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Le récepteur nucléaire Fetoprotein Transcription Factor (FTF) identifié par notre laboratoire et exprimé principalement dans le système digestif est un régulateur important du métabolisme des lipides et des stéroïdes, de la prolifération cellulaire et du développement embryonnaire. Plusieurs groupes ont constaté que l’influence du récepteur FTF sur la synthèse de stéroïdes et la régulation du cycle cellulaire stimule la prolifération tumorale de cellules d’origine tissulaire diverse. Mes études de doctorat ont porté sur l’expression tissulaire de FTF, sur la caractérisation d’un nouvel élément régulateur de son promoteur et sur l’identification par immunoprécipitation de chromatine (ChIP-chip) des cibles transcriptionnelles de FTF dans le foie de souris fœtale et adulte et dans les cellules d’hépatome humain. Ces études ont permis de mieux définir le rôle métabolique de FTF ainsi que son rôle développemental et son implication potentielle dans la carcinogenèse hépatique. L’expression de FTF par les organes du système digestif et par certaines structures nerveuses, sa régulation par des récepteurs nucléaires métaboliques et sa liaison aux promoteurs de multiples enzymes et transporteurs impliqués dans le métabolisme énergétique placent FTF dans une position clé dans l’homéostasie métabolique et énergétique de l’organisme. Le facteur de transcription C/EBPpartenaire de FTF au promoteur de l’AFP et impliqué lui aussi dans le développement hépatique et le métabolisme énergétique, est lié au promoteur de 20% des cibles transcriptionnelles de FTF. De plus, C/EBP lie le promoteur de FTF formant ainsi une autre boucle activatrice s’ajoutant au réseau transcriptionnel hépatique. Dans les cellules d’hépatome, FTF lie les promoteurs de plusieurs gènes impliqués dans la prolifération et le maintien des cellules tumorales, soit des régulateurs de la réplication, de la croissance et de l’apoptose cellulaire. FTF fait donc partie intégrante du réseau transcriptionnel hépatique régissant le développement et la différenciation hépatique et le maintien du métabolisme énergétique chez l’adulte et est vraisemblablement impliqué dans la promotion de la cancérogenèse hépatique. / FTF is a nuclear receptor principally expressed in adult digestive organs that has been shown to act as a major regulator of lipids and steroids metabolism, cellular proliferation and embryonic development. FTF involvement in steroid synthesis and cell cycle regulation tends toward the stimulation of tumor proliferation in neoplasic tissues in which FTF is expressed. However, more studies of FTF function in normal and disease states and on its regulation are needed to draw a complete picture of FTF activity in cell physiology. Within the context of my studies, I delineated the FTF adult and fetal tissular expression, characterized a novel Ftf promoter element and identified FTF direct hepatic transcriptional targets in fetal, adult and tumor cell lines by using chromatin immunoprecipitation (ChIP-on-chip). These studies defined new FTF functions in metabolism, fetal development and hepatic carcinogenesis. FTF expression in digestive system and in neural structures controlling eating behavior, its transcriptional regulation by metabolic nuclear receptors and its binding to enzyme and transporter gene promoters driving energy metabolism, puts FTF in a key location for governing cellular and organismal energy metabolism. C/EBP, a transcriptional FTF partner on the Afp gene promoter and also involved in energy metabolism, is bound to 20% of the FTF targets including FTF itself thus adding branches to the complex hepatic transcriptional network. In hepatoma cells, FTF binds to proliferation and tumor cell maintenance genes like replication, growth and apoptosis regulators. Therefore, FTF belongs to the hepatic transcription network that governs hepatic development, differentiation and adult energy metabolism and is likely to be involved in promoting hepatic tumorogenesis.

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une pathologie affectant les artères pulmonaires distales, qui s’obstruent progressivement. Cette obstruction est à l’origine d’une augmentation de la résistance vasculaire pulmonaire et de la pression artérielle pulmonaire qui entrainent alors une hypertrophie ventriculaire droite, puis une défaillance cardiaque droite, dont la majorité des patients HTAP décèdent. Les traitements restent inefficaces pour améliorer la survie des patients. L’obstruction des artères pulmonaires est principalement due à la prolifération et une résistance à l’apoptose des cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP). Ce phénotype n’est pas sans rappeler un phénotype cancéreux. D’ailleurs, le laboratoire a montré qu’un facteur connu pour être surexprimé dans le phénotype cancéreux, NFATc2, est aussi impliqué dans l’HTAP. Ce facteur joue en effet un rôle dans la prolifération et dans la résistance à l’apoptose, en régulant le taux de calcium intracellulaire, le courant potassique (prolifération) et le potentiel de membrane mitochondrial (résistance à l’apoptose). Des travaux plus récents ont également montré le rôle de STAT3 dans l’implication de la surexpression de NFATc2. Nous avons montré dans le chapitre 2 que la molécule d’origine végétale plumbagin (PLB), connue comme étant un inhibiteur de la voie STAT3 dans certaines lignées cellulaires cancéreuses, permet d’inhiber l’augmentation de l’expression et de l’activation de STAT3 des CMLAP. Cette inhibition entraine également la diminution de l’expression et de l’activation de NFATc2, une diminution de la prolifération et de la résistance à l’apoptose. Les mêmes résultats ont pu être répétés sur 2 modèles différents d’HTAP (monocrotaline -MCT- et SUGEN 5416+hypoxie). En effet, le traitement au PLB per os permet de prévenir (MCT) et de renverser (MCT et SU5416) l’HTAP, en diminuant la prolifération et la résistance à l’apoptose. Durant ces travaux de doctorat, j’ai ainsi pu mettre en évidence que le ciblage de la voie STAT3/NFATc2 par le PLB pourrait grandement bénéficier aux patients souffrant d’HTAP de par son effet sur la prolifération, la résistance à l’apoptose et probablement aussi par l’inhibition de l’effet Warburg dans les CMLAP de patients HTAP ainsi que dans 2 modèles pertinents d’HTAP, en prévention et en réversion. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a disease affecting distal pulmonary arteries, which progressively display obstruction. This obstruction is due to the increase of vascular pulmonary resistance and pulmonary arterial hypertension, which thus lead to a right ventricular dysfunction and then to a right heart failure from which most of the patients die. Treatments are still inefficient to improve patients’ outcome. Pulmonary arteries’ obstruction is mainly due to the proliferation and the apoptosis resistance of the pulmonary arteries smooth muscle cells (PASMC), reminding cancer phenotype. Interestingly, the laboratory has demonstrated that NFATc2, a well known overexpressed transcription factor in cancer, is involved in pulmonary arterial hypertension as well. This factor is involved in both proliferation and apoptosis resistance by regulating intracellular calcium rate, potassium current (proliferation) and mitochondrial membrane potential (apoptosis resistance). Earlier results showed that STAT3 is responsible for the overexpression of NFATc2. In Chapter 2, we demonstrated that the vegetal molecule plumbagin (PLB) inhibits STAT3 pathway overexpression and over-activation in PASMC. This inhibition leads to the decrease of the overexpression and over-activation of NFATc2, a proliferation and apoptosis resistance decrease. The same experiments were done in 2 different models of PAH, (monocrotaline –MCT- and SUGEN 5416+hypoxie). Indeed, per os PLB treatment prevents (MCT) and reverses (MCT and SU5416) PAH, by decreasing the proliferation and the apoptosis resistance. During my doctorate work, I was able to highlight that targeting STAT3/NFATc2 by PLB could greatly benefit to PAH patients, by its action on proliferation, apoptosis resistance and probably on the Warburg effect in the human PASMC as well as in 2 relevant PAH animal models, in prevention and reversion.

Pas de résumé / Chronic Kidney Disease (CKD) and its progression has become an important public health issue owing to its strong links to cardiovascular morbidity and mortality. To understand molecular pathways implicated the process of CKD progression is several-fold useful. It can enable drug development inhibiting identified pathways. It provides us with potentially measurable molecules for patient categorisation and treatment. In this translational medicine project, we move from the bench, understanding the role played by signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) to the bedside, measuring and identifying urinary molecules in patients all in the context of CKD progression. Thus we identified potential downstream effectors of STAT3 in CKD progression: lipocalin 2, TIMP1 and PDGFB. To achieve this we combined an approach of in vivo, in silico and in vitro methods. We observed on immunohistochemistry the activation (phosphorylation) specifically of tubular STAT3, in mice sensitive to subtotal nephrectomy (Nx) prior to their development of fibrosis and confirmed that genetic deletion of STAT3 in the tubules protected the mice kidneys. Exploiting microarray data, from remnant kidneys of mice with different susceptibilities to Nx, and combining this with in silico data of potential STAT3 DNA binding sites (DBS) provided genes differentially regulated by STAT3. In the upregulated genes, in which the DBS were conserved in 4 or more species, we identified and confirmed on RT-PCR (both in the remnant kidneys and in a mouse cell line and independently in IMCD3 cells), genes regulated by deletion of STAT3. We specifically studied secreted factors along the hypothesis of a crosstalk between renal tubular cells with activated STAT3 inducing secreted factors to activate nearby resident fibroblasts to secrete collagen and thus induce fibrosis. In parallel, we examined molecules known to be involved in the pathological processes of CKD progression. We rigorously validated the use of 16 commercialised ELISA kits in the urine following strict industry criteria and excluded 14 failing to meet the criteria in a pilot study of 75 subjects. We next took advantage of a well-characterised cohort of 229 patients with CKD with different rates of progression, as determined by serially measured glomerular filtration rates (mGFRs). We measured by the validated ELISA kits the molecules in the urine collected at baseline visit. We identified a combination of urinary biomarkers that can predict fast progression (i.e. degradation in mGFR at > 10% baseline mGFR/ year) after taking into account demographic risk factors for progression and albuminuria. The three biomarkers identified were EGF, MCP1 and TGF-α.

L’anévrisme de l’aorte abdominale (AAA) correspond à une dilatation progressive de l’aorte dont la complication principale, et potentiellement mortelle, est la rupture. La physiopathologie de l’AAA est complexe mais elle comporte une destruction des fibres élastiques liée à l’activité des métalloprotéinases (MMPs) matricielles, une apoptose des cellules musculaires lisses et une infiltration inflammatoire chronique. Actuellement, il n’existe aucun traitement pharmacologique permettant de limiter la progression et la rupture de l’AAA. Les fibroblastes gingivaux (FGs) sont des cellules multipotentes anti-inflammatoires qui permettent une réparation parfaite de la gencive sans cicatrice ni fibrose. Ces propriétés font des FGs un candidat potentiel pour une approche de thérapie cellulaire de l’AAA. Les FGs murins cultivés in vitro produisent une grande quantité de TIMP 1, un inhibiteur des MMPs. Lorsque les FGs sont implantés autour de l’aorte, ils survivent, prolifèrent et s’organisent en une épaisse couche cellulaire au niveau de l’adventice. In vivo, les FGs produisent au niveau de la paroi aortique de l’IL-10, du TGF-β, du collagène et du TIMP-1. Parallèlement les FGs inhibent l’activité protéolytique de la MMP-9. Dans un modèle d’AAA induit par l’élastase, les FGs inhibent la dégradation de l’élastine, l’infiltration macrophagique et lymphocytaire ainsi que la croissance des AAA. L’invalidation génétique de TIMP-1 dans les FG abolit leur effet protecteur sur le remodelage aortique et la formation des AAA. Dans un second modèle d’AAA induit par l’infusion d’angiotensine II et l’injection d’anticorps neutralisant anti-TGF-β, les FGs limitent localement le développement de la maladie vasculaire et préviennent la rupture de l’aorte abdominale. L’ensemble de ces données expérimentales suggère qu’une approche de thérapie cellulaire utilisant les FG pourrait permettre de ralentir la croissance de l’AAA et in fine sa rupture. / Abdominal aortic aneurysm (AAA), frequently diagnosed in old patients, is characterized by chronic inflammation, vascular cell apoptosis and metalloproteinases-mediated extracellular matrix destruction. Depiste improvement in the understanding of the pathophysiology of the aortic aneurysm disease, no pharmacological treatment is available to limit dilatation and/or rupture. In the study reported here, we tested whether periadventitial allograft of GF prevented abdominal aortic aneurysmal growth and rupture in mice and investigated the mechanisms of vascular protection. In vitro, mouse GF proliferated and produced large amounts of anti-inflammatory cytokines and Timp-1, an inhibitor of metalloproteinases. When layed down in the periadventitial abdominal aorta, we documented that GF survived in vivo, proliferated and organized as a thick layer. Furthermore, GF locally produced Il-10, TGF-β and Timp-1. In an elastase-induced AAA, GF prevented both macrophage and lymphocyte infiltration, elastin degradation and aneurysm growth. Specific invalidation of Timp-1 in GF abolished the beneficial effect of cell therapy. In an Angiotensin II/anti-TGF-β model of AAA, GF cell therapy limited AAA development and prevented abdominal rupture. Gingival fibroblast is a promising cell therapy approach to inhibit aneurysmal progression and rupture through the local production of Timp-1.

La tumorigenèse est influencée par des facteurs génétiques et environmentaux. La surnutrition est une cause d'obésité et d'accumulation pathologique de lipides dans le foie, la stéatose, qui peut évoluer en stéato-hépatite. Obésité et stéato-hépatite contribuent à l'augmentation de l'incidence du diabète dans le monde entier. Le diabète et l'obésité sont des facteurs de risque pour le cancer du foie (El-Serag et al., Clin Gastroenterol Hepatol, 2006). Cet projet de thèse élucide les mécanismes moléculaires liant l'activation de la voie de signalisation de l'insuline, les maladies du foie gras et le développement du cancer du foie, et il propose de nouvelles stratégies thérapeutiques. La délétion hépato-spécifique du gène codant le suppresseur de tumeurs Phosphatase and tensin homolog (PTEN) est un modèle de cancer du foie associé à la stéatose (Horie et al., J Clin Invest, 2004). Nous avons utilisé ce modèle, où la cascade de signalisation PI3K/mTOR est activée, pour démontrer que l'induction de l'expression du facteur de transcription et récepteur nucléaire Peroxysome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) est responsable de la stéatose et de la glycolyse aérobie (effet Warburg). Son activité est spécifiquement dépendente de l'activité d'un effectuer en aval de la voie PI3K/mTOR, la protéine sérine/thréonine kinase, AKT2 (Panasyuk et al., Nat Comm, 2012). Sur la base de ces observations, nous avons construit l'hypothèse que PPARγ est un important régulateur de la croissance pathologique et du développement des adénocarcinomes hépatiques associés aux stéato-hépatites. Avec mon travail de thèse j'ai pu démontrer que l'expression et l'activité de PPARγ sont essentielles pour le développement du cancer du foie dans le modèle de souris invalidées pour PTEN dans les hépatocytes. Par ailleurs, la délétion de PPARγ dans le foie dépourvu de PTEN joue un rôle protecteur de la tumorigenèse, confirmant que PPARγ est effectivement placé en aval de AKT2. De plus, nous avons découvert que PPARγ est induit dans des échantillons de carcinome hépatocellulaire humains. Ces échantillons sont caractérisés par leur agressivité (haut taux prolifératif et bas niveau de différentiation) et aussi par l'activation de la voie PI3K/AKT. L'analyse des échantillons humains au stade pré-carcinome (adénomes) nous a permis de démontrer que l'ARN de PPARγ est le plus exprimé dans les adénomes caractérisés par un haut degré de stéatose. Ils sont caractérisés par la perte de fonction du facteur de transcription Hepatocyte Nuclear Factor 1α (HNF1α). Nous avons identifié HNF1α comment un nouveau régulateur négatif de la transcription de PPARγ. Nous avons aussi découvert que l'expression et l'activité de HNF1α sont inhibées par AKT2, induisant l'expression de PPARγ et son activité pro-tumorigénique. Finalement, la sensitibilité de PPARγ aux ligands, naturels et exogènes, nous a encouragé à tester des traitements pharmacologiques pour moduler son activation. La stimulation de l'activité de PPARγ avec l'agoniste synthétique Pioglitazone a conduit à une aggravation des symptomes dans le foie. Par contre, son inhibition par un antagoniste sélectif, SR2595, était thérapeutique, resultant en une réduction de signes pré-tumoraux et tumoraux dans le foie des souris invalidé par PTEN. En résumé, nos études chez l'humain et la souris, révèlent une nouvelle signature d'interaction entre les facteurs de transcription HNF1α et PPARγ et la voie de signalisation de l'insuline, suggérant de nouvelles stratégies thérapeutiques possibles pour le traitement d'une sous-classe spécifique de cancer du foie lié aux stéato-hépatites. / Tumorigenesis is influenced by genetic and environmental factors. Overnutrition leads to obesity and fatty liver disease, contributing to increase diabetes incidence worldwide. Diabetes and obesity are independent risk factors for liver cancer development (El-Serag et al., Clin Gastroenterol Hepatol, 2006). This PhD project elucidates the molecular mechanisms linking activated insulin signalling pathway, fatty liver disease and liver cancer development and proposes novel therapeutic strategies. The hepatocytes-specific deletion of tumour suppressor Phosphatase and tensin homolog (PTEN) is a model of steatosis-associated liver cancer (Horie et al., J Clin Invest, 2004). Using this model of activated PI3K/mTOR signalling, our laboratory discovered that the nuclear receptor transcription factor Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ) is induced in PTEN-null liver. My group demonstrated that in the liver PPARγ contributes to steatosis and aerobic glycolysis. Its activity specifically requires a downstream effector in the PI3K/mTOR pathway, the serine/threonine-specific protein kinase AKT2 (Panasyuk et al., Nat Comm, 2012). Based on these observations, we hypothesized that PPARγ might be an important regulator of pathological growth and development of steatohepatitis-associated liver adenocarcinomas. In my PhD work, I demonstrated that PPARγ expression and activity is essential for liver cancer in PTEN mutants. Moreover, PPARγ is induced in human samples of Hepatocellular Carcinoma (HCC) characterized by poor differentiation accompanied by the activation of PI3K/AKT pathway. We could attribute to PPARγ a specific role in tumour formation as it is required for abnormal liver growth and steatosis in mice at pre-tumoral age. In addition, deletion of PPARγ in PTEN mutants protected animals form liver tumorigenesis placing PPARγ downstream of activated AKT2. Analysing human samples of pre-carcinoma lesions characterized by high steatotic rate, we demonstrated that PPARγ transcript levels are increased in a specific subgroup of adenomas characterized by loss-of-function mutations in the Hepatocyte Nuclear Factor 1α (HNF1α). We identified HNF1α as a novel direct negative regulator of PPARγ transcription. We also revealed HNF1α expression and activity inhibited by AKT2 and thereby inducing PPARγ pro-tumorigenic action. Finally, the sensitivity of PPARγ to natural and exogenous ligands encouraged us to perform treatments to pharmacologically modulate PPARγ activity. Further activation of PPARγ with its synthetic ligand pioglitazione dramatically aggravates liver disease. While PPARγ inhibition by selective antagonist SR2595 allowed to reduce the pre-tumoral and tumoral signs of PTEN-null mice. In sum, our studies in men and mice reveal a novel pro-tumorigenic network of transcription factors HNF1α and PPARγ downstream of activated insulin signalling pathway, suggesting possible strategies for treatment of a subgroup of steatohepatitis-associated liver cancer.