Telomeres and telomerase stand at a junction of cellular processes that govern aging, cancer and disease. Premature aging syndromes and age-related diseases are characterized by short telomeres which compromise cell function and viability, whereas cancer cells are able to reactivate telomerase or alternative lengthening of telomeres (ALT) mechanisms to maintain their telomeres and become immortal.Telomeres and telomerase represent very attractive targets for the development of anticancer therapies. However, there is concern that these therapies may lead to cell resistance, including the reactivation of telomerase or ALT in telomerase-positive cells. Here we show that telomeric recombination can be promoted by telomere-induced dysfunction, an anticancer strategy currently in development, despite the presence of an active telomerase. Our results highlight an important potential mechanism of cancer cell resistance, but might also help to understand the interplay between telomerase and the ALT pathway in the cell. Defective telomere maintenance is associated with premature or accelerated-aging disease. Mutations in almost every component of the telomerase holoenzyme have been found to be implicated in Dyskeratosis congenita (DC), revealing the importance of a functional telomerase for stem cell maintenance and cell proliferative potential. We found that the telomerase component dyskerin is sumoylated on highly conserved lysines and that lysine-to-arginine dyskerin mutants reproduce the phenotype observed in DC. Our findings identify that impaired post-translational modifications can lead to DC, and importantly point to new possibilities in the treatment of DC.Finally, we investigated the complex relationship between telomere maintenance, frailty and cardiovascular disease. We examined the feasability of measuring telomere length as a predictor of morbidity in elderly patients undergoing cardiac surgery. Our preliminary data do not identify telomere length as a predictor of surgery outcomes. Our findings also suggest that telomere length measurement in an epidemiological/clinical context must be interpreted with great caution. / Les télomeres et la télomérase se rencontrent à la jonction de processus cellulaires qui régulent le vieillissement, le cancer et certaines maladies. Plusieurs maladies de vieillissement précoce ou maladies associées au vieillissement sont caractérisées par la présence de courts télomères, qui compromettent la viabilité et la fonction de la cellule, alors que les cellules cancéreuses sont capables de réactiver la télomérase ou un mécanisme alternatif d'élongation des télomères (ALT) pour maintenir leurs télomères et devenir immortelles. Les télomères et la télomérase représentent des cibles très attrayantes pour le développement de thérapies anti-cancer. Il existe toutefois certaines possibilités que ces thérapies conduisent au développement d'une résistance chez la cellule. Ces mécanismes de résistance peuvent inclure la réactivation de l'enzyme télomérase ou réactivation du mécanisme ALT dans les cellules télomérase-positives. Nous démontrons que la recombination des télomères peut être induite par une dysfonction des télomères, une stratégie anti-cancer présentement en développement, et cela malgré la présence de télomérase dans la cellule. Nos résultats mettent l'emphase sur un mécanisme potentiel de résistance, et pourraient aussi permettre de mieux comprendre comment le mécanisme ALT et la télomérase sont régulés dans la cellule. Un maintien déficient des télomères est associé aux maladies de vieillissement précoce ou accéléré. Des mutations dans la majorité des composants de l'enzyme télomérase ont été retrouvées chez des patients atteints de Dyskératose congénitale (DC), révélant l'importance d'une télomérase fonctionnelle pour la fonction des cellules souches et le potentiel réplicatif des cellules. Nous avons identifié que la protéine dyskérine est sumoylée sur des lysines hautement conservées et que la présence de protéines mutantes dans la cellule imite les phénotypes associés à la maladie DC. Nos résultats démontrent qu'un défaut de modifications post-traductionnelles peut conduire à la maladie DC mais surtout, identifient de nouvelles possibilités pour le traitement des patients atteints de DC. Finalement, nous avons investigué la relation complexe qui existe entre le maintien des télomères, la fragilité et les maladies cardiovasculaires. Nous avons examiné le potentiel de mesurer les télomères pour prédire la mortalité et morbidité chez des patients âgés sur le point de subir une chirurgie cardiaque. Nos résultats préliminaires indiquent que la taille des télomères ne peut servir à prédire l'issue d'une chirurgie cardiaque. Nos résultats suggèrent que l'utilisation de la taille des télomères comme marqueur dans un contexte épidémiologique ou clinique doit être étudiée et interprétée avec précaution.

Coxsackie and adenovirus receptor (CAR), a binding receptor shared by subfamilies of Coxsackie viruses and adenoviruses, is an adhesion molecule which plays critical roles in development. CAR is also a putative tumor suppressor, and its expression is silenced or downregulated in a variety of tumor types. However, it is not known how CAR exerts its physiological functions. Our lab has previously reported that CAR is a potent suppressor of glioma cell migration, invasion and tumor growth in vivo, and that the cytoplasmic domain of CAR is required for these inhibitory effects, but the underlying mechanism is not entirely understood.In this thesis, we focused on characterizing the role of the four tyrosine residues, Y269, Y294, Y313 and Y318 in the cytoplasmic domain of CAR. These tyrosines were individually mutated to alanines, followed by expression in a CAR-negative glioma cell model. We found that while Y269 plays a role in mediating adenovirus infection, Y294 plays a role in STAT5 signaling during glioma cell migration. In the context of our studies on Y294, we observed that wild-type CAR inhibits STAT5 activation, its nuclear translocation, expression of its target genes and cell migration induced by growth factors, such as epidermal growth factor (EGF) and insulin growth factor 1(IGF-1). In contrast, Y294A abrogated the inhibitory function of CAR in STAT5 activation, target gene expression and cell migration, suggesting that Y294 is critical for CAR regulation of STAT5 signaling during cell migration. During these studies we also observed that introduction of wild-type CAR into various glioma cell lines invariably resulted in a decrease in the size of the cell nucleus. Three-dimensional reconstruction of confocal images further revealed that nuclear volume was diminished in CAR-expressing cells. Importantly, specific knockdown and conditional knockout of CAR in primary astrocytes resulted in increased nuclear size, suggesting that CAR-mediated nuclear size control is physiologically relevant. CAR localization on the plasma membrane was required for its effect on nuclear size, which could be abrogated by incubation of cells with a neutralizing antibody against the extracellular domain of CAR. We show that an intact cytoplasmic domain, specifically the distal 26 amino acids, is essential for control of the nuclear size in CAR-expressing cells. This domain was previously shown by our lab to interact with actin. Here we provide biochemical and electron microscopic evidence that CAR controls nuclear size and shape through its impact on the polymerization and bundling of the perinuclear actin network. While other tyrosine mutants have the same effect as CAR in reducing nuclear size, the CAR-Y318A does not reduce nuclear size, suggesting that Y318 might play a role in regulating CAR-mediated nuclear size control.In summary, we found that the tyrosine residues in the cytoplasmic domain of CAR play critical roles in various physiological processes, including cell migration, virus infection and nuclear size control. This study extends our understanding on the roles of CAR in cell migration and nuclear size control. / Le récepteur CAR est un récepteur de liaison utilisé par des sous-familles de virus Coxsackie et des adénovirus. CAR est une molécule d'adhésion qui joue un rôle crucial dans le développement de l'organisme. CAR est également considéré comme un suppresseur de tumeur, et son niveau d'expression est diminué ou absent dans une variété de tumeurs. Cependant, on ne connaît pas le mécanisme d'action de CAR dans ces fonctions physiologiques. Notre laboratoire a déjà rapporté que CAR est un suppresseur puissant de la migration des cellules de gliome, de leur invasion et de la croissance tumorale in vivo, et que le domaine cytoplasmique de CAR est nécessaire pour ces effets inhibiteurs, mais le mécanisme sous-jacent n'est pas entièrement connu.Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation du rôle des quatre résidus tyrosine Y269, Y294, Y313, Y318 qui se retrouvent dans le domaine cytoplasmique de CAR. Par la mutation dirigée, ces tyrosines ont été remplacés par des alanines, et le CAR muté a été exprimé dans des cellules de gliomes qui étaient CAR-négatif. Nous avons constaté que Y269 joue un rôle dans la voie d'infection de l'adénovirus, et que Y294 joue un rôle dans la voie de signalisation du facteur STAT5 lors de la migration des cellules de gliome. Dans le cadre de nos études sur Y294, nous avons observé que le CAR type sauvage inhibe l'activation de STAT5, ainsi que sa translocation nucléaire, l'expression de ses gènes cibles et la migration cellulaire induite par des facteurs de croissance tels que le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance insuline 1 (IGF-1). En revanche, Y294A abolit la fonction inhibitrice de CAR envers l'activation de STAT5, l'expression de ses gènes cibles et la migration des cellules, ce qui suggère que Y294 est critique pour la régulation par CAR de la voie de signalisation STAT5 pendant la migration cellulaire.Au cours de ces études, nous avons également observé que l'introduction du CAR type sauvage dans différentes lignées cellulaires de gliomes entraînait invariablement une diminution de la taille du noyau de la cellule. En outre la reconstruction tridimensionnelle des images acquises par microscopie confocale a révélé que le volume nucléaire était aussi diminué dans les cellules qui exprimaient CAR. Le knockdown spécifique et knock-out conditionnel de CAR dans les astrocytes primaires résulta en une augmentation de la taille nucléaire, ce qui suggère que CAR contrôle la taille nucléaire d'une façon physiologique. Nous avons démontré que ces effets nécessitaient que CAR soit à la membrane plasmique et que son domaine cytoplasmique soit intact, en particulier les derniers 26 acides aminés du C-terminus. Notre laboratoire a déjà démontré que ce domaine intéragit avec l'actine. Dans cette thèse nous montrons par analyses biochimiques et microscopie électronique que CAR contrôle la taille et la forme nucléaire par son impact sur la polymérisation et le regroupement du réseau d'actine périnucléaire. Alors que d'autres mutants tyrosine ont le même effet que CAR type sauvage dans la dimunition de la taille du noyau, le CAR-Y318A n'a aucun effet sur la taille nucléaire, ce qui suggère que Y318 pourrait jouer un rôle dans la régulation de la taille nucléaire par CAR.En résumé, nous avons constaté que les résidus de tyrosine dans le domaine cytoplasmique du CAR jouent un rôle crucial dans divers processus physiologiques, y compris la migration cellulaire, l'infection par l'adénovirus et le contrôle de la taille du noyau. Cette étude élargit notre compréhension des rôles de CAR dans la migration cellulaire et le contrôle de la taille du noyau.

The Prion protein (PrP), which is the causative agent of scrapie diseases, has a still unclear physiological function, despite 30 years of research on its nature. However, a preponderance of evidence is beginning to support the idea that cellular prion protein (PrPC) has a pro-survival function. Here, we study the regulation of the prion protein gene (PRNP) in this context, as the regulation of the PRNP gene is not well understood. By homology, we identified in the PRNP a novel promoter element which bears similarity to the Endoplasmic Reticulum Stress Response Element (ERSE). This novel ERSE ("ERSE-26") is able to regulate PRNP endogenously in response to endoplasmic reticulum (ER) stress. In order to determine whether or not the ERSE-26 exists elsewhere in the genome and what is co-regulated with PRNP, we conducted a bioinformatic search and identified 38 other genes with an ERSE-26. Their expression was confirmed by treating cultured primary human neurons and MCF-7 cells with the ER stressors Brefeldin A, Tunicamycin and Thapsigargin and conducting Reverse Transcriptase PCR or Quantitative PCR. We found that the genes SESN2, GADD45B and PRNP were significantly upregulated, and others showed an upward trend. Finally, a luciferase reporter construct containing the ERSE-26 only was used to identify that the ER stress transcription factor XBP1 is a transcription factor that induces ERSE-26 activity. Finally, we conducted a literature search to determine what functions of the cell are co-regulated with PRNP with the ERSE-26. Oxidative stress response and pro-survival genes were found in the ERSE-26 genes and found to be the most upregulated by the ERSE-26, strengthening the case for PrPC as a pro-survival gene. / La protéine Prion (PrP), qui est l'agent infectieux causant les encéphalopathies transmissibles, n'a pas toujours un rôle bien identifié dans la cellule, malgré 30 ans de recherche sur sa fonction physiologique. Cependant, de plus en plus de preuves commencent à impliquer PrP dans des fonctions de protection dans la cellule. Dans cette étude, nous avons étudié la régulation peu connue du promoteur du gène qui encode PrP (PRNP). Par homologie de séquence, nous avons identifié un nouvel élément dans le promoteur de PRNP qui ressemble à l'Endoplasmic Reticulum Stress Response Element (ERSE). Ce nouvel ERSE (appelé ERSE-26) est capable de réguler l'expression du PRNP de manière endogène en réponse au stress dans le réticulum endoplasmique (RE). Pour savoir si l'ERSE-26 existe ailleurs dans le génome et afin de trouver d'autres gènes régulé avec PRNP, nous avons fait une recherche bioinformatique dans le génome entier. Nous avons identifié 38 gènes contenant aussi un ERSE-26 dans leur promoteur. Afin de confirmer l'expression de ces gènes en réponse au stress ER, nous avons traité des cultures de neurones primaires humains et des cellules MCF-7 avec les activateurs du stress RE Brefeldin A, Tunicamycin et Thapsigargin, puis vérifié l'expression par Transcriptase Inverse PCR (RT-PCR) ou RT-PCR quantitative. Nous avons montré l'induction des gènes GADD45B, SESN2 et PRNP, et d'autres ont montré une tendance positive. Ensuite, un plasmide rapporteur luciferase contenant l'ERSE-26 seulement a été utilisé pour montrer que le facteur de transcription du stress ER XBP1 est un facteur de transcription responsable pour l'activité de l'ERSE-26. Finalement, nous avons fait une recherche dans la littérature afin de déterminer la fonction des gènes contenant ERSE-26. Les gènes répondant au stress oxydant et les gènes pro-survie étaient parmi les gènes ERSE-26, et aussi ont été le plus induits, soutenant le rôle protecteur du PrP dans la cellule.

Cancer metastasis is the major cause of death from malignant disease. The biological factors that dictate the secondary site(s) of a primary tumor remain largely unknown, yet their understanding would greatly facilitate the management of malignancy. Matrix metalloproteinases (MMPs) are responsible for the degradation of the extracellular matrix and regulate the tumor microenvironment. The expression of specific MMPs in primary tumors has been correlated with the extent and site of metastatic disease and may therefore potentially be predictive of the preferred site of metastasis. In this study, a subline of the Lewis lung carcinoma (M27 cells) was used to study the role of MMP-3 in lung metastasis as well as elucidate the signaling pathways that regulate its expression in a cellular context where expression of the insulin like growth factor-I receptor (IGF-IR) is altered. Previous work demonstrated that following ectopic expression of the IGF-IR in M27 cells (M27R cells) MMP-3 expression was downregulated and this coincided with a loss of lung metastasis. Here it is shown that the ectopic expression of the IGF-IR downregulates the expression of IκB kinase ε (IKKε). Reconstitution of IKKε expression (M27R/IKKε cells), partly restored MMP-3 expression in M27R cells and furthermore, it sensitized MMP-3 expression levels to induction by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). This induction was, in turn, dependent on protein kinase C (PKC) α and the transcription factor p65. Finally, reconstituting MMP-3 expression in M27R cells enabled their metastasis to the lungs. Collectively, our results implicate IKKε as a regulator of MMP-3 expression and implicate MMP-3 in lung metastasis. / Les métastases sont responsables de la majorité des décès causé par les cancers. Les facteurs biologiques qui déterminent le site des tumeurs secondaires ne sont pas bien compris, mais pourraient aider au traitement de cette maladie. Les métalloproteinases de la matrice (MMPs) sont responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire et en plus, elles sont des régulateurs du microenvironnement. Une corrélation a déjà été montrée entre le profil des MMPs chez les tumeurs primaires et les sites où vont s'implanter les métastases. Dans cette étude, on a examiné le rôle de la MMP-3 dans la capacité à former des métastases d'une lignée cellulaire dérivée de carcinome des poumons de Lewis (M27). De plus, on a examiné les signaux de transduction responsables de la régulation de la MMP-3 dans un environnement où l'expression du récepteur au facteur de croissance à l'insuline (IGF-I) était altérée. Précédemment, on a demontré que l'expression de l'IGF-IR (M27R) régulait négativement l'expression de la MMP-3 et ceci a abrogé les métastases aux poumons. Ici, on démontre que l'expression d'IGF-IR régule négativement l'expression de la kinase IκB ε (IKKε). La surexpression d'IKKε dans les cellules M27R (M27R/IKKε), reconstitue partiellement l'expression de MMP-3 dans les cellules M27R. En addition, l'expression de MMP-3 dans ces cellules peuvent être stimulées suite à l'ajout de phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Cette stimulation dépendait sur la kinase des protéines C (PKC) α et sur le facteur de transcription, p65. Finalement, la reconstitution de l'expression de la MMP-3, dans les cellules M27R, a permis à celles-ci de former des métastases dans les poumons. L'ensemble de nos résultats démontre qu'IKKε participe dans la régulation de l'expression de la MMP-3 et de plus que la MMP-3 serait impliquée dans la formation des métastases aux niveaux des poumons.

The Sonic hedgehog (Shh) signalling pathway is crucial for developmental events such as neural tube patterning and cell proliferation in the cerebellum. Almost all vertebrate cell types possess a primary cilium, an immotile microtubule-based structure that is the site of Shh signalling. Ptch1 and Smo are negative and positive regulators of the Shh pathway whose localization at the primary cilium is Shh-dependent. Recently, it has been shown that Boc, Cdo and Gas1 are required co-receptors of Ptch1, however, it has yet to be discovered whether these co-receptors also re-locate to and from the cilium in response to Shh. Here we show that a sufficient level of Ptch1 is a minimum requirement for recruiting Boc and Gas1 to the primary cilium in the presence of a pathway agonist. Surprisingly Cdo is not recruited to the primary cilium with or without Ptch1, despite its similarity to Boc. Structure-function analysis of Ptch1 and Boc suggests that the cytoplasmic tail is an important domain for their ciliary localization. For Gas1, mutations in regions close to the second GFRα-like domain and GPI tail affect recruitment to the cilium with Ptch1. Finally, we show that the role of Boc and Gas1 at the primary cilium may be to facilitate the removal of Ptch1 in response to Shh ligand, leading to the release of Smo and pathway activation. Altogether, these results improve our understanding of upstream Shh signal transduction and might eventually aid in the development of therapies targeting Shh signalling in developmental disorders and cancers. / La voie de signalisation Sonic hedgehog (Shh) est cruciale pour de nombreux processus développementaux tels que la spécification régionale du tube neural et la prolifération cellulaire dans le cervelet. Presque tous les types cellulaires chez les vertébrés possèdent un cil primaire, une structure immobile et microtubulaire qui est le site de la signalisation Shh. Ptch1 et Smo sont des régulateurs respectivement positifs et négatifs de la voie Shh et leur localisation au cil primaire est dépendante de Shh. Récemment, il a été démontré que Boc, Cdo et Gas1 sont des co-récepteurs requis de Ptch1. Cependant, il n'a pas encore été déterminé si ces co-récepteurs re-localisent au cil en réponse à Shh. Ici, nous montrons qu'un niveau suffisant de Ptch1 est nécessaire au recrutement de Boc et de Gas1 au cil primaire en présence d'un agoniste de la voie. Etonnamment Cdo n'est pas recruté au cil primaire, et ce malgré sa ressemblance structurale avec Boc. L'analyse comparative de Ptch1 et Boc suggère que l'extrémité cytoplasmique a un rôle majeur pour la localisation ciliaire. Pour Gas1, des mutations dans les régions proches du second domaine GFRα-like et de l'ancre GPI affectent le recrutement au cil avec Ptch1. Enfin, nous montrons que Boc et Gas1 dans le cil primaire pourraient faciliter le transport de Ptch1 hors du cil en réponse au ligand Shh. En conclusion, ces résultats permettent de mieux comprendre la transduction du signal Shh et pourraient aider au développement de thérapies ciblant la voie signalisation par Shh dans les troubles du développement et dans les cancers.

Activation of endoplasmic reticulum (ER) stress, notably the unfolded protein response (UPR) and ER-associated degradation (ERAD), contributes to injury in certain renal glomerular diseases. Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) was previously shown to enhance the IRE1α (inositol requiring-1α) branch of the UPR. We propose that PTP1B is an important modulator of complement-mediated glomerular injury, acting via regulation of IRE1α signaling, including c-Jun N-terminal kinase activation and ERAD. To test this hypothesis, we employed PTP1B-deficient mouse embryonic fibroblasts (MEF) and glomerular epithelial cells (GEC) in which PTP1B activity was blocked using a dominant negative cDNA or chemical inhibitor. Complement was activated by incubating cells with antibody, followed by normal human serum, or decomplemented serum in controls. We show that the complement-mediated decrease in the degradation of the ERAD reporter, CD3δ, was attenuated in PTP1B deficient MEF and GEC, implicating PTP1B as a mediator of ERAD. Surprisingly, overexpression of PTP1B produced an effect similar to PTP1B deficiency on ERAD functionality in complement-stimulated GEC. This result suggests that endogenous levels of PTP1B are tightly regulated, and both overexpression and inhibition of this protein are detrimental to ERAD functionality. Complement-mediated cytotoxicity was reduced after PTP1B overexpression, and there was a tendency toward reduced complement cytotoxicity after inhibition of PTP1B. Moreover, we demonstrated that PTP1B knockout mice with anti-GBM nephritis have decreased proteinuria compared to wild type littermates. This protective effect of PTP1B deficiency correlates with the reduced complement-mediated cell death observed in MEF, and suggests that in PTP1B deficient mice, there is reduced proapoptotic signaling in the glomerulus. In conclusion, the results of the present study demonstrate a novel relationship between PTP1B and ERAD. Additionally, the cytoprotective effect of PTP1B deletion in MEF and in anti-GBM nephritis suggests that PTP1B may potentially be a therapeutic target in complement-mediated diseases. / L'activation du stress du réticulum endoplasmique (ER), notamment la réponse au stress des protéines mal repliées (UPR) et la dégradation associée au réticulum endoplasmique (ERAD), engendre des lésions dans certaines maladies glomérulaires rénales. Il a déjà été prouvé que la Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) régule positivement la branche IRE1α (inositol requiring-1α) d'UPR. Nous proposons que PTP1B est un modulateur important de la lésion glomérulaire provoquée par l'activation du système du complément, aidé par la régulation de la signalisation de IRE1α, incluant l'activation de c-Jun N-terminal kinase et ERAD. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé des cellules fibroblastes de souris embryonnaires (MEF) déficientes en PTP1B et des cellules épithéliales glomérulaires (GEC) dans lesquelles l'activité de PTP1B a été bloquée en utilisant un ADNc dominant négatif ou un inhibiteur chimique. Le complément est activé par l'incubation des cellules avec l'anticorps anti-GEC, suivi par une incubation avec du sérum humain normal, ou du sérum décomplémenté chez les cellules témoins. Nous montrons que la diminution de la dégradation du gène rapporteur de ERAD, CD3δ, induite par le complément, a été atténuée dans les MEF et les GEC déficientes en PTP1B, impliquant que PTP1B est un médiateur de ERAD. Étonnamment, la surexpression de PTP1B a produit un effet similaire à une déficience de PTP1B sur la fonctionnalité de ERAD dans les GEC qui sont stimulées par le complément. Ce résultat suggère que les niveaux endogènes de PTP1B sont strictement réglementés, et que la surexpression ainsi que l'inhibition de cette protéine sont nuisibles à la bonne fonctionnalité de ERAD. La cytotoxicité médiée par le complément a été réduite après la surexpression de PTP1B, et on a remarqué une tendance à une diminution de la cytotoxicité du complément après l'inhibition de PTP1B. De plus, nous avons démontré que les souris déficientes en PTP1B à qui on a induit la maladie des anticorps anti-membrane basale glomérulaire (anti-GBM) ont une protéinurie moindre par rapport aux souris témoins. Cet effet protecteur de la déficience en PTP1B est en corrélation avec une diminution de la mort cellulaire médiée par le complément observée dans les MEF, et suggère que les souris déficientes en PTP1B ont une réduction de la signalisation pro-apoptotique dans le glomérule. En conclusion, les résultats de la présente étude montrent une relation originale entre PTP1B et ERAD. En outre, l'effet cytoprotecteur de la suppression de PTP1B dans les MEF et dans la maladie des anticorps anti-GBM suggère que PTP1B peut potentiellement être une cible thérapeutique dans les maladies médiées par le complément.

In vertebrate embryos, the forebrain and eyes are subdivisions of anterior neural tissue. The work here demonstrates a novel regulation of anterior neural development by zebrafish lmo4b. Although these developmental processes have been well studied, it still remains unclear how cells are allotted to and maintained in these subdivided regions. We have identified the zebrafish lmo4b gene and show that it is required to position and maintain proper boundary formation between neural and non-neural ectoderm and by doing so, lmo4b restricts the size of anterior neural tissue. Additionally, lmo4b negatively regulates genes involved in forebrain specification and maintenance such as six3b and rx3, which also promote cell proliferation in anterior neural tissue. Precursors of the peripheral sensory organs (lens, nasal epithelium, inner ear and facial motor neurons) are derived from the placodal primordium that is localized in the boundary region. Therefore, lmo4b may regulate placodal ectoderm development. We also show that lmo4b patterns the eye along the proximodistal axis and is regulated by extracellular signals, Shh and Fgf. Zebrafish lmo4b is initially expressed in the anterior ectoderm at the neural/non-neural boundary, later in the telencephalon, optic vesicles and finally in optic stalk and retinal pigmented epithelium progenitors. With gain- and loss-of-function studies by overexpression assays and morpholino knockdowns, respectively, we are able to integrate lmo4b into an intricate web of previously identified genes and signaling pathways that regulate embryonic forebrain and eye development. lmo4b overexpression produces embryos with relatively normal gross morphology; however, they have reduced, or no eyes, smaller forebrain and craniofacial and fin defects. The lmo4b knockdown phenotype includes expanded anterior neural plate, followed by enlarged forebrain and eyes, abnormal ears and fins. Moreover, closer analyses reveal that lmo4b morphants have increased mitotic cell and total cell nuclei counts in the optic vesicles. We propose that because the initial establishment of the presumptive anterior neural boundary is plastic, lmo4b is an essential modulator in positioning the boundary and consequently controls cell commitment to anterior neural fate and tissue growth. We also propose that lmo4b influences the refining of the compartments within the eye through Shh and Fgf regulation.

This work presents some important results from experimental studies aimed at elucidating the fundamental mechanisms of endothelial cell migration and proliferation. To continuously monitor populations of migrating and proliferating cells, we used video microscopy coupled with a novel computer-automated digital time-lapse recording technique. Migrating cells were identified and their positions at each time instant were obtained using digital image processing. We also developed a modified nearest neighbor tracking algorithm to reconstruct approximations to the cell trajectories. Our experimental studies on the locomotion of bovine pulmonary artery endothelial (BPAE) cells have shown that these cells execute persistent random walks in culture. Cells change their direction of migration either in response to some intracellular signal or because they collide with other cells. Cells slow down as they approach other cells and then turn and move away from each other with increasing speeds. The temporal evolution of population-average speed of locomotion reveals that increases in cell density due to proliferation are immediately accompanied by a decrease in the average cell speed. Markov chain analysis on cell trajectories has shown that the enhanced motility of the BPAE cells cultured with basic fibroblast growth factor (bFGF) seems to be derived not only from fewer visits to the stationary state, but also from a decrease in the waiting time for each visit to the stationary state. BPAE cells execute persistent random walks when they are cultured without or with added bFGF, although the addition of bFGF does make them more motile. An independent set of cell proliferation experiments indicates that bFGF concentrations that increase cell motility also increase cell proliferation rates. A model based on a cellular automaton was developed to describe the proliferation of migrating cells. Our cellular automaton models asynchronous proliferation of cells executing persistent random walks and accounts for changes in the direction of movement when two cells collide. The simulation results reveal that cell motility reduces the adverse effects of contact inhibition on cell proliferation rates. Excellent agreement between model predictions and experimental data was observed indicating that this discrete model can accurately describe the dynamics of populations of migrating and proliferating cells.

Cell culture provides a simple and effective system to study metabolic and cellular processes required for cellular growth in vitro. In this study, we demonstrate that lymphocyte culture can be used as a model system to study the mechanism of insulin resistance (obesity/diabetes) as well as the process of aging of cells from the immune system. Our results indicate that metabolic differences can be observed in lymphocytes from obese subjects and that different degrees of alteration in response can be detected between obese nondiabetic and diabetic subjects. Furthermore different effects of insulin resistance can be reflected faithfully in lymphocyte biochemistry in culture. In isolated lymphocytes from normal weight subjects, G3PDH (an enzyme at the intersection of glycolytic and lipogenic pathways) activity increases in the presence of insulin. Augmented G3PDH activity requires new protein synthesis and involves the inositol triphosphate-diacylglycerol signalling system. However, in obese subjects for whom insulin resistance in vitro can be demonstrated, the extent of insulin stimulation of G3PDH activity is decreased compared to normal weight individuals. These results suggest that G3PDH activity is dependent upon the metabolic state of the subjects from which the cells are obtained. Dietary restriction for obese subjects normalizes insulin and glycerol responses and insulin effects on G3PDH activity. These results demonstrate that the lymphocyte can serve in vitro as a model to reflect organismal metabolism in obesity/diabetes. Alterations of lymphocytes due to aging contribute significantly to changes in immune function. In present study, an artificial aging environment was introduced using whole blood. In this environment, we demonstrate that lymphocytes undergo degeneration and aging processes similar to those observed in vivo. Similar changes in growth capacity, lipid peroxidation, surface antigens on T-cells, and adherent cell suppression were observed in lymphocytes aged in vivo or in vitro. Based on these results, we suggest that blood aged in vitro may provide a simple but effective model to study many aspects of cellular aging in vivo. To further examine this hypothesis and to further understand the aging process, vitamin E was used to examine its effect on in vitro aging. The results from lymphocyte growth capacity assays show that vitamin E provides a protective effect against in vitro aging similar to that observed for in vivo aging. Examination of lymphocytes in culture allows monitoring of biochemical alterations, nutrient requirements, and other parameters in vitro, without effect on the subject. This technique therefore provides an opportunity to examine a wide variety of factors and a system eventually in which mechanisms to prevent or impede diseases can be tested.

Cell adhesion to material surfaces is a fundamental phenomenon in tissue response to implanted devices, and an important consideration in tissue engineering. The first objective of this study was to measure the mechanical adhesiveness characteristics of rabbit articular chondrocytes as a function of seeding time to provide further understanding of the cell adhesion process. The second objective was to quantify the tether formation force and tether stiffness as a function of seeding time. With increasing time of seeding up to 6 hours, chondrocytes exhibited increasing mechanical adhesiveness, tether formation force and tether stiffness, as measured using the cytodetacher and optical tweezers system. Concomitantly, cell contact area and cell height, as measured using inverted microscope and confocal imaging, were found to increase and decrease respectively.