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À mon arrivée dans le laboratoire, les travaux réalisés indiquaient que le trafic des endosomes de recyclage (ERs) vers le Golgi était régulé par les kinases de la famille Src (KFS) et contribuait au remodelage de l’actine induit par différents stress (E4orf4, staurosporine). Or les KFS coordonnent la dynamique de l’actine et le trafic membranaire, mais les mécanismes impliqués demeurent peu caractérisés. Des évidences récentes indiquaient aussi que le trafic endosomal contribuait à la transformation cellulaire induite par des formes oncogéniques des KFS, laquelle est associée à l’assemblage de structures invasives riches en actine (podosomes). En se basant sur ces données, notre hypothèse de recherche était que le transport des ERs vers le Golgi sous le contrôle du rétromère, un régulateur majeur des voies de transport rétrograde, pourrait contribuer à la formation des podosomes lors de la transformation cellulaire induite par v-Src. Les objectifs du travail présenté dans ce mémoire étaient de caractériser les changements précoces dans le trafic endosomal dépendant du rétromère suivant l’activation de v-Src et d’adresser leur contribution dans la formation des podosomes. Mes travaux ont tiré profit de l’utilisation d’un modèle permettant l’activation rapide d’un mutant thermosensible de v-Src dans des cellules épithéliales MDCK. J’ai ainsi pu observer dans ce modèle une polarisation précoce des ERs autour des podosomes en formation. Une augmentation dans le nombre et la morphologie des endosomes rétromère-dépendants (Vps26) a été mesurée et coïncidait avec un transport accru de cargos dépendants du rétromère vers le Golgi. Notamment, l’inhibition de Rab7, un régulateur du rétromère, interfère avec la formation des endosomes Vps26-positifs et des podosomes. En conclusion, mes résultats suggèrent que v-Src active les voies de transport dépendantes du rétromère pour mobiliser des protéines de signalisation et/ou des lipides bioactifs nécessaires au remodelage polarisé de l’actine et à la formation des structures invasives.

La chromatine, dont l’unité de base est le nucléosome, est une structure nucléoprotéique dynamique qui nécessite un remodelage au cours de divers processus nucléaires ayant besoin d’un accès direct à l’ADN tels que la réplication, la transcription ou la réparation des lésions. Plusieurs facteurs capables de moduler la structure de la chromatine ont été caractérisés et regroupent les chaperons d’histones, les complexes de remodelage ATP-dépendants, les variants d’histone et les enzymes modifiant les histones de façon post-traductionnelle. Le complexe acéyltransférase NuA4 responsable de l’acétylation des histones H4 et H2A participe activement à la dynamique de la chromatine au cours de ces processus. Il favorise sa relaxation lors de l’activation de la transcription et de la réparation de l’ADN. Il est le seul complexe acétyltransférase dont l’activité est essentielle chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Le but de mon projet de doctorat était de mieux comprendre les mécanismes capables de réguler son activité. Nous avons mis en évidence trois niveaux de régulation de son activité, via (i) son auto-acétylation, (ii) son ciblage à la chromatine de façon spécifique et (iii) directement par son substrat histone. Alors que l’acétylation de la sous-unité Yng2 de NuA4 par le complexe lui-même est importante pour le maintien de l’intégrité du complexe et de son activité, nous avons découvert que NuA4 est capable de s’auto-acétyler in vivo et in vitro sur plusieurs de ces sous-unités et que l’acétylation d’un seule lysine dans le domaine MYST de sa sous-unité catalytique Esa1 est essentielle à l’activité du complexe, sans influencer son intégrité. D’autre part, nous avons caractérisé par des techniques de purification un sous-module de NuA4 composé des facteurs Eaf5, Eaf7 et de la protéine à chromodomaine Eaf3 capable de reconnaître les lysines méthylées, qui serait impliqué dans le ciblage de NuA4 à la chromatine. Ce complexe trimérique est également présent indépendant de NuA4 dans la cellule, et serait localisé de façon préférentielle sur la région codante des gènes. Enfin, les travaux du laboratoire ont montré que les modifications post-traductionnelles présentes sur la queue N-ter de H4 peuvent réguler l’activité de NuA4. La phosphorylation de H4 sur sa sérine 1 inhibe son acétylation sur les lysines adjacentes par NuA4. Alors que nous montrons que cette marque est spécifiquement induite sur la région codante de gènes activés, nos résultats indiquent que cette phosphorylation serait impliquée dans la dynamique de la chromatine au cours de l’élongation de la transcription. / Chromatin, which basic unit is the nucleosome, is a very dynamic structure that requires remodeling during nuclear processes that need to access the DNA such as replication, transcription and DNA damage repair. A number of remodeling factors have been characterized and include histone chaperone, ATP-dependent remodelers, histone variants and post-translational histone modifiers. The NuA4 acetyltransferase complex, responsible for H4 and H2A acetylation, participates in chromatin and nucleosome dynamics associated to these nuclear processes. It was shown to promote chromatin relaxation during transcription activation and DNA repair. NuA4 is the only acetyltransferase complex essential for viability in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The objective of my Ph.D. project was to understand the mechanisms that regulate NuA4’s activity. We brought to the forefront tree different ways to control NuA4’s activity, via its auto-acetylation, its specific targeting to the chromatin and via its histone substrate. While acetylation of the Yng2 subunit of NuA4 by NuA4 itself is important for maintenance of the integrity and activity of the complex, we discovered that NuA4 is capable of in vivo and in vitro auto-acetylation of several of its subunits. In addition, we showed that the acetylation of a single lysine residue located in the MYST domain of the catalytic subunit Esa1 is essential for the activity of the complex and has no effect on its integrity. On another hand, we have characterized a sub-complex of NuA4 composed by the Eaf5, Eaf7 and the chromodomain-containing Eaf3 proteins that are implicated in NuA4 targeting to the chromatin. This trimeric complex is also found in the cell independent of NuA4 and preferentially associated to gene coding region. Finally, published works from our laboratory showed that post-translational modifications of H4 N-ter tail can regulate NuA4 activity. Phosphorylation of H4 serine1 inhibits its acetylation on adjacent lysines by NuA4. We demonstrated that this mark is specifically induced on coding region of active genes and that this phosphorylation would be implicated in chromatin dynamics associated with the transcription elongation process.

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