Newly synthesized soluble lysosomal proteins are transported from the Golgi apparatus to the lysosomes by two mannose 6-phosphate receptors. However, the sphingolipid activator protein prosaposin is targeted by the alternative trafficking receptor, sortilin. Prosaposin is the precursor of four lysosomal saposins required for the hydrolysis of sphingolipids. A previous study demonstrated that the removal of its C-terminus abolished the trafficking of prosaposin to the lysosomes. / To identify the sequences and amino acids involved in the interaction of prosaposin to sortilin and its transport to the lysosomes, we generated six prosaposin deletion constructs and examined the effect of truncation by co-immunoprecipitation and confocal microscopy. The experiments revealed that a 17 amino acid stretch in the first half of the C-terminus (aa524-540) was necessary for the binding of prosaposin to sortilin and essential for its transport to the lysosomes. / Since the pH is able to induce conformational changes in the four saposin domains, we performed a pH-dependent binding assay to test whether or not the binding of prosaposin to sortilin was affected by different pHs. The experiments demonstrated that binding of prosaposin to sortilin occurred at 6.0 or higher. A substantial decrease in binding was detected at pH 5.5, and at pH 5.0 both proteins did not form complexes. This result indicated that the binding of prosaposin to sortilin is pH-dependent. / Since hydrophilic residues usually modulate pH-dependent protein interactions we introduced six site-directed point mutations in hydrophilic residues within the first half of the C-terminus. The results showed that the mutation of single hydrophilic amino acids did not affect the binding of prosaposin to sortilin. / Considering that tryptophan, cysteine and proline residues are important in protein structure and function, we also introduced eight site-directed point mutations to these residues within the 17 amino acid stretch in the C-terminus. The experiments revealed that two tryptophans (W530 and W535), and two cysteines (C528 and C536) were essential for the transport of prosaposin to the lysosomes. In addition, one proline residue (P532) was critical for the proper folding of prosaposin during its synthesis, which was demonstrated by the MG132 Proteasome Inhibition Assay. / In conclusion, we have narrowed down the sortilin recognition site on the prosaposin molecule to a specific 17-residue stretch in the first half of the C-terminus and discovered the essential residues in this region for the lysosomal trafficking of prosaposin. / Les protéines lysosomiales solubles récemment identifiées et synthétisées sont transférées de l'appareil de Golgi des cellules vers les lysosomes par deux récepteurs, des mannoses 6-phosphates. Cependant l'activateur sphingolipidique de la prosaposine est ciblé sur la lysosomes par un récepteur alternatif, la sortiline. La prosaposine est le précurseur de quatre saposines lysosomiales requises pour l'hydrolyse des sphingolipides. Une étude récente a déjà démontré que l'élimination de la terminaison-C de la sphingolipide empêche le transport de la prosaposine vers les lysosomes. / Pour identifier les séquences d'acides aminés impliqués dans l'interaction de la prosaposine avec la sortiline et ainsi clarifier le mode de transport de ces séquences vers les lysosomes, nous avons procédé, par co-immunoprécipitation et immunomicroscopie confocale et à l'élimination de six séquences distinctes de la saposine. Ces expériences ont montré que la première moitié de la terminaison-C (aa524-540) la séquence des 17 résidus peptidiques est nécessaire pour permettre la liaison de la sortiline à la prosaposine et le transport de la prosaposine vers les lysosomes. fr / Le pH du milieu agit sur l'interaction d'un ligand à son récepteur. Nous avons donc analysé la liaison de la prosaposine à la sortiline à différents pH. Les résultats on montré que la liaison de la prosaposine à la sortiline se fait à un pH de 6.0 ou plus. Par contre la prosaposine ne forme pas de complexes avec la sortiline à des pH de 5.0 et 5.5. fr / Puisque les résidus hydrophiles modulent normalement l'interaction des protéines nous avons introduit des mutations focales (point mutations) sur six sites de tels résidus hydrophiles de la terminaison-C de la prosaposine. Les résultats ont montré que de telles mutations n'ont aucun effet sur la liaison de la sortiline à la prosaposine. fr / Considérant que le tryptophane, la cystéine et la proline forment des séquences importantes de la structure et de la fonction des protéines, nous avons inséré huit mutations focales additionnelles sur la séquence de 17 résidus de la terminaison-C de la prosaposine. Les résultats ont révélé que deux molécules de tryptophane (W530 etW535) et deux molécules de cystéine (C528 et C536) sont essentielles au transport de la prosaposine vers les lysosomes. Par ailleurs, une molécule de proline (P532) provoque la dégradation de la prosaposine par des protéosomes. fr / En conclusion nous avons circonscrit certains aspects moléculaires de la relation de la sortiline à la prosaposine. Nous avons montré en particulier que la liaison de la sortiline à la prosaposine se situe au niveau d'un site précis du segment de la terminaison-C de la prosaposine dont certains éléments jouent un rôle essentiel dans le transport de la prosaposine vers les lysosomes. fr

Autophagy and apoptosis are two major signaling pathways employed by the cell in response to various stress-induced signals in order to manage such stress and ultimately to determine cellular survival or death. Central to the regulation of both pathways is the BCL-2 protein family. At the endoplasmic reticulum (ER) the pro-survival BCL-2 protein targets multiple protein complexes, which influence Ca2+ homeostasis, as well as the outcome of apoptosis and autophagy pathways. To understand how BCL-2 is partitioned between these complexes, we sought to identify BCL-2-interacting proteins at this site. Here I present the identification and characterization of NAF-1, a novel ER BCL-2-interacting partner. Interestingly, NAF-1 is required for BCL-2 antagonism of autophagy, but is not required by BCL-2 to antagonize apoptosis initiated at the ER by the BH3-only protein BIK. NAF-1 contributes to the physical interaction between BCL-2 and the autophagy effector Beclin 1, which is essential for functional inhibition of autophagy by BCL-2. Thus, NAF-1 targets BCL-2 to the autophagy pathway at the ER. Furthermore, NAF-1 is found in association with the IP3R ER Ca2+ efflux channel, and mediates BCL-2 regulation of ER Ca2+ stores. Ectopic expression of ER-targeted BCL-2 reduces ER Ca2+ content and NAF-1 is required for this process. In response to nutrient deprivation, autophagy induction is accompanied by an early release of ER Ca2+ stores. Cytosolic Ca2+ is required for autophagy in response to starvation, suggesting that the release of Ca2+ from the ER may be an essential signal for autophagy induction and, in addition to direct sequestration of Beclin 1, a mechanism of inhibition by BCL-2/NAF-1. To study the physiological contribution of the Naf-1 gene, we generated Naf-1 knockout mice. These mice begin to manifest signs of severe muscle degeneration between 2-3 months of age, and exhibit increasingly poor performance status until mortality at 6-9 months. Immortalized MEF cell lines were generated and will be utilized in conjunction with the Naf-1 knockout mice for future elucidation of NAF-1 function.In summary, this thesis provides a thorough analysis of a novel ER BCL-2-interacting partner, NAF-1, and provides further insight into the mechanism of autophagy regulation by BCL-2. / L'autophagie et l'apoptose sont les deux voies principales de signalisation employées par les cellules afin de répondre à des signaux de stress et de sélectionner la survie ou la mort cellulaire. La famille de protéines BCL-2 est l'un des éléments essentiels à la régulation de ces deux voies de signalisation. La protéine anti-apoptotique BCL-2 du réticulum endoplasmique (RE) cible plusieurs complexes de protéines, ce qui influence l'homéostasie du Ca2+, l'autophagie et l'apoptose. Afin de comprendre comme BCL-2 interagit avec ces complexes protéiques, nous avons cherché à identifier de nouvelles protéines qui interagissent avec BCL-2 dans le RE. Dans ce travail, nous montrons l'identification et la caractérisation de la protéine NAF-1, une nouvelle protéine qui interagit avec BCL-2 du RE. BCL-2 requiert la protéine NAF-1 pour antagoniser l'autophagie, mais NAF-1 n'est pas requise pour antagoniser le processus apoptotique qui est initié au RE par la protéine BIK. En outre, NAF-1 contribue à l'interaction physique entre BCL-2 et l'effecteur de l'autophagie Beclin 1. Cette interaction est essentielle à la régulation négative du processus autophagique par BCL-2. En conséquence, NAF-1 cible BCL-2 vers la voie autophagique au RE. En outre, NAF-1 s'associe au canal calcique IP3R du RE et sert également d'intermédiaire à la régulation de la réserve de calcium au RE par BCL-2. L'expression cellulaire excessive de BCL-2 au RE réduit les réserves de calcium et NAF-1 est requise pour ce processus. Pendant une carence de nutriments, l'induction autophagique est accompagnée d'une libération rapide des réserves de Ca2+ du RE. Puisque le calcium cytosolique est requis pour initier l'autophagie induite par la famine, nos travaux suggèrent que la libération de Ca2+ à partir du RE peut agir comme signal à l'initiation de l'autophagie. Alors, le complexe BCL-2/NAF-1 peut servir, en plus de la séquestration directe de Beclin 1, comme mécanisme d'inhibition de ce signal calcique. Afin d'étudier la contribution physiologique du gène Naf-1, nous avons produit de souris KO du gène Naf-1. Ces souris manifestent des signes de dégénérescence musculaire sévère entre 2-3 mois d'âge. Elles démontrent une détérioration croissante de leurs performances au cours de leur vie, et ce, jusqu'à leur mort à 6-9 mois d'âge. Afin d'éclaircir le rôle de NAF-1, des lignées cellulaires immortalisées MEF ont été générées et elles seront utilisées en combinaison avec les souris KO du gène Naf-1. En résumé, d'une part, cette mémoire fournit une analyse approfondie d'un nouveau partenaire du BCL-2 au RE, NAF-1. D'autre part, elle permet de mieux cerner le mécanisme de régulation de l'autophagie par BCL-2.

Aging is characterized by an imbalance in cellular redox status due to an increase in the production of reactive oxygen species (ROS) and a decreased activity of the cellular antioxidant defenses. Spermatozoa are highly susceptible to oxidative stress and hence this mechanism likely plays a causal role in the deficiencies associated with aging and male reproduction. The goal of this study was to determine the effect of age on antioxidant enzymatic activity, ROS production, and lipid peroxidation in spermatozoa along the epididymis of the Brown Norway rat. Aging significantly decreased glutathione peroxidase (Gpx)-1, Gpx4 and superoxide dismutase (SOD) activities and also significantly increased the production of hydrogen peroxide (H2O2) and superoxide (O2•-). Further, lipid peroxidation was found to be significantly increased in aged spermatozoa. These results indicate that aged spermatozoa are less capable of dealing with oxidative stress and provide a basis for the understanding of decreased spermatozoal quality in aging.

Articular cartilage reduces friction and absorbs shock protecting the moving ends of bones from damage during normal physical activity. These mechanical properties of cartilage result from the physiological activities of chondrocytes, the phenotypically unique cells that produce and maintain the cartilage matrix. The behaviour of these cells is controlled by extracellular milieu components including: matrix molecules, growth factors, calcium and phosphorus. The interaction of these signals maintains the homeostatic balance between anabolism and catabolism in healthy articular cartilage. Unimpeded imbalances between these processes result in disease states such as Osteoarthritis. In this thesis work the specific and combined effects of PTHrP, FGF, calcium and phosphate signalling on cartilage metabolism were studied. PTHrP was shown to localize to the cell nucleus and under conditions of stress prevented cells from progressing in the cell cycle by inhibiting ribosome biogenesis. Furthermore, it was shown that the expression of the phosphate transporter GLVR-1 was inhibited by the presence of PTHrP in a high stress growth environment. Inhibiting the expression of this receptor effectively prevented intracellular accumulation of phosphate and as a result inhibited chondrocyte differentiation processes. Observation of PTHrP -/-/FGFR3-/- double knockout mice showed a dominant role for PTHrP in promoting chondrocyte proliferation, preventing apoptosis and inhibiting terminal differentiation. In contrast, FGFR3 promoted terminal differentiation and apoptosis in the absence of PTHrP. Additionally, studies of primary chondrocyte cultures generated from FGFR3-/- and FGFR3+/+ mice demonstrated impaired mitogenic response and decreased production of collagen II and proteoglycan in response to FGF18 stimulation in the presence of FGFR3, thus, identifying FGF18 as a selective ligand for FGFR3 in chondrogenic cells. / The various studies presented in this thesis show that signals from growth factors, the extracellular matrix and mineral ion components of the extracellular milieu interact to regulate the process of chondrogenesis and identify PTHrP and FGFR3 as potential molecular targets for the bioengineering of cartilage tissue.

Drosophila Lasp is the only member of the nebulin family in Drosophila. Lasp has an amino-terminal LIM domain, two actin-binding nebulin repeats and a carboxyl-terminal SH3 domain and exhibits very high homology to human Lasp. To assess Lasp function in vivo, we generated a null mutant in Drosophila Lasp, named Lasp1. Lasp1 mutants are homozygous viable, but male sterile. Lasp localizes to cyst cells, early germ cells, hub cells and actin cones. In Lasp1 mutants, the stem cell niche is no longer anchored to the apical tip of the testis, and actin cone migration is perturbed resulting in improper spermatid individualization. Lasp colocalizes with βPS integrin and genetically interact with βPS integrin resulting in complete hub cell mislocalization, which indicates that Lasp modulates integrin adhesion in this context. Lasp1 mutant larvae and flies also have impaired crawling, climbing and flying ability. Lasp localizes to Z lines of third instar larval body wall muscles. In Lasp1 mutant indirect flight muscle, thin filament and sarcomere length is reduced while sarcomere ultrastructure is not significantly affected. The same applies to larval body wall muscles, where we observe a misregulation of sarcomere length in both absence and overexpression of Lasp. This phenotype is very similar to nebulin mutant knock-out mice indicating that Lasp plays a role in regulating thin filament lengths, but with only two nebulin repeats. / Chez la drosophile, Lasp est la seule protéine représentante de la famille des Nébuline. Lasp contient un domaine LIM, deux répétitions de type Nébuline et un domaine SH3, et présente une forte homologie avec la famille Lasp des mammifères. Afin identifier le rôle de Lasp, nous avons généré une mutation nulle, nommée Lasp1. Les mutants Lasp1 sont homozygotes viables, mais les mâles stériles. Lasp se localise dans cellules kyste, dans les cellules germinales, les cellules hub et au niveau des cônes d'actine. Chez les mutants Lasp1, les cellules souches ne sont plus ancré à l'extrémité apicale du testicule, et la migration des cônes d'actine est perturbée, conduisant à une individualisation irrégulière des spermatides. Lasp est colocalisée avec l'intégrine βPS et interagit génétiquement avec l'intégrine βPS, amenant une délocalization des cellules hub, indiquant que Lasp module adhésion intégrine dans ce contexte. Les larves mutantes pour Lasp se déplacent avec difficulté et les adultes ont avec une capacité d'escalade et de vols réduite. Lasp se localise aux lignes Z dans les muscles des larves du troisième stade. Chez les adultes Lasp1, les muscles des ailes présentent une longueur réduite des filaments minces ainsi que des sarcomères, alors que l'ultrastructure du sarcomère ne semble pas être significativement affectée. Les muscles larvaires présentent le phenotype. De plus, on observe un dérèglement de la longueur du sarcomère en surexprimant Lasp dans un contexte sauvage. Ce phénotype est très similaire à celui des souris mutantes pour la nébuline, indiquant que Lasp joue un rôle dans la régulation de la longueur du filament mince, mais avec seulement deux répétitions nébuline.

Cardiac ischemia results in cardiomyocyte death in part due to apoptosis. Gene therapeutic approaches using the introduction of anti-apoptotic sequences directly into the infarcted heart is being evaluated for the therapeutic value of limiting cell death. In spite of many advances in human genomics, the complete repertoire of cardiac anti-apoptotic genes remains unknown. To increase our understanding of cardiac apoptosis, it is essential that we work towards indentifying and characterizing the repertoire of anti-apoptotic sequences in the human heart. Our laboratory has exploited the observation that many of the processes involved in mediating apoptosis are evolutionary conserved between metazoans and yeast. By screening a human cardiac cDNA library in yeast cells conditionally expressing mammalian pro-apoptotic Bax, our laboratory has identified over 60 clones capable of preventing the deleterious effects of Bax in yeast. The research presented here looks beyond yeast to assess the possible anti-apoptoic effects of these clones in mammalian cells. The protein evaluated here is deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase). We show that in addition to the anti-apoptotic effects in yeast, dUTPase demonstrates an anti-apoptotic effect in mammalian C2C12 myoblasts subject to oxidative stress-induced apoptosis. These results serve to further exemplify the similarities between the process of anti-apoptosis in yeast and human cells. In addition, dUTPase may have therapeutic value of limiting cell death in the infracted heart. / L'ischémie cardiaque provoque la mort des cellules myocardiques en partie en raison de l'apoptose. Des thérapies géniques basées sur l'introduction directe des gènes anti-apoptotiques dans l'infarctus du myocarde sont actuellement en train d'êtres évalués à leur capacité de limiter la mort cellulaire programmée après une crise cardiaque. En dépit du progrès de la génétique humaine, le répertoire complet des gènes cardiaques anti-apoptotiques reste peu connu. Afin d'accroître notre compréhension de l'apoptose cardiaque, il est essentiel d'identifier et caractériser le répertoire des gènes anti-apoptotiques dans le cœur humain. En effet, il a été prouvé que le mécanisme moleculaire de l'apoptose est conservé le long de l'évolution entre les métazoaires et la levure. En examinant les effets anti-apoptotiques d'une banque d'ADNc cardiaque dans des cellules de levure exprimant conditionnellement le pro-apoptotique Bax des mammifères, notre laboratoire a identifié plus de 60 clones capables de prévenir les effets délétères de Bax chez la levure. Le présent travail montre également les effets potentiels anti-apoptotiques de ces gènes chez des cellules mammaliennes. Nos resulats ont prouvé aussi que la protéine désoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase) a un effet anti-apoptotique en prévenant le processus apoptotique induite par le stress oxydatif dans les myoblastes mammaliennes C2C12. Ces résultats servent à illustrer les similitudes entre le processus anti-apoptotique chez la levure et les cellules humaines et, indiquent que la dUTPase pourrait avoir un intérêt thérapeutique afin de limiter la mort cellulaire dans les infarctus cardiaques. fr

Transforming Growth Factor β (TGF-β) is a multifunctional cytokine that plays a critical role in cell growth, differentiation and extracellular matrix deposition. Dysregulation of its pathway has been implicated in tissue fibrosis and cancer. TGF-β signals via the type I (TGFBR1) and type II (TGFBR2) receptor complex, which phosphorylates their intracellular substrates, SMAD2 and SMAD3. The phosphorylated SMAD2/3 then forms a complex with SMAD4 and regulates target gene expression. Alternatively to the SMAD2/3 (canonical) pathway, TGF-β also elicits signalling via non-canonical pathways, such as the ERK and p38 MAPK pathways. TGF-β receptors internalize via the clathrin-coated pits route, which facilitates SMAD2/3 signalling, and via the caveolae route, which is associated with receptor degradation and with MAPK activation. Little is known regarding the factors regulating TGF-β receptor compartmentalization and turnover. Previously, CD109 was identified in our lab as a GPI-anchored protein that binds TGF-β and forms a heteromeric complex with the TGF-β receptors. The results presented here demonstrate that CD109 inhibits SMAD2/3-dependent signalling and responses, such as TGF-β-induced growth inhibition. Together, these results suggest that CD109 is a novel TGF-β co-receptor that negatively regulates TGF-β signalling. I then explored the mechanism by which CD109 regulates TGF-β action. My results indicate that CD109 increases TGF-β receptor internalization via the caveolar pathway and enhances TGF-β receptor degradation by the E3 ubiquitin ligase Smurf2, leading to inhibition of TGF-β signalling.Because TGF-β is a potent inducer of epithelial-mesenchymal transition (EMT), a process involved during cancer invasion and metastasis, I next investigated the role of CD109 in this process. CD109 inhibits TGF-β-induced EMT in both non-tumorigenic keratinocytes and squamous cell carcinoma cells via the SMAD and ERK and p38 MAPK pathways. Indeed, CD109 modulates TGF-β-induced MAPK activation, in a caveolin-1 dependent manner. Collectively, these data suggest that CD109 exerts its function by promoting TGF-β receptor localization to caveolae, thereby accelerating their degradation and modulating TGF-β canonical and non-canonical signalling. Thus, CD109 may play a critical role in pathologies where TGF-β signalling is dysregulated, such as cancer progression. / Le TGF-β (facteur de croissance transformant β) est une cytokine multifonctionnelle jouant un rôle important dans la croissance, la différentiation cellulaire et la déposition de la matrice extracellulaire. La dérégulation de la cascade de signalisation du TGF-β peut engendrer la fibrose des tissus ou des cancers. Le TGF-β transmet son signal grâce aux récepteurs de type I (TGFBR1) et de type II (TGFBR2), qui phosphorylent leurs substrats intracellulaires, SMAD2 et SMAD3. Les SMAD2/3 phosphorylées s'associent à SMAD4 et régulent l'expression de gènes cibles. En plus de la voie canonique de SMAD2/3, le TGF-β transmet aussi son signal par des voies non-canoniques, telle les voies des MAPKs p38 et ERK. Les récepteurs du TGF-β sont internalisés dans des puits recouverts de clathrine (ce qui facilite la voie des SMAD2/3) et dans les cavéoles (ce qui entrainent la dégradation des récepteurs et l'activation des MAPKs). Peu de choses sont connues sur les facteurs régulant la compartimentalisation et la dégradation des récepteurs du TGF-β. CD109 a été identifié précédemment dans notre laboratoire en tant que protéine à ancre GPI capable de se lier au TGF-β et de former un complexe avec les récepteurs du TGF-β. Les résultats présentés ici démontrent que CD109 inhibe la voie des SMAD2/3 et leurs réponses associées, telles l'arrêt de la croissance cellulaire. Tout ceci suggère que CD109 est un nouveau co-récepteur du TGF-β régulant de manière négative le signal du TGF-β. J'ai ensuite exploré les mécanismes par lesquels CD109 régule l'action du TGF-β. Mes résultats indiquent que CD109 augmente l'internalisation dans les cavéoles des récepteurs du TGF-β et leur dégradation par l'E3-ubiquitine ligase Smurf2, conduisant ainsi à l'inhibition du signal du TGF-β.Comme le TGF-β induit l'EMT (transition épithélium-mésenchyme), j'ai examiné le rôle de CD109 dans ce processus impliqué dans les métastases cancéreuses. CD109 inhibe l'EMT dans les keratinocytes non tumorigéniques et dans les cellules de carcinomes squameux, via les voies des SMADs et des MAPKs p38 et ERK. CD109 régule l'activation des MAPKs, par un processus qui dépend de la cavéoline-1. L'ensemble de ces données suggèrent que CD109 exerce ses fonctions en facilitant la localisation des récepteurs dans les cavéoles, accélérant ainsi leur dégradation et modulant les voies canoniques et non canoniques du TGF-β. CD109 pourrait donc jouer un rôle crucial dans les pathologies où l'action du TGF-β est dérégulée, comme la progression des cancers.

Epithelial morphogenesis requires cell shape changes coordinated by local modulations of the actin cytoskeleton. We identify a role for Echinoid (Ed), a homophilic binding cell adhesion molecule, in the generation of contractile actomyosin cables that drive epithelial morphogenesis in both the Drosophila ovarian follicular epithelium and embryo. Specifically, we demonstrate that such contractile structures form at the interface of cells expressing and lacking Ed. Analysis of such interfaces generated by ed mutant follicle clones indicates that the juxtaposition of wild type and ed mutant cells results in the asymmetric localization of Ed in the wild type cell, which is sufficient to trigger the formation of an actomyosin cable at the clone interface. In wild type ovaries and embryos, specific cell types lack Ed, thus creating endogenous interfaces between cells with and without Ed; these interfaces display the same contractile cable as Ed interfaces created by ed mutant clones. In the ovary, this boundary lies between the two cell types of the dorsal appendage primordia. In the embryo, the absence of Ed from the amnioserosa during dorsal closure generates an Ed expression interface with the lateral epidermis, which coincides with the well-characterized actomyosin cable present in the epidermal cells at this interface. In both cases, elimination of Ed leads to the loss of the actomyosin cable causing subsequent defects in morphogenesis. Furthermore, we found that the asymmetric distribution of Ed in cells abutting Ed non-expressing cells is essential to polarize the actin regulators Diaphanous, Enabled and RhoGEF2 and downregulate the polarity protein Bazooka at the face of the cell where the actomyosin cable assembles. We conclude that the asymmetric distribution of Ed polarizes the actin cytoskeleton thus triggering the local and coordinated assembly of actomyosin cables at differential Ed interfaces. Disruption of the asymmetric distribution of Ed by e / La morphogénèse des épithelia requiert la coordination du movement des cellules par la modulation du cytosquelette d'actine dans chacune d'elles. Nous avons identifié un rôle pour Echinoid (Ed), une molecule d'adhésion à interaction homotypique, au cours de l'assemblage des câbles contractiles d'actomyosine qui promouvoient la morphogénèse des épithelia folliculaires ovariens et embryonaires chez la drosophile. Spéciquement, nous avons démontré que les structures d'actomyosine sont assemblées à l'interface entre des cellules qui expriment et d'autres qui n'expriment pas Ed. L'analyse de ces interfaces créées par la juxtaposition de cellules de type sauvage et de cellules mutantes pour ed causent la distribution assymmétrique de Ed dans la cellule de type sauvage ce qui promouvoit la formation du câble d'actomyosine à cette interface. De plus, certains types de cellules ovariennes et embryonaires n'expriment pas Ed de manière endogène créant ainsi des interfaces d'expression de Ed; ces interfaces assemblent aussi un câble contractile comme celles créées par les clones de cellules mutantes pour ed. Dans l'ovaire, ces interfaces se créent au contact des deux types de cellules qui formeront les appendices dorsaux. Dans l'embryon, l'absence de Ed dans l'amniosérose durant la fermeture dorsale génère une interface d'expression de Ed avec l'épiderme qui coincide avec la présence d'un câble d'actomyosine à cette interface. Dans chacun de ces cas, l'élimination de Ed cause la perte du câble menant à une morphogénèse aberrante. Nous avons aussi trouvé que la distribution assymmétrique de Ed dans les cellules adjacentes aux cellules qui n'expriment pas Ed est essentielle afin de polariser la localisation des régulateurs d'actine Diaphanous, Enabled et RhoGEF2 ainsi que la protéine de polarité Bazooka à la face de la cellule où le câble est assemblé. L'expression ectopique de transgènes codant pour Ed dans l'amniosé

In the first part of the thesis two ABC transporters in mammalian cells are explored. Initially, the expression of members of the ABC family of transporters in erythrocytes was measured. It was found that ABCG2 (also known as the breast cancer resistance protein, BCRP, the mitoxantrone resistance protein, and ABC placenta) was expressed in mature human erythrocytes. This work concentrated on characterizing the oligomerization of ABCG2 in membrane extracts from tumour cells and human erythrocytes. Given the ability of ABCG2 to transport protoporphyrin IX or heme, these findings may shed some light on the normal function of erythrocytes. The second chapter of the thesis attempts to elucidate the drug binding characteristics of ABCC2 (MRP2). A radiolabelled photoreactive analogue of LTC4 (IAALTC4) was synthesized and used to carry out photoaffinity labelling experiments; a technique used to predict drug binding to a target protein. LTC4 is an endogenous substrate of ABCC2 since previous reports have shown LTC4 transport by ABCC2. Our binding studies revealed specific photoaffinity labelling of IAALTC4 to ABCC2 transfected cells. This work shows for the first time the direct binding of LTC4 to ABCC2, and further expands on the current biochemical knowledge of ABCC2. The long-standing drug of choice to treat malaria, chloroquine (CQ), is no longer effective due to increasing drug resistance. The lack of both new drug development and a clear understanding of the mechanism(s) of drug resistance have made achieving the global initiative to halve the malaria burden by the year 2010 more problematic; this aim now requires alternative methods of treatment to CQ. Therefore, the second main objective of this thesis was to address the growing problem of malaria drug resistance by exploring alternative therapies and a potential modulator of CQ resistance. In the third chapter, modulators of MRP1-mediated resistance were explored in chloroquine-sensitive and -resista / Dans la première partie de la thèse, deux transporteurs ABC ont été explorés. Initialement, nous avons fait l'analyse des protéines ABC (ATP-binding cassette) dans le globules rouges, en examinant leur niveau d'expression au niveau de leur membrane. Nous avons observé que ABCG2 aussi appelé : "breast cancer resistant protein,-BCRP", "mitoxantrone resistant protein", et "ABC placental", était exprimé dans les globules rouges matures. Ce travaille s'est concentré sur la caractérisation de l'oligomérization de ABCG2 dans la membrane des cellules cancéreuses et dans les globules rouges humaines. Nous savons déjà que ABCG2 transporte la protoporphyrin IX ou hème, alors nous souhaitons que ces résultats ajoutent à la connaissance de la fonction normale des globules rouges. Dans le deuxième chapitre, nous avons exploré les caractéristiques de liaison de ABCC2 (MRP2) avec les substrats. En utilisant un analogue photoréactif de LTC4 (IAALTC4) marqué pour faire des études de photoaffinités, une technique fut utilisée pour prédire la liaison d'un composé sur une protéine. La LTC4 est un substrat naturel (endogène) de ABCC2 et des résultats établis antérieurement ont montré le transport de LTC4 par ABCC2. Nos études de liaisons en photoaffinité demontrent spécifiquement que IAALTC4 trace les cellules transfectées avec ABCC2. Ces résultats montrent pour la première fois, la liaison de LTC4 à ABCC2, tout en nous apportant plus d'information biochimique sur ABCC2. La Chloroquine (CQ) est l'agent chimiothérapeutique le plus rèpandu pour combattre et traiter la malaria; toutefois son efficacité est en constante décroissance due à une résistance du parasite rependue mondialement. Les organismes mondiaux de santé préconisent l'utilisation de type de traitements visant une réduction de 50% du paludisme pour l'année 2010. Toutefois, le manque de nouvelles molécules et l'absence d'une compréhension claire des mécanismes$

The major aim of this work was to develop a cell culture system in which changes in the rate of synthesis of intervertebral disc (IVD) matrix molecules could be evaluated in cells of animals of different ages. In particular, the synthesis of the large aggregating proteoglycans (PGs) and of decorin (DCN) and biglycan (BGN) were investigated. In addition, the potential use of growth factors to modulate the anabolism of these molecules was also studied. The results of these studies have demonstrated that the age related decline in PG biosynthesis observed in human disc tissue can be reflected in a bovine disc cell culture model. The three dimensional alginate bead cell culture model was effective in maintaining the phenotype of disc cells from both annulus fibrosus (AF) and nucleus pulposus (NP) regions in the presence of serum. Differences in phenotype of these respective cells were illustrated in vivo by the patterns of resident PGs obtained from tissue extractions. In the AF of young animals, the predominant form observed was a small PG form while in the NP of all age groups, aggrecan was the major species. In vitro collagen analyses confirmed the different phenotype of cells from the AF and NP regions. Also, TGF-beta1 was effectively used to stimulate over all PG synthesis in NP cells from and young adult bovine. After 10 days in culture, TGF-beta1 treated cells showed similar relative amounts of the small PGs compared to aggrecan as those determined from tissue extractions.