Les analogues nucléosidiques sont des antimétabolites utilisés depuis longtemps dans le traitement de plusieurs cancers. Due aux similarités de leurs structures chimiques à celles des nucléosides, ils sont assimilés, métabolisés et incorporés à l’ADN comme les nucléosides. Pourtant, quelques remplacements d’atomes dans leurs structures provoquent l’arrêt de la synthèse de l’ADN. Parmi les analogues nucléosidiques les plus utilisés dans la clinique, on retrouve la cytarabine et la gemcitabine, le premier étant important dans les traitements des cancers hématopoïétiques, tandis que le dernier est plus utilisé dans le traitement des tumeurs solides. La cytarabine a été utilisée dans le traitement de la leucémie myéloïde chronique (LMC) en combinaison avec l’interféron jusqu’en 2001, lorsqu’on a approuvé l’inhibiteur de kinase imatinib comme première ligne de traitement pour cette maladie. L’imatinib se lie au site ATP de la protéine BCR-ABL, qui provient d’une translocation entre deux gènes, et leur présence dans les cellules leucémiques caractérise la Leucémie myéloïde chronique. Environ 80% des patients répondent très bien au traitement avec l’imatinib, mais 20% développent de la résistance ou de l’intolérance après quelques années de traitement. Pour ces patients, quelques thérapies alternatives sont à l’étude, comme par exemple, l’utilisation de la cytarabine en combinaison avec l’imatinib. On a travaillé sur l’hypothèse que les inhibiteurs de kinase interfèrent dans le transport des analogues nucléosidiques. Les objectifs de cette étude était de 1) mesurer l’assimilation des analogues nucléosidiques en présence des inhibiteurs de kinases, 2) vérifier si ces derniers ont un rôle dans le transport et la cytotoxicité des analogues nucléosidiques et 3) démontrer qu’une thérapie utilisant ces deux médicaments de façon successive peut être plus efficace qu’un traitement qui les utilise simultanément. Pour ce faire, on a mesuré l’assimilation des nucléosides et des analogues nucléosidiques en utilisant la [3H] thymidine et la [3H] gemcitabine et on a utilisé la méthode d’effet de proximité pour vérifier l’effet de l’inhibiteur de kinase nilotinib sur la cytotoxicité des cellules. Nos résultats ont montré que les inhibiteurs de kinases bloquent l’assimilation des nucléosides et analogues nucléosidiques. Les inhibiteurs de kinases utilisés dans le traitement de la LCM, l’imatinib et surtout le nilotinib, protègent les cellules de la cytotoxicité de l’analogue nucléosidique gemcitabine lorsqu’on les utilise simultanément, mais ils peuvent aussi augmenter la cytotoxicité de la gemcitabine après un traitement successif de l’analogue nucléosidique suivi de l’inhibiteur de kinase nilotinib

Les microARN (miARN) sont des acides ribonucléiques (ARN) endogènes, d’environ 19 à 24 nucléotides (nt), produits lors du clivage d’une structure d’ARN en forme de tige-boucle par la ribonucléase III (ARNase III) Dicer. Il a été rapporté que le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1), en période de latence dans les lymphocytes T CD4+, produit un court transcrit d’ARN appelé « Trans-Activation Response element » (TAR) et que celui-ci est sujet au clivage par Dicer, ce qui génère deux miARN fonctionnels, soit miR-TAR-5p et miR-TAR-3p. Il a donc été suggéré que les miARN dérivés de TAR pourraient jouer un rôle dans la latence du VIH-1. L’objectif, au cours de ma maîtrise, était de déterminer le rôle potentiel de ces miARN dans la régulation de l’expression des gènes de l’hôte en utilisant les cellules en culture J-lat et Jurkat exprimant miR-TAR-5p et miR-TAR-3p de manière stable. Suite à cela, une analyse protéomique grande échelle iTRAQ a été effectuée pour tenter de faire la lumière sur le rôle potentiel des miARN dérivés de l’ARN TAR du VIH-1. En conclusion, il a été montré que la majorité des protéines d’intérêts sont réfractaires à une régulation génique par les miARN. Par contre, ceci ne supporte pas l’idée que ces miARN ne possèdent aucun rôle, d’où l’importance des résultats protéomiques qui ont montré que plusieurs protéines sont potentiellement régulées par les miARN viraux.

Les alcanols aliphatiques sont des substances ubiquitaires utilisées dans une multitude d’applications domestiques et industrielles. Bien que les effets de l’éthanol sur différentes composantes du système immunitaire soient bien connus, il n’existait presqu’aucune donnée concernant les autres alcanols avant le présent travail. Le premier objectif du projet a été d’étudier les impacts immunologiques d’une exposition aigue aux deux autres alcanols les plus utilisés : l’isopropanol et le méthanol. Nous avons trouvé que l’isopropanol compromet les fonctions effectrices des lymphocytes T, des cellules NK, des monocytes et des macrophages. Par contre, le méthanol agit en synergie avec les stimuli activateurs des lymphocytes T et accroît leur production de cytokines pro-inflammatoires. Les effets biologiques sur ces cellules n’impliquent pas les événements de signalisation précoce en aval des récepteurs activateurs, ils résultent d’une dérégulation sélective de l’activation de facteurs de transcription NFAT avec ou sans la participation d’AP-1. Dans les monocytes activés au LPS, l’isopropanol ne modifie pas les sentiers de signalisation de NF-κB et des MAPK p38 et JNK, mais compromet l’activation de ERK2. Il en résulte une activation défective des sous-unités d’AP-1 c-Fos et JunB. La deuxième partie du projet a été de vérifier si les n-alcanols (de C1 à C12) avaient des effets immunologiques qui suivent la règle de Meyer-Overton. Cette règle établie une corrélation entre le potentiel anesthésique d’une molécule et son hydrophobicité. Nous avons trouvé que les n-alcanols de C2 à C10 inhibent la sécrétion d’IFN-γ par les lymphocytes T activés d’une manière reliée à leur degré d’hydrophobicité, mais cette corrélation s’interrompt à C11. Les n-alcanols exercent leur effet en aval de la membrane plasmique en altérant progressivement et en fonction de leur taille l’activation du facteur de transcription NFAT; cette tendance s’interrompt aussi à C11. L’activation de la voie NF-κB est altérée par les n-alcanols, mais leur effet s’arrête avant, aux environs de C8. Ces derniers résultats suggèrent l’existence de pochettes d’intéraction de dimensions définies sur des cibles protéiques qui compromettent l’activation de NFAT et NF-κB et altèrent la fonction effectrice des lymphocytes T. L’ensemble de ces travaux contribue à une meilleure compréhension de l’activité biologique des alcanols. / Aliphatic alkanols are ubiquitous substances used in a variety of household and industrial applications. Although the effects of ethanol on the immune system have been extensively studied, far fewer data is available for the other alkanols. The first objective of the project was to study the immunological impact of acute exposure to the two other most frequently used alkanols, namely isopropanol and methanol. We found that isopropanol is detrimental to the effector functions of T lymphocytes, NK cells, monocytes, and macrophages; they produce less pro-inflammatory cytokines in presence of this alcohol and, in the case of macrophages, phagocytosis is also reduced. Methanol synergizes with activating stimuli to increase their cytokine production. These changes do not involve early signaling events downstream of the cell membrane; they result from the selective dysregulation of the activation of discrete members of the NFAT family of transcription factors with or without the involvement of AP-1. In LPS-activated monocytes, isopropanol does not alter NF-κB and p38/JNK MAPK signaling cascades, but impairs ERK2 activation. The result is a deficient activation of AP-1 subunits c-Fos and JunB. Aliphatic n-alkanols also display anesthetic properties in accordance to their degree of hydrophobicity, following the Meyer-Overton rule. The second part of the project was to determine whether these structurally similar molecules (from C1 to C12) had immunological effects following the same rule. We found that n-alkanols from C2 to C10 inhibit IFN-γ release by activated T lymphocytes in correlation with their hydrophobicity but a cutoff effect was evident at C11. n-Alkanols act downstream of the cell membrane by progressively down-regulating the activation of NFAT in accordance to the size of their aliphatic chain with a clear downward trend that is interrupted at C11. NF-κB signaling is also compromised but the cutoff appears earlier, in the vicinity of C8. Our results suggest the existence of interaction pockets of defined dimensions within intracellular targets that compromise the activation of the NFAT and NF-κB transcription factors and ultimately modulate the effector function of T lymphocytes. Altogether, this work contributes to a better understanding of the biological activity of alkanols.

Nous avons récemment découvert que le gène Gas1 agit comme un suppresseur de métastases chez le mélanome. Ce gène pourrait être utilisé pour d’éventuelles thérapies contre la métastase. Afin de découvrir le mécanisme réprimant l’expression de Gas1 chez les cellules métastatiques, nous avons utilisé des ChIP, des inhibiteurs chimiques et des petits ARN interférents contre des molécules susceptibles de réprimer Gas1. Chez le mélanome métastatique murin B16-F10, nous avons observé plusieurs groupements méthyles sur l’îlot CpG du promoteur de Gas1, ainsi que la marque de répression H3K9me3 et l’absence de la polymérase II. Chez les cellules humaines C8161 et Lox-IMVI, nous avons découvert qu’il y avait une forte présence d’acétylation au niveau de l’histone 3 et de polymérase II. Par ailleurs, nous avons prouvé que c-MYC et BRD4 étaient impliqués dans la régulation de GAS1. Finalement, ces résultats pourront être utilisés pour développer d’éventuelles thérapies contre la métastase.

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L’hypertension artérielle pulmonaire (PAH) est une vasculopathie obstructive caractérisée par une oblitération du lumen des artères pulmonaires distales et une augmentation des résistances vasculaires menant à une augmentation des pressions pulmonaires (PAP) et une hypertrophie ventriculaire droite (RVH) compensatrice. Aucun médicament n’est capable à ce jour de stopper le processus, et lorsque l’hypertrophie compensatrice devient insuffisante, le ventricule droit (RV) se dilate et défaille. A l’origine de ce processus se trouve une hyper-prolifération, une résistance à l’apoptose et une augmentation de la motilité des cellules musculaires lisses vasculaires de l’artère pulmonaire (PASMCs), les rendant « pseudo-malignes ». Le laboratoire a précédemment démontré que le facteur de transcription NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) est en partie impliqué dans ces désordres cellulaires en provoquant une augmentation des concentrations calciques intracellulaires et stimulant la prolifération ; et une hyperpolarisation du potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) inhibant ainsi l’apoptose dépendante des mitochondries. Dans le chapitre 2 nous avons démontré pour la première fois dans le réseau vasculaire pulmonaire que le facteur de transcription STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) est activé et impliqué de façon directe dans la régulation de l’expression de NFAT et de façon indirecte dans son activation via l’oncoprotéine serine/thréonine kinase Pim1 (Provirus integration site for Murine Moloney leukemia virus). L’inhibition de Pim1 in vitro et in vivo (modèle de rat injecté à la monocrotaline) est associée à une diminution de l’activité de NFATc2 et à un retour à un phénotype normal. De plus, les souris déficientes pour le gène Pim1 sont résistantes à une induction de la PAH par hypoxie ou monocrotaline. De plus nous avons démontré que l’expression de Pim1 corrèle avec la sévérité de la maladie dans le modèle expérimental et le modèle humain. Nous avons donc souligné l’intérêt de Pim1 comme cible thérapeutique et outil de diagnostic. Dans le chapitre 3, nous avons mis en évidence l’implication de la plateforme signalétique c-Src (sarcoma Schmidt-Ruppin A-2 viral oncogene homolog)/FAK (Focal adhesion kinase) dans la régulation du phénotype « pseudo malin » en partie par activation de STAT3. L’inhibition de FAK in vitro diminue la prolifération des cellules pathologiques, augmente leur sensibilité a l’apoptose et réduit leur motilité. In vivo, l’inhibition de FAK réduit les pressions pulmonaires et le remodelage vasculaire faisant de FAK une cible thérapeutique intéressante. Dans le chapitre 4 nous proposons finalement une autre option thérapeutique par l’utilisation de la dehydroepiandrosterone. Cette hormone naturelle a précédemment été remarquée comme bénéfique dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire de par ses propriétés vasodilatatrices. Nous avons montré ici qu’en inhibant STAT3 la DHEA possède également des propriétés antiprolifératives et que son utilisation clinique est prometteuse. Durant mes travaux de doctorat, j’ai pu donc mettre en évidence l’implication majeure de l’axe Src/FAK/STAT3/Pim1 dans la pathogénèse de l’hypertension artérielle pulmonaire. J’ai pu proposer diverses solutions thérapeutiques qui pourraient apporter de nouvelles issues cliniques plus ou moins rapidement. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is an obstructive vasculopathy characterized by distal pulmonary arteries lumen obliteration and increased vascular resistances, leading to a rise in pulmonary arterial pressure (PAP) and a compensatory right ventricular hypertrophy. Currently available therapies do not permit to reverse the established process and when the hypertrophy become insufficient, the right ventricle dilates and fails. This phenomenon is due to enhanced proliferation, survival and motility of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs), which acquire a pseudo malignant phenotype. Our group previously described that the transcription factor NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) is involved in these cellular disorders by increasing intracellular calcium level and enhancing proliferation; and by hyperpolarizing the mitochondrial membrane potential and decreasing mitochondrial-dependant apoptosis. In the Chapter 2, we demonstrated for the first time in the pulmonary vasculature, that STAT3 (Signal transducer and activator of transcription 3) regulates directly NFATc2 expression and indirectly NFATc2 activity via the oncoprotein serine/threonine kinase Pim1 (Provirus integration site for Murine Moloney leukemia virus). In vitro and in vivo Pim1 inhibition (in the monocrotaline rat model) is associated with decreased NFATc2 activity and reversion of the malignant phenotype. Moreover, Pim1 deficient mice are resistant to monocrotaline or hypoxia-induced PAH. Finally, we demonstrated that Pim1 expression correlates with disease progression both in animal and human model. Thus, we underlined Pim1 as a potent therapeutic target and an interesting diagnosis tool. In the chapter 3, we showed that the signaling hub c-Src (sarcoma Schmidt-Ruppin A-2 viral oncogene homolog)/FAK (Focal adhesion kinase) is implicated in the regulation of the PASMCs pseudo malignant phenotype, in part by activating STAT3. FAK inhibition in vitro decreases PASMCs proliferation, survival and motility. In vivo, FAK inhibition is associated with decreased PAP and decreased vascular remodeling, making FAK as an interesting therapeutic target. In the chapter 4, we suggest dehydroepiandrosterone (DHEA) as another therapeutical option. This natural hormone is known to be beneficial in PAH through their vasodilating properties. We showed here that by inhibiting STAT3 activation, DHEA also has anti-proliferating properties. Therefore, clinical use of DHEA for PAH can be promising. During my PhD studies, I showed the critical implication of the Src/FAK/STAT3/Pim1 in PAH pathogenesis. I contributed to increase the knowledge on PAH pathogenesis and suggested some therapeutical solutions that can be useful to improve patient outcome.

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Les facteurs de transcription induits par l’hypoxie (HIF) sont responsables de la transcription de nombreux gènes impliqués dans la réponse à l’hypoxie. En plus de réguler de nombreux processus cellulaires et physiologiques, ces facteurs sont impliqués dans plusieurs pathologies. Hétérodimères constitués d’une sous-unité β constitutive et d’une sous-unité α sensible à l’oxygène, ces facteurs sont majoritairement régulés par l’hydroxylation et la dégradation de la sous-unité α. En situation d’hypoxie, ce mécanisme de dégradation est inhibé, ce qui favorise la formation de complexes HIF. Les travaux présentés dans cette thèse visent à élucider les mécanismes régulant l’activation de HIF en situation d’hypoxie ou de normoxie. Dans la section Résultats, vous retrouverez une section consacrée à l’activation de HIF par l’angiotensine II (AngII) chez les cellules musculaires lisses vasculaires. Plus précisément, le rôle de la transactivation de récepteurs à activité tyrosine kinase suivi de l’implication de HIF dans la biologie de ces cellules seront abordés. Dans un deuxième temps, un inhibiteur des métalloprotéases, le BiPS, vous sera présenté comme étant un puissant inducteur des protéines HIF-α. En effet, le BiPS est un puissant inhibiteur des enzymes responsables de la dégradation des protéines HIF-α. En outre, le BiPS permet l’activation des complexes HIF ainsi formés. Ces résultats inattendus pourraient avoir des répercussions importantes dans l’utilisation de cet agent à des fins angiostatiques dans le traitement du cancer en plus de présenter un nouvel agent ayant un potentiel thérapeutique important dans le traitement de pathologies ischémiques. Finalement, vous retrouverez une section consacrée à l’étude d’un nouveau répresseur de HIF, l’histone acétyltransférase HBO1. De façon étonnante, HBO1 réprime l’activité des complexes HIF par un mécanisme indépendant de la stabilisation des sous-unités α mais dépendant du remodelage de la chromatine. En conclusion, ces résultats mettent en lumière de nouveaux mécanismes de régulation de l’activité des facteurs de transcription HIF. Considérant les rôles physiologiques importants de ces complexes ainsi que leurs implications dans diverses maladies, ces résultats permettront d’accroître les connaissances disponibles quant aux fonctions de ces complexes et mèneront vers le développement d’outils thérapeutiques efficaces. / Hypoxia-inducible transcription factors (HIF) are decisive elements in the transcriptional regulation of numerous genes expressed in conditions of hypoxic stress. In addition to their roles in many physiological and cellular processes, HIF are also involved in diverse pathological situations. Obligate heterodimers composed of a constitutive β subunit and of an oxygen tension-regulated α subunit, these transcription factors are mainly regulated by the hydroxylation and subsequent degradation of the α subunit. In hypoxia, this degradation mechanism is inhibited, resulting in HIF complex formation and binding to specific DNA sequences. The work presented in this thesis aims to elucidate regulatory mechanisms involved in HIF activation during hypoxia or in normal oxygen conditions. In the Results section, you will find a study devoted to HIF activation by angiotensin II (Ang II) in vascular smooth muscle cells. Specifically, the role of receptor tyrosine kinase transactivation on HIF activation was evaluated along with a description of HIF-1’s role in smooth muscle cells biology. Next, an inhibitor of matrix metalloproteases, BiPS, will be presented as a novel and potent HIF activator. This unexpected effect may have important implications for the use of this compound for its angiostatic potential in cancer treatment. In addition, BiPS and derivative molecules could also have strong therapeutic potential in ischemic diseases. Finally, you will find a section devoted to the study of a new transcriptional repressor of HIF complexes, the histone acetyltransferase bound to ORC-1, HBO1. Surprisingly, HBO1 represses the activity of HIF complexes by a mechanism independent of the availability of the α subunits, but dependent on a chromatin remodelling event. In conclusion, this thesis highlights new regulatory mechanisms responsible for HIF activation. Considering the important physiological roles of HIF complexes and their implications in the pathogenesis of different diseases, these studies increase the available knowledge concerning the biological functions of these complexes and could contribute to the development of more effective and safe therapeutic tools.