaction. Initial velocity studies and isothermal titration calorimetry demonstrated that GMP reductase follows an ordered bi-bi kinetic mechanism, in which GMP binds first to the enzyme followed by NADPH binding, and NADP+ dissociates first followed by IMP release. The isothermal titration calorimetry also showed that GMP and IMP binding are thermodynamically favorable processes. The pH-rate profiles showed groups with apparent pK values of 6. 6 and 9. 6 involved in catalysis, and pK values of 7. 1 and 8. 6 important to GMP binding, and a pK value of 6. 4 important for NADPH binding. Primary deuterium kinetic isotope effects demonstrated that hydride transfer contributes to the rate-limiting step, whereas solvent kinetic isotope effects arise from a single protonic site that plays a modest role in catalysis. Multiple isotope effects suggest that protonation and hydride transfer steps take place in the same transition state, lending support to a concerted mechanism. Pre-steady-state kinetic data suggest that product release does not contribute to the rate-limiting step of the reaction catalyzed by E. coli GMP reductase. / A enzima guanosina monofosfato (GMP) redutase catalisa a deaminação redutiva do GMP à inosina monofosfato (IMP). GMP redutase possui um papel importante na conversão dos nucleosídeos e nucleotídeos derivados de guanina a nucleotídeos de adenina. Além desse fato, como parte da via de salvamento de purinas, também participa da reutilização de bases livres intracelulares. Nesse trabalho, mostramos a clonagem, a expressão e a purificação da GMP redutase codificada pelo gene guaC de Escherichia coli a fim de determinar seu mecanismo cinético; bem como as características químicas e termodinâmicas da reação catalisada. Estudos de velocidade inicial e titulação de calorimetria isotérmica demonstraram que a GMP redutase possui um mecanismo cinético bi-bi ordenado, no qual o GMP liga primeiro à enzima, seguido pela ligação do NADPH; o NADP+ se dissocia primeiro, seguido pela liberação do IMP. A titulação calorimétrica também mostrou que a ligação do GMP e IMP são processos termodinamicamente favoráveis. Perfis de pH demonstraram grupos com valores de pK aparentes de 6,6 e 9,6 envolvidos na catálise, valores de pK de 7,1 e 8,6 importantes para ligação do GMP e um valor de pK de 6,4 importante para ligação do NADPH. Efeito isotópico primário demonstrou que a transferência do hidreto contribui para a etapa limitante da reação, enquanto que os efeitos isotópicos do solvente provêm de um único local de protonação que possui um papel modesto na catálise. Efeito isotópico múltiplo sugere que as etapas de protonação e transferência do hidreto ocorrem no mesmo estado de transição, fornecendo evidência de um mecanismo concerted. Os dados de cinética em estado pré-estacionário indicam que a liberação do produto não contribui para a etapa limitante da reação catalisada pela GMP redutase de E. coli. Em conjunto, os resultados mostram que a reação catalisada pela GMP redutase segue um mecanismo sequencial e ordenado, onde a transferência do hidreto e do próton ocorrem no mesmo estado de transição. Os resultados aqui apresentados foram os primeiros a evidenciar o mecanismo cinético da GMP redutase, bem como, os resíduos fundamentais para catálise e/ou ligação, além de fornecer informações sobre o estado de transição da reação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000412868-Texto+Completo-0.pdf: 709463 bytes, checksum: 24e54fc3c08be35252a751617c52ca4d (MD5) Previous issue date: 2009 / The epithelium-specific Ets factor, family member 3 (ESE-3), has been shown to play roles in determination of the early differentiated fate in stratified squamous epithelia, expression of a receptor for tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, and airway inflammation of respiratory disorders such as asthma and cystic fibrosis. The Ets domain proteins have been proposed to bind to purine-rich central core 5’-GGAA-3’ sequence with larger affinity than 5’-GGAT-3’. Here we describe surface plasmon resonance equilibrium and kinetics analyses of Ets domain ESE-3 binding to Drosophila E74 gene promoter sequence (a consensus Ets binding site) containing either 5’-GGAA-3’ or 5’-GGAT-3’core sequence. Competition assays are also described. The results showed that there is no large difference in equilibrium binding affinity between Ets domain ESE-3 and either 5’-GGAA-3’ or 5’-GGAT-3’. However, analysis of kinetic data indicates that larger association rate and lower dissociation rate constant values account for the slightly higher affinity of Ets domain ESE-3 for 5’-GGAA-3’-containing DNA sequence. The role of dynamics in protein-DNA recognition is discussed and a mechanism is proposed in which free Ets domain ESE-3 exists as two isomers in solution that undergoes a slow protein isomerization step, which is followed by a fast DNA binding process. Besides, data of spectrofluorimetric experiments give evidence to include a further step in the proposed mechanism. / Tem se mostrado que a proteína ESE-3 (Fator específico de epitélio, do inglês epithelium-specific Ets factor, family member 3) desempenha importantes papéis na determinação do destino inicial da diferenciação do epitélio escamoso estratificado, na indução da expressão do receptor para um ligante que induz à apoptose, relacionado com necrose tumoral, e em processos inflamatórios de doenças respiratórias, tais como a asma e a fibrose cística. Tem se proposto que proteínas com domínio Ets ligam-se com maior afinidade a seqüências com núcleo central rico em purinas 5’-GGAA-3’ do que em seqüências com núcleo central 5’-GGAT-3’. Neste trabalho, nós descrevemos análises cinéticas e em equilíbrio do domínio Ets de ESE-3 ligando-se ao sítio de ligação Ets presente na região promotora do gene E74 de Drosophila, contendo tanto as bases centrais 5’-GGAA-3’ quanto 5’-GGAT-3’, utilizando a técnica de ressonância plasmônica de superfície. Também descrevemos ensaios de competição. Os resultados mostraram que não há grande diferença na afinidade de ligação do domínio Ets de ESE-3 entre as seqüência contendo 5’-GGAA-3’ ou 5’-GGAT-3’. No entanto, as análises dos dados cinéticos indicam que há maior valor da constante de velocidade de associação e menor valor para a constante de velocidade de dissociação, que contam para uma afinidade levemente mais alta do domínio Ets de ESE-3 por seqüências de DNA contendo as bases centrais 5’-GGAA-3’.O papel da dinâmica do reconhecimento do DNA realizado pela proteína é discutido e é proposto o mecanismo no qual o domínio Ets de ESE-3 livre existe como dois isômeros em solução que sofrem um passo lento de isomerização, que é seguido por um rápido processo de ligação ao DNA. Além disso, os dados obtidos pelos experimentos de espectrofluorimetria dão uma evidência para a inclusão de mais um passo no mecanismo proposto.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000401340-Texto+Completo-0.pdf: 549118 bytes, checksum: 0b891fb7ecb8b42c15bbd983f6da4c5e (MD5) Previous issue date: 2008 / Introduction: Current pollution and emission of toxic gases is leading to a gradual deterioration of the ozone layer that filters out a large portion of the ultraviolet (UV) emission. It has been shown that UV radiation significantly alters the structure of the skin, including nerve endings. Due to the increasing number of skin diseases as a result of UV exposure, it is necessary to evaluate the effectiveness of new skin care formulations with broad-spectrum sunscreens. Previous studies have not been able to quantify the damage induced by UV radiation on peripheral nerve endings. Objectives: To identify the nerve endings in the skin, quantify the effects of UV radiation on nerve endings and evaluate de neuroprotective effects of new skin care formulation to UV exposure Materials and methods: biopsies of skins were obtained from 35 healthy young adults, undergoing plastic surgery, and immediately treated (10 min) with three emulsions: Cream1, Cream2 (placebo) and commercially available sun protection factor (SPF) 15. Samples treated with the emulsions or control (untreated) were exposed to UVA and UVB for 60 min. Skin tissues were frozen and 15- m cryostate sections were produced. Peripheral nerve endings were identified by immunofluorescence using a monoclonal antibody anti-human CD56 (NCAM). The cell damage was identified from the automatic pixel selection (green - FITC) of captured images. Results: several cellular nervous structures were identified in the skin, including free nerve endings, innervations of the hair follicle and sebaceous glands. The UVA and UVB decreased significantly (40-60%) the density of nerve endings in the skin of control, samples treated with placebo or SPF 15 (all p < 0. 001). No morphological changes were observed in the free nerve endings exposed to UV radiation. Samples treated with Cream1 completely blocked the effects of UV radiation on nerve endings (p > 0. 05). Discussion: The quantification of cellular damage induced by UV radiation enables the identification of new skin care compounds with neuroprotective properties. The underlying mechanisms of UV-induced cellular damage as well as the neuroprotective actions should be further investigated in future studies. / Introdução: Atualmente, devido à poluição e emissão de gases tóxicos, há uma degradação gradual da camada de ozônio que filtra uma grande parcela das emissões UV. A radiação UV altera significativamente as estruturas da pele, incluindo as terminações nervosas. Em decorrência do crescente aumento de doenças de pele relacionadas à exposição UV, faz-se necessária a avaliação da efetividade de novos princípios ativos com finalidade de proteção contra as radiações. Estudos anteriores não foram capazes de quantificar o dano induzido pela radiação UV nas terminações nervosas. Objetivos: identificar as terminações nervosas na pele humana, quantificar os efeitos das radiações UV sobre as terminações nervosas e verificar o efeito de princípios ativos neuroprotetores à exposição UV. Materiais e Métodos: biópsias de pele, de 35 adultos saudáveis, sob cirurgia plástica, foram obtidas e imediatamente tratadas com três emulsões: Creme1, Creme2 (placebo) e FPS 15. As amostras tratadas com as emulsões ou controle (sem creme) foram submetidos à exposição UVA e UVB por 60 min. Secções de 15 m foram produzidas no criostato a partir de tecidos congelados e as estruturas nervosas foram identificadas por imunofluorescência utilizando um anticorpo monoclonal anti-CD56 (NCAM) humano. O dano nas terminações foi identificado a partir da seleção automática de pixels (verde – FITC) das imagens capturadas. Resultados: foram identificadas várias estruturas nervosas na pele, incluindo terminações livres, inervações do folículo piloso e glândulas sebáceas. As radiações UVA e UVB reduziram, significativamente (40-60%), a densidade das terminações nervosas na pele nas amostras controle, tratadas com placebo ou FPS 15 (p<0. 001). Não foram observadas diferenças morfológicas das terminações nervosas expostas a radiação UV. As amostras tratadas com o Creme1 bloquearam completamente os efeitos da radiação UV sobre as terminações nervosas (p > 0. 05). Discussão: A quantificação dos danos celulares induzidos pela radiação UV possibilita a identificação de compostos ativos com propriedades neuroprotetoras. Os mecanismos de dano celular bem como as atividades neuroprotetoras merecem ser identificadas nos próximos estudos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000400977-Texto+Completo-0.pdf: 4539357 bytes, checksum: a454d83262e33e9f70ab585e6cbbdd44 (MD5) Previous issue date: 2008 / The reemergence of tuberculosis is a current public health problem. The World Health Organization (WHO) reported in 2006 that 2 billion people, or one-third of the world’s total population, are infected with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (MTB), and in 2007 reported that 1. 6 million people died from TB in 2005. Multidrug-resistant TB (MDR-TB) and extensively drug-resistant TB (XDR-TB) are forms of TB that does not respond to the standard drug treatment. Isoniazid (INH, isonicotinic acid hydrazide) is one of oldest synthetic antitubercular drugs. The mechanism of action of INH is complex, as mutations in at least five different genes (katG, inhA, ahpC, kasA, and ndh) have been found to correlate with INH resistance. Pentacyano(isoniazid)ferrate II (PIF) is a rational drug design effort to find alternative drugs capable of inhibiting InhA. It was found that PIF inhibit both wild type and isoniazid-resistant I21V mutants of InhA and this inactivation does not require activation by KatG. In this work we report the results of two molecular dynamics simulations of PIF-InhA interaction considering all atoms of this complex in aqueous solution. The results demonstrated that PIF strongly interacts with InhA and these interactions cause macromolecular instabilities due to substrate binding site perturbation. These instabilities are reflected in the long time necessary for trajectory convergence. Besides this, we observed that the residues Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 and Thr196 of InhA are responsible for the PIF-InhA association. So, we conclude that PIF competes directly for the NADH binding site and indirectly with the substrate binding site. / A re-emergência da tuberculose é um problema de saúde pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que, em 2006, cerca de 2 bilhões de pessoas, ou um terço da população mundial, foram infectadas com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (MTB), e em 2007 relata que 1,6 milhões de pessoas morreram de tuberculose (TB) no ano de 2005. O surgimento das formas de TB resistente a múltiplas drogas (MDR-TB) e extensivamente resistente a drogas (XDR-TB), as quais não respondem ao tratamento convencional, colaboram para este crescimento. A Isoniazida (INH, hidrazida do ácido isonicotínico) é uma das drogas sintéticas mais antigas, e seu mecanismo de ação é complexo. Mutações em pelo menos cinco genes diferentes (katG, inhA, ahpC, kasA, e ndh) foram correlacionadas com a resistência a INH. O complexo inorgânico Isoniazida-pentacianoferrato (IPF) é o resultado do desenho racional de drogas na tentativa de achar uma alternativa capaz de inibir a InhA. O IPF é capaz de inibir os tipos selvagem e o mutante I21V da InhA, resistente à INH, e esta inativação não requer ativação por KatG. Neste trabalho, realizamos duas simulações por dinâmica molecular do complexo IPF-InhA, utilizando todos os átomos em solução aquosa, com o objetivo de investigar os eventos moleculares relacionados ao modo de interação droga-alvo e suas afinidades. Observamos que o IPF interage fortemente com a InhA e estas interações causam instabilidades na macromolécula devido a perturbação no sítio de ligação do substrato. Estas instabilidades se refletem no longo tempo necessário para a convergência da trajetória. Observamos também que os resíduos Gly14, Ile15, Ile16, Ser20, Gly40, Phe41, Ile47, Ser94 e Thr196 são os responsáveis por intermediar a associação IPF-InhA. Concluímos então que o IPF compete diretamente com o NADH pelo seu sítio de ligação e indiretamente com o substrato através da desestabilização do seu sítio de ligação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000422143-Texto+Completo-0.pdf: 659009 bytes, checksum: 4a462f7c36025ba4acbf746909b37608 (MD5) Previous issue date: 2009 / The purpose of this study was to evaluate the anti-inflammatory, immunomodulatory and cytotoxic effect of the compound derivative of 4-tioxopirimidinas denominated RDV 8. In order to investigate RDV 8 anti-inflammatory effect, the model used was pleurisy induced by carrageenan in rats, where the parameters of the acute phase of inflammation were evaluated. In the in vitro model, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs from humans ) culture was used to investigate both the cytotoxic action and the immunomodulatory effect of RDV 8. In the in vivo model, 30 female Wistar rats were used divided in control and experimental groups. Half hour (30min) after the intraperitoneal injection of RDV 8, 3. 0 mg/Kg, carrageenan (0. 2mL, 1%) was injected in the pleural cavity to cause inflammation. After 4 hours the pleural liquid was aspirated and the volume of exudate, total and differential leukocytes were counted and protein concentration and nitric oxide (NO) were measured. In the cell culture model of mononuclear cells, we used blood samples from 6 healthy individuals, between 17 and 40 years olds. These cells were distributed in 11 groups, 5 for cytotoxic assessment and 6 for immunomodulatory research. After 96 hours (4 days) the cells were counted and their supernatants were withdrawn, in order to assess concentrations of interleukin (IL) 1 and 6 and the monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1 or CCL2). In the pleurisy model, RDV 8 significantly reduced (P<0. 05) all variables except the number of polymorphonuclear cell (PMNs). The cytotoxic tests presented no significant change in the concentrations used, but there was a significant immunosuppressant effect (P<0. 05) in immunomodulatory tests. There was a decrease in MCP-1 and a increase in IL-6 in the RDV 8 concentration of 0. 1μg/ml. These results indicate a high immunomodulatory and anti-inflammatory action of RDV 8 without any cytotoxic action on the concentrations used in these experiments. / A proposta deste estudo foi avaliar o efeito antiinflamatório, imunomodulador e citotóxico do composto derivado de 4-tioxopirimidinas denominado RDV 8. Para investigar o efeito antiinflamatório usou-se o modelo de pleurisia induzida por carragenina em ratos, onde foram avaliados os parâmetros da fase aguda da inflamação. No modelo in vitro foi utilizado o método de cultura de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humano, tanto para investigar a ação citotóxica quanto o efeito imunomodulador do RDV 8. No modelo in vivo foram utilizadas 30 ratas Wistar divididas em grupos controle e experimental. Meia hora (30min) após a injeção intraperitonial de RDV 8 (3,0 mg/kg) a carragenina (0. 2mL) foi injetada na cavidade pleural para causar inflamação. Após 4 horas o volume de exudato, leucócitos totais e contagem diferencial, concentração de proteínas e óxido nítrico (NO) foram mensurados no liquido pleural aspirado. No modelo de cultura de células foram utilizadas células mononucleares de 6 indivíduos saudáveis, na faixa entre 17 e 40 anos. Estas células foram distribuídas em 11 grupos, 5 para avaliação citotóxica e 6 para investigação imunomoduladora. Após 96 horas (4 dias) as células foram contadas e retirados seus sobrenadantes, a fim de avaliar as concentrações de interleucinas-1 (IL-1) e (IL-6) e a proteína-1 quimioatraente de monócitos (MCP-1 ou CCL2). Na pleurisia o RDV 8 reduziu significativamente (P<0,05) todas as variáveis inflamatórias exceto o numero de células polimorfonucleares (PMNs). Em nenhum dos testes de citotoxicidade ocorreu morte celularsignificativa nas concentrações utilizadas, mas nos testes de imunossupressão houve uma significante (P<0,05) imunossupressão (antilinfoproliferação), diminuição de MCP-1 e aumento da IL-6 na concentração de 0,1μg/mL. Esses resultados indicam uma ação antiinflamatória e imunomoduladora do RDV 8, não apresentando ação citotóxica nas concentrações utilizadas nos experimentos.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442629-Texto+Completo-0.pdf: 4545565 bytes, checksum: 75785599771804ca3f6535bc606e1454 (MD5) Previous issue date: 2012 / The clinical depression treatment faces serious obstacles as the disease mechanism is not fully elucidated. In addition, there are no effective means to predict and prevent depression as well as any biological method of diagnosis. The use of antidepressants is still the basis of the treatments for depression. Lithium has been used clinically as effective drug to treat all phases of bipolar disorder, including major depression. The Selective serotonin re-uptake inhibitors (SSRIs), such as fluoxetine and citalopram, and Tricyclic antidepressant (TCA) as clomipramine are drugs constantly used for depression treatment. Recent evidence has shown an involvement of adenosine and its receptors in the pathophysiology of depression. ATP can be stored and co-released with other neurotransmitters like serotonin and can be hydrolyzed by a cell-surface enzyme family known as ectonucleotidases. Among these members, we highlight the nucleoside triphosphate diphosphohtdrolases (NTPDases) and ecto-5'-nucleotidase. They are able to control the availability of ligands such as ATP and adenosine to its specific receptors. Adenosine deaminase (ADA) can promote the hydrolytic deamination of adenosine to inosine, modulating the extracellulr levels of this neuromodulator. In cholinergic signaling, after its release, acetylcholine (ACh) promotes the activation of specific muscarinic or nicotinic receptors and thus, it promotes diverse cellular responses. ACh is hydrolyzed by acetylcholinesterase (AChE) in acetate and choline in synaptic cleft. The zebrafish has been used in research behavioral neuroscience and is also a choice model for elucidating the development and function of neuronal circuitry. Considering the cholinergic and purinergic signaling are important participation in the CNS and these neurotransmitter pathways have been identified and characterized in zebrafish, the objective of this study was to evaluate the effect of antidepressants on ectonucleotidases, ADA and ACh activities, which are essential enzymes in the modulation of these signaling pathways in the zebrafish brain. We evaluated the ex vivo effects of fluoxetine (1-10 μM), clomipramine (1-10 μM), citalopram (70-300 μM) on ectonucleotidases and ADA activities. It has been also analyzed the in vitro (1 to 1000 μM) and ex vivo (1 to 10mg/L) effect of lithium on ectonucleotidases and AChE activities and gene expression. There was a significant inhibition of ADP hydrolysis after ex vivo exposure to lithium at 5 and 10 mg/L, whereas an inhibitory effect was observed for AMP hydrolysis only at 10 mg/L. The same treatment decreased the AChE activity in a concentration of 10mg/L. Lithium did not induce significant changes in the analysis of gene expression patterns in the concentrations tested. In vivo treatment, there were no significant changes inectonucleotidases and AChE activities. Treatment with clomipramine promotes an inhibition ecto-5'-nucleotidase activities at the concentration of 5μM when compared to the control group. For ADA activity, we also observed a significant inhibition in the treatment with clomipramine at concentrations of 5 and 10 μM in membrane fractions of zebrafish brain. However, treatment with fluoxetine and citalopram did not alter ectonucleotidases and ADA activities in the zebrafish brain. Our findings may contribute to a better understanding of pharmacology of antidepressants and their interaction with the cholinergic and purinergic neurotransmission. / O tratamento clínico da depressão enfrenta sérios obstáculos já que o mecanismo da doença não é totalmente elucidado. Além disso, não existem meios eficazes para prever e prevenir a depressão bem como nenhum método biológico de diagnóstico. O uso de fármacos antidepressivos ainda é a base dos tratamentos para depressão. O lítio tem sido usado clinicamente como fármaco eficaz para tratar todas as fases do transtorno bipolar, incluindo depressão aguda. Os inibidores seletivos da recaptação de serotonina (ISRSs), como fluoxetina e citalopram, e os antidepressivos tricíclicos (TCA), como a clomipramina, são fármacos constantemente utilizados para o tratamento da depressão. Evidências recentes mostram o envolvimento da adenosina e seus receptores na patofisiologia da depressão. O ATP pode ser armazenado e co-liberado, juntamente com outros neurotransmissores, como serotonina e noradrenalina, e pode ser hidrolisado até adenosina por uma família de enzimas de superfície celular, conhecidas como ectonucleotidases. Dentre elas, destacam-se as Nucleosídeo Trifosfato Difosfoidrolases (NTPDases) e a ecto-5´-nucleotidase, capazes de controlar a disponibilidade de ligantes como ATP e adenosina aos seus receptores específicos. A Adenosina desaminase (ADA) pode promover a desaminação hidrolítica da adenosina em inosina, modulando os níveis extracelulares deste neuromodulador. Na sinalização colinérgica, a acetilcolina (ACh), após liberada, promove a ativação de receptores muscarínicos ou nicotínicos, e desta maneira a ACh promove diversas respostas celulares. A ACh que permanece na fenda sináptica é hidrolisada pela acetilcolinesterase (AChE) em acetato e colina. O peixe-zebra tem sido utilizado na pesquisa da neurociência comportamental, sendo também um modelo de escolha para elucidar o desenvolvimento e a função do circuito neuronal. Considerando que as sinalizações purinérgica e colinérgica têm importante participação no sistema nervoso central e que essas vias de neurotransmissão já estão caracterizadas em peixe-zebra, o objetivo desse estudo foi avaliar o efeito de fármacos antidepressivos na atividade das ectonucleotidases, ADA e AChE, enzimas essenciais na modulação destas vias de sinalização em cérebro de peixe-zebra. Foram avaliados os efeitos ex vivo da fluoxetina (1-10 μM), clomipramina (1-10 μM) e citalopram (70-300 μM) na atividade das ectonucleotidases e ADA. Foi analisado também o efeito in vitro (1 a 1000 μM) e ex vivo (1-10mg/L) do lítio sobre a atividade e expressão gênica das ectonucleotidases e AChE. A exposição ao lítio inibiu a hidrólise de ADP nas concentrações de 5 e 10mg/L e inibiu a hidrólise de AMP na concentração de 10mg/L quando comparado ao grupo controle. Este mesmo tratamento diminuiu a atividade da AChE na concentração de 10mg/L. O lítio não induziu alterações significativas na análise do padrão de expressão gênica. No tratamento in vitro, não foram observadas alterações na atividade das ectonucleotidases e AChE. O tratamento com a clomipramina mostrou uma inibição na atividade da ecto-5´-nucleotidase na concentração de 5 μM quando comparado ao grupo controle. Na atividade da ADA também observamos uma inibição significativa no tratamento com a clomipramina nas concentrações de 5 e 10 μM em frações de membrana de cérebro de peixe-zebra. Entretanto, o tratamento com fluoxetina e citalopram não alterou a atividade das ectonucleotidases e ADA no cérebro do peixe-zebra. Nossos resultados podem contribuir para uma melhor compreensão da farmacologia dos fármacos antidepressivos e a sua interação com a neurotransmissão colinérgica e purinérgica.