For Escherichia coli, uptake of iron into the cells require FhuA, a TonB-dependent outer membrane receptor. The periplasmic protein FhuD then binds TonB and transfers iron to the cytoplasmic membrane-associated permease FhuB/C. Phage display results predict complementary binding sites on both TonB and FhuD, advocating the need for direct evidence of these interactions. Analytical ultracentrifugation results indicated that both FhuD and TonB were predominantly monomeric in Hepes-NaCl buffer. SEDFIT analysis agreed with their theoretical molecular weights of 32 kDa and 25 kDa, respectively. TonB sedimented at 1.7 S and FhuD at 2.2 S. Frictional ratios confirmed that TonB is elongated while FhuD is globular in solution. For surface plasmon resonance experiments, TonB with a cysteine residue introduced at its N-terminus was immobilized using thiol or amine coupling methods on Biacore sensor chips. Kinetic modeling of FhuD interactions with immobilized TonB indicated that this is a high-affinity interaction (ie. low nanomolar KD) with 1:1 binding stoichiometry. In the presence of ferricrocin, the degree of binding was not altered significantly. Overall, the present data provide the first direct evidence of a specific binding interaction between FhuD and TonB. FhuD has a higher affinity for TonB in absence of siderophores. This suggests that FhuD might be released from TonB upon binding of siderophores, thereby efficiently shuttling ligands to FhuB/C complex on the cytoplasmic membrane.

In Saccharomyces cerevisiae, zinc cluster proteins constitute the major family of transcriptional regulators for a variety of metabolic processes, yet the function of many are currently unknown. Previous studies have characterized Rds2 as a zinc cluster transcription factor that plays a role in antifungal drug resistance, but an exact mechanism is undefined. However, it has been established that Rds2 is a major regulator of gluconeogenesis. In this study, we aim to further mechanistically characterize the role of Rds2 in antifungal drug resistance. Microarray-based expression profiling of both wild type and ∆rds2 strains treated with ketoconazole indicates a greater than 2-fold decreased expression of genes involved in gluconeogenesis and the glyoxylate cycle, such as PCK1, YIG1, and MLS1, in cells lacking Rds2. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) confirmed our microarray data. Furthermore, deletion of these metabolic genes confers azole hypersensitivity. Our preliminary results show that Rds2's role as a regulator of gluconeogenesis and the glyoxylate cycle is linked to its role in antifungal drug resistance. / Les protéines à grappes de zinc constituent le groupe principal de régulateurs de la transcription pour plusieurs processus métaboliques chez la levure Saccharomyces cerevisiae. La fonction de plusieurs de ces protéines reste pourtant inconnue. Plusieurs études ont démontré que la protéine à grappe de zinc Rds2 joue un rôle dans la résistance aux médicaments antifongiques, mais la mécanisme exact reste indéfini. Par contre, il a été clairement démontré que Rds2 est un important régulateur de la gluconéogénèse. Dans cette étude, nous voulons définir davantage la mécanisme de Rds2 dans la résistance aux médicaments antifongiques. Une analyse d'expression par micropuces d'ADN de la souche sauvage et de la souche ∆rds2 exposées au kétoconazole a démontré chez la souche ∆rds2 un niveau d'expression deux fois plus bas des gènes impliqués dans la gluconéogénèse et dans le cycle du glyoxylate, tels que PCK1, YIG1 et MLS1. Une analyse par PCR quantitatif a confirmé les résultats des micropuces d'ADN. De plus, la déletion de ces gènes métaboliques cause une hypersensibilité à l'azole. Nos résultats préliminaires montrent que la fonction de Rds2 en tant que régulateur de la gluconéogénèse et du cycle du glyoxylate est lié à sa fonction dans la résistance aux médicaments antifongiques.

Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) is the causative agent of Johne's disease, a highly prevalent chronic intestinal disease of cattle. It is also the putative cause of Crohn's disease, a chronic inflammatory bowel disease of humans. The MAP genome contains six segments of DNA called large sequence polymorphisms (LSPP) that are not present in its closest evolutionary relatives and were probably acquired through horizontal gene transfer. Together, they comprise 125kb, or 2.5% of the MAP genome, and contain 96 open reading frames. A detailed analysis of MAP evolution led us to hypothesize that the LSPP are pathogenicity islands, encoding genes important for MAP survival or replication in the host. To test this hypothesis, we generated a 5,000-member transposon-mutant library in MAP K-10 and developed a PCR screening method to identify potential mutants of LSPP genes. We succeeded in isolating a mutant of MAP3776c, which encodes a putative zinc siderophore. It is part of a putative five-gene zinc uptake operon that occupies almost the entirety of the insertion sequence, LSPP15. The MAP3776c mutant does not appear to have in vitro growth defects, and it is able to colonize the livers and spleens of C57Bl/6 mice within one week of intraperitoneal infection. Upcoming data from an ongoing, long-term experiment will determine whether the mutant has altered ability to persist in mice. The mutant of MAP3776c and the transposon-mutant library are useful tools for research on MAP genomics and pathogenicity that might ultimately contribute to improvements in vaccines and immunodiagnostics for Johne's disease. / Titre de la thèse : La Mutagénèse de Transposon de Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis pour Investiguer des Zones de Pathogenicité Potentielles. Résumé : Mycobacterium avium sous-espèce paratuberculosis (MAP) est l'agent causal de la maladie de Johne, une maladie chronique intestinale des bétails très répandue. C'est aussi l'agent causal putatif de la maladie de Crohn, une maladie inflammatoire de l'intestin chronique chez l'humain. Le génome de MAP contient six segments d'ADN appelés des grands polymorphismes de séquences (LSPP) qui ne sont pas présents chez les cousins évolutionnaires de cette bactérie et qui furent probablement obtenus par transfert génique horizontal. Ensembles, ils constituent 125kb soit 2,5% du génome de MAP, et contiennent 96 cadres de lecture ouverts. Une analyse approfondie de l'évolution de MAP nous a mené à supposer que les LSPP sont des zones de pathogenicité qui codent des gènes importants pour la survie et la réplication de MAP dans l'hôte. Afin de tester cette hypothèse, nous avons produit une banque de mutants de transposon de MAP de 5 000 membres, et nous avons mis au point des conditions de réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour identifier des mutants potentiels des gènes LSPP. Nous avons réussi à isoler un mutant de MAP3776c, qui encode un sidérophore de zinc. Ce dernier fait partie d'un opéron de cinq gènes pour un système de captation zinc qui prend presque la totalité de la séquence d'insertion LSPP15. Le mutant ne semble pas avoir de défauts de croissance in vitro, et il est capable de coloniser les foies et les rates des souris C57Bl/6 en une semaine à la suite d'une infection intrapéritonéalle. Les données d'expériences en cours à long terme détermineront si le mutant a une capacité modifiée à persister dans les souris. Le mutant de MAP3776c et la banque de mutants de transposon sont des outils avantageux pour la recherche sur la génomique e

A key host innate immune response to pathogens is the rapid activation of "inflammasomes". The inflammasomes are multi-protein complexes that recruit and activate inflammatory caspase-1, which alarms the system through the processing of proinflammatory cytokines to their biologically active forms. Because the inflammasome and mitochondrial apoptosis pathways are evolutionarily related, we hypothesized that cellular inhibitor of apoptosis proteins (cIAPs), negative regulators of apoptotic caspases and cell death, might also regulate caspase-1 and inflammasome activity. Using coimmunoprecipitation assays and in vitro pull-down experiments, we show that both cIAP1 and 2 bound to caspase-1. This interaction was mapped in cIAP2 to its 3 Nterminal BIR domains and the CARD domain of caspase-1. Co-expression of cIAP2 with caspase-1 significantly enhanced caspase-1 catalysis and caspase-1-dependent cell death. Conversely, cIAP depletion with SMAC mimetics or specific immunodepletion of cIAP2 from cytosolic extracts of the human monocytic cell line THP-1 reduced inflammasome activation and the consequent processing of pro-IL-1. In ciap2-/- bone marrow-derived macrophages (BMDM) cultured ex vivo, inflammasome activation was markedly inhibited and IL-1β secretion was consistently dampened in response to various inflammasome agonists. Moreover, ciap2-/- mice injected with either NALP3 agonists alum or MSU, showed decreased neutrophil recruitment into the peritoneal cavity and diminished induction of IL-1β in the peritoneal fluid compared to wild-type controls. Altogether, these results suggest that cIAPs bind to caspase-1 and regulate inflammasome activation, thus amplifying the inflammatory response following pathogen invasion or danger signals. Further characterization of the physiological action of IAPs in innate immunity will help define the potential therapeutic profiles of IAP antagonists in immune-mediated inflammatory disorders. / Un élément essentiel de la réponse immunitaire innée est l'activation rapide de "l'inflammasome". Les inflammasomes sont des complexes multi-protéiniques qui recrutent et activent la caspase-1, une caspase inflammatoire qui actionne le système immunitaire via la modification et la maturation de cytokines pro-inflammatoires. Les voies de signalisation menant à l'activation de l'inflammasome sont apparentées aux voies pro-apoptotiques initiées par la mitochondrie. Nous avons donc présumé que les protéines cellular inhibitor of apoptosis proteins (cIAPs), qui inhibent l'action des caspases apoptotiques et la mort cellulaire, réguleraient aussi l'activité de la caspase-1 et de l'inflammasome. Nous avons utilisé des méthodes de co-immunoprécipitation et de GST pull down pour démontrer que cIAP1 et cIAP2 se lient à la caspase-1. Nous avons identifié que cette interaction se fait entre le domaine BIR N-terminal de cIAP2 et le domaine CARD de la caspase-1. La co-expression avec cIAP2 amplifie la function catalytique de la caspase-1 ainsi que la mort cellulaire caspase-1-dépendente. Inversement, la déplétion des cIAPs par traitement SMAC mimetics ou par immunodéplétion réduit le niveau d'activation de l'inflammasome et son clivage la de pro-IL-1b dans des extraits cytosoliques de la lignée monocytique humaine THP-1. L'activation de l'inflammasome est aussi sévèrement inhibée dans les macrophages primaires de souris ciap2-/- qui produisent moins d'IL-1b en réponse aux stimuli agonists de l'inflammasome. De plus, l'injection d'alum ou de cristaux MSU, deux agonistes de l'inflammasome NLRP3, induit moins de recrutement de neutrophiles et de production d'IL-1b dans le péritoine des souris ciap2-/- que dans les animaux sauvages. En somme, ces résultats suggèrent que les protéines cIAPs se lient à la caspase-1 et régulent l'activation de l'inflammasome, amplifiant ainsi la réponse inflammatoire à l'invasion de pathogènes et aux signaux de danger. Une caractérisation plus approfondie de la fonction des IAPs dans l'immunité innée permettra de mieux définir leur potential thérapeutique dans le traitement des maladies inflammatoires.

This doctoral thesis comprises three parts. The first two parts (Chapter 2 and 3) define the role of the host cell restriction factor tetherin in restriction of HIV-1 cell-to-cell spread. These chapters also characterize the tetherin-inducible cell line Sup-T1 that was used in Chapter 4 to investigate whether the antiviral activity of protease inhibitors might partially be attributed to tetherin modulation. Tetherin is an intrinsic host cell restriction factor that inhibits virus release by linking the viral membrane of the budding virus to the cellular membrane. The antiviral activity of tetherin has been commonly attributed to its cell surface expression. In HIV-1 infections, the viral protein Vpu antagonizes the tetherin-mediated restriction of virus release and downmodulates tetherin from the cell surface. In Chapter 2, we show that tetherin, besides restricting virus release, also restricts direct viral cell-to-cell spread. We also provide evidence that Vpu poses a fitness cost to HIV-1 in regard to cell-to-cell spread in the absence of tetherin, but is necessary for efficient cell-to-cell spread in the presence of tetherin. Tetherin appears also to play a role in synapse formation. In Chapter 3, we characterized cell line specific differences of the tetherin-Vpu interrelation in regard to cell surface expression of tetherin and virus release. However, Vpu-mediated tetherin antagonism in regard to cell-to-cell spread was similar in all cell lines and seemed to be independent of the level of tetherin cell surface downmodulation. In Chapter 4 we assessed whether protease inhibitors, whose antiviral activity partially depends on modulation of transmembrane proteins, may also modulate tetherin cell surface expression and/or the Vpu-mediated downmodulation of cell surface tetherin. As such, modulation was not apparent; thus, the antiviral activity of PIs is unlikely to be influenced by tetherin modulation activity. / Cette thèse de doctorat se compose de trois parties. Les deux premières parties (Chapitres 2 et 3) s'intéressent au rôle du facteur de restriction cellulaire tetherin dans l'inhibition de la propagation du VIH-1 de cellule à cellule. Ces Chapitres décrivent également la caractérisation de la lignée cellulaire Sup-T1 qui exprime la tetherin de manière inductible. Cette lignée cellulaire est utilisée dans le Chapitre 4 pour étudier si l'activité antivirale des inhibiteurs de protéases peut, en partie, être due à la régulation de la tetherin. La tetherin est un facteur de restriction intrinsèque de l'hôte qui inhibe le relargage du virus en liant la membrane virale du virion bourgeonnant à la membrane cellulaire. L'activité antivirale de la tetherin est généralement attribuée à son expression à la surface cellulaire. Dans l'infection par le VIH-1, la protéine virale Vpu empêche l'action de la tetherin et limite son expression à la surface de la cellule hôte. Dans le Chapitre 2, nous montrons qu'en plus d'inhiber le relargage des virions, la tetherin inhibe également la propagation de cellule à cellule. Nos résultats suggèrent que Vpu réduit la capacité infectieuse du virus en l'absence de la tetherin mais est absolument nécessaire à la propagation de cellule à cellule en présence de tetherin. La tetherin semble jouer un rôle dans la formation de synapse intercellulaire. Dans le Chapitre 3, nous analysons des différences entre des lignées cellulaires dans l'interaction fonctionnelle entre Vpu et la tetherin. Ces différences contribuent à la régulation de l'expression de la tetherin à la surface cellulaire et au relargage des virions dans ces différentes lignées cellulaires. Néanmoins, aucune différence dans la régulation de la propagation de cellule à cellule n'a pu être observée. À ce titre, l'inhibition de la propagation de cellule à cellule semble indépendante du niveau d'expression de la tetherin à la surface cellulaire. Dans le Chapitre 4, nous étudions si les inhibiteurs de protéase, dont l'activité antivirale dépend en partie de la régulation de protéines transmembranaires, peuvent également moduler l'expression de la tetherin à la surface cellulaire et/ou l'inhibition de la tetherin par Vpu. Cette étude suggère que l'activité antivirale des inhibiteurs de protéases ne dépend pas d'un effet sur la tetherin.

Mycobacterium tuberculosis, M. bovis and the Oryx bacillus are genetically similar bacteria which cause tuberculosis in distinct host species. The ability of these bacteria to survive and cause disease depends on their capacity to adapt to the various stresses that they are exposed to within their respective hosts. A key mechanism of bacterial adaptation to changing conditions involves alteration of gene expression through the use of alternative sigma factors. SigK is an alternative sigma factor shared by these three bacteria that is responsible for the regulation of a small regulon of 11 genes, including those coding for the antigenic proteins, MPT83 and MPT70. In previously published work, it has been shown that the activity of SigK is controlled by the anti-sigma factor, RskA, and that RskA has undergone independent mutations in M. bovis and the Oryx bacillus, resulting in constitutive SigK activity. To further investigate the regulation of SigK across these three bacteria, a transposon mutant library was created in M. smegmatis to search for additional regulatory partners. Through the use of luciferase reporter plasmids, 1700 transposon mutants were screened for impaired SigK activity. The lipoprotein LppZ was identified as an essential partner for SigK regulation in the context of the Oryx bacillus. Further luciferase assays revealed that LppZ functions through amino acids 122-193 of RskA from M. tuberculosis. LppZ has been mutated in M. bovis and appears to be non-essential in terms of SigK regulation within this bacteria, a result of the mutations in RskAbovis which have created an independent SigK-RskA system which requires no additional partners. Lastly, complementation studies revealed that the full length LppZ including the lipoprotein anchor is required for proper SigK activity. These results further elucidate the complex regulation of SigK between these three bacteria and in the future may help to understand the induction and function of this regulon. / Mycobacterium tuberculosis, M. bovis et le bacille de l'oryx sont des bactéries génétiquement similaires qui causent la tuberculose chez les espèces hôtes distincts. La capacité de ces bactéries de survivre et de provoquer la maladie chez leurs hôtes respectifs dépend de leur capacité à s'adapter aux différents stress qu'ils sont exposés dans l'hôte. Un mécanisme fondamental de l'adaptation des bactéries aux conditions changeantes implique l'altération de l'expression génique, au travers de l'utilisation des facteurs sigma alternatifs. SigK est un facteur sigma alternatif exprime dans ces trois bactéries qui est responsable de la régulation d'un régulon petits de 11 gènes, incluant les protéines antigéniques, MPT83 and MPT70. Dans les travaux déjà publié, il a été démontré que l'activité de SigK est contrôlée par le facteur anti-sigma, RskA, et que RskA a subi des mutations indépendantes dans M. bovis et le bacille d'Oryx, conduisant à l'activité constitutive du SigK. Pour étudier de façon plus précise la façon dont est régulé SigK dans ces trois bactéries, une librairie de transposons mutants a été créé dans M. smegmatis afin de rechercher d'autres partenaires dans la régulation de ce facteur Sigma. Grâce à l'utilisation de plasmides rapporteurs contenant le gène de la luciférase, 1700 mutants transposons ont été examinés afin de connaître l'altération provoquée sur l'activité de SigK. La lipoprotéine LppZ a été identifiée comme un partenaire essentiel pour la régulation du SigK dans le contexte du bacille de l'Oryx. D'autres tests basés sur les propriétés de la luciférase, ont révélé que LppZ fonctionnait grâce aux résidus 122-193 de la RskA de M. tuberculosis. Lppz a été muté dans M. bovis et apparaît comme non essentiel pour la régulation de sigK dans cette bactérie. Ceci est le résultat de mutations dans RskAbovis qui ont ainsi créé une organisation SigK-RskA indépendante, qui ne requiert aucun partenaire supplémentaire. Enfin, des études ont révélé que la longueur totale du LppZ, incluant l'ancrage de la lipoprotéine est nécessaire pour l'activité de SigK. Ces résultats permettent de comprendre la complexité de la régulation de sigK entre ces trois bactéries et pourront, dans de futures études, aider à comprendre l'induction et la fonction de ce regulon.

System biology and fermentation development can be integrated using shotgun proteomics as a monitoring technique. This study established shotgun proteomics methods and bioinformatics workflows to monitor and study the temporal proteome of three different fermentation processes, a) Saccharomyces cerevisiae ethanol fermentation, b) Scheffersomyces stipitis xylose fermentation, c) co-culture fermentation using S. cerevisiae and S. stipitis. This study identified 1,331 non-redundant proteins in S. cerevisiae fermentation, 958 in S. stipitis fermentation, and 1,390 in the co-culture process. The false discovery rates were calculated from 0.16% to 4.22%. Technical replicates throughout the study exhibited high correlations. Throughout the study, rich medium under oxygen limited condition were used, and shotgun proteomics samples were taken between or within the exponential phase and early diauxic shift. The most abundant proteins consisted of translation elongation factors, ribosomal proteins, chaperones and glycolytic enzymes such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, fructose 1, 6-bisphosphate aldolase and enolase. The unexpected observation in S. stipitis included the induction of NAD(P)H-dependent D-xylose reductase and D-xylulose reductase in co-culture process with xylose absent. Continuous expressions of malate synthase and isocitrate lyase before glucose or xylose depletion suggested a different glyoxylate regulatory pathway in S. stipitis. Up-regulation of enzymes involved in various amino acids biosynthesis inferred the lack of amino acid pool in rich medium. Differentially expressed proteins based on label-free quantitation showed steady and consistent decline of ribosomal protein into diauxic shift in S. stipitis. The majority of the up-regulated proteins in late-exponential and early diauxic shift in S. stipitis were involved in carbohydrate metabolism, glycolysis, amino acid metabolism, gluconeogenesis, glyoxylate and oxidative phosphorylation. In S. cerevisiae, the concurrence of ribosomal proteins in both up-and down-regulated proteins demonstrated no discernible pattern. Toward the end of the exponential phase, cytochrome c, F1F0 ATP synthase (oxidative phosphorylation) and pyruvate decarboxylase (committing pyruvate to acetaldehyde) were simultaneously up-regulated. In the co-culture process, S. cerevisiae glycolytic enzymes, ribosomal proteins and chaperones were up-regulated in early diauxic shift after glucose depletion. Shotgun proteomics allowed scientists and engineers to observe the progression and the status of the fermentation, while high-throughput data sets can elucidate yeast physiological states during fermentations. / La biologie systémique et le développement des fermentations peuvent être intégrés à l'aide de la méthode de surveillance dite « protéomique fusil ». La présente étude a mis en place une méthode de protéomique fusil jumelée à un flux de travaux bioinformatiques pour surveiller et étudier le protéome temporel de trois processus de fermentation différents : a) fermentation de l'éthanol Saccharomyces cerevisiae ; b) fermentation du xylose Scheffersomyces stipitis ; c) fermentation de co-cultures mêlant S. cerevisiae et S. stipitis.L'étude a identifié 1331 protéines non-redondantes dans la fermentation de S. cerevisiae, 958 dans la fermentation de S. stipitis et 1390 dans le processus en co-culture. La marge d'erreur a été établie entre 0.16% et 4.22%. Des reproductions techniques au cours de l'étude ont montré une grande reproductibilité et de nombreuses corrélations.L'étude a utilisé un milieu riche limité en oxygène ; les échantillons de protéomique fusil ont été pris entre (ou au cours de) la phase exponentielle et le début de la Diauxie. Les protéines les plus abondantes ont été des facteurs d'élongation, des ribosomes, des protéines chaperon ainsi que des enzymes de glycolyse tels que glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase, fructose-1,6-diphosphate aldolase et énolase.Parmi les observations inattendues dans S. stipitis, on note le déclenchement de D-xylose réductase NADH-dépendant et de D-xylulose réductase dans le processus de co-culture même en l'absence de xylose. Les manifestations récurrentes de synthase de malate et de lyase isocitrique avant l'appauvrissement en glucose ou en xylose suggèrent une voie de régulation de l'acide glyoxylique différente dans S. stipitis. La régulation positive d'enzymes impliquées dans diverses biosynthèses d'acides aminés indique la pauvreté du réservoir d'acides aminés dans un milieu riche. Des protéines s'exprimant différemment sur une base quantificative libre montrent un recul régulier et prononcé de protéines ribosomales durant la Diauxie de S. stipitis. La majorité des protéines positivement régulées à la fin de la phase exponentielle ou au début de la Diauxie de S. stipitis sont impliquées dans le métabolisme des glucides, la glycolyse, le métabolisme des acides aminés, la néoglucogenèse, le cycle du glyoxylate et la phosphorylation oxydative.Dans S. cerevisiae, la présence simultanée de ribosomes dans les protéines à la fois positivement et négativement régulées démontre un mode de comportement complexe et inconstant. Vers la fin de la phase exponentielle, le cytochrome C, F1-F0 ATP-synthase et la pyruvate décarboxylase sont tous positivement régulés. Dans le processus en co-culture, les enzymes de glycolyse de S. cerevisiae, les ribosomes et les protéines chaperon sont positivement régulés au début de la Diauxie après l'appauvrissement en glucose.

The reverse transcriptase (RT) of HIV-1 contains two active sites, polymerase and ribonuclease (RNase) H that are both absolutely necessary for viral replication and disease progression. While several drugs currently used in the clinic to treat HIV-1 target the polymerase activity of RT, none currently target the RNase H activity specifically. The work contained in this thesis describes a potential intrinsic biochemical obstacle to the development of the most common class of RNase H inhibitors, namely steric competition with the natural substrate. Two active site RNase H inhibitors are studied in detail, β-thujaplicinol and GSK5750. Both bind to the RNase H active site through a metal ion-chelating mechanism; however neither is capable of accessing their binding sites in the presence of a pre-formed enzyme-substrate complex, and must access the RNase H active site through either the free enzyme, or the post-cleavage product complex. GSK5750 binds with much higher affinity than β-thujaplicinol, and therefore may represent progress toward a compound that can out-compete the nucleic acid substrate. This thesis also includes work that shows for the first time a potential for flexibility in enzyme-substrate contacts, especially in the vicinity of the RNase H primer grip structural motif. This may have implications for how RT binds to its substrate, in particular RNA vs DNA templates. In summary, this thesis contains significant advances in the field of HIV-1 drug development through novel mechanistic insights. It also provides a novel technique for the study of enzyme-substrate interactions in the vicinity of the RNase H primer grip. / La transcriptase inverse (RT) du VIH-1 contient deux sites actifs: la polymérase et la ribonucléase (RNase) H. Cette enzyme est à la fois absolument nécessaire pour la réplication virale et pour la progression de la maladie. Alors que plusieurs médicaments utilisés présentement en clinique pour traiter le VIH-1 ciblent l'activité de la polymérase de la RT, aucun médicament ne cible l'activité de la RNase H de façon spécifique. Les travaux contenus dans cette thèse décrivent un obstacle biochimique potentiel pour le développement des inhibiteurs de la RNase H: le conflit stérique avec le substrat naturel. Deux inhibiteurs du site actif de la RNase H sont étudiés en detail: le β-thujaplicinol et le GSK5750. Les deux se lient au site actif de la RNase H par un mécanisme basé sur les ions de metal. Par contre, aucun des deux inhibiteurs n'est capable d'accéder à son site de liaison en présence d'un complexe pré-formé enzyme-substrat; les inhibiteurs doivent accéder au site actif de la RNase H soit dans l'enzyme libre, soit dans le complexe de produit. Le GSK5750 se lie avec une affinité beaucoup plus élevée que le β-thujaplicinol, et donc représente un composé qui peut supplanter le substrat d'acide nucléique. De plus, cette thèse montre pour la première fois un potentiel de flexibilité dans les contacts enzyme-substrat, particulairement dans le environs du motif RNase H "primer grip". En résumé, cette thèse propose des avancées significatives dans le domaine du développement de médicaments contre le VIH-1, grâce à des idées mécanistiques novatrices. Elle fournit aussi une nouvelle technique pour l'étude des interactions enzyme-substrat dans les environs du motif de la RNase H "primer grip".

Colonization of airways by Aspergillus fumigatus hyphae in immunocompetent patients with chronic lung disease leads to progressive decline in pulmonary function. While a minority of these patients develop a severe allergic response to the fungus, the majority of patients show a decline in lung function and airway hyperreactivity despite the absence of elevated IgE levels, eosinophilia or other evidence of hypersensitivity. Treatment of these non-allergic patients with antifungal drugs improves the symptoms, suggesting that pulmonary complications might be directly caused by A. fumigatus. The mechanisms underlying the acquisition of A. fumigatus colonization and the pathogenesis of pulmonary inflammation have not been studied. Our central hypothesis is that A. fumigatus interacts directly with elements of the immune system to facilitate its own colonization and induces ineffective inflammatory responses that damage host airways. To begin to investigate this hypothesis we used two complementary approaches to examine the interactions of A. fumigatus with elements of the pulmonary immune system. First, we studied the in vitro interactions of A. fumigatus with mast cells, key effector cells involved in orchestrating inflammatory responses and airway reactivity. We found that A. fumigatus triggers mast cell degranulation, while suppressing cytokine expression in an IgE-independent manner. While both degranulation and cytokine transcription required direct contact with mature hyphae, cytokine suppression could also be induced in part by A. fumigatus culture supernatant. Further studies revealed that A. fumigatus hyphae modulated mast cell function by downregulating protein tyrosine phosphorylation and in part by cleavage-dependent activation of protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B). The cleavage of PTP1B was caused by A. fumigatus serine proteases. In parallel, we developed a murine model of A. fumigatus colonization, where airways of healthy mice were colonized with live A. fumigatus by intratracheal injection of conidia embedded within agar beads. Unlike previously described models that induce airway hyperreactivity by repeated challenge with antigen or A. fumigatus spores, infection with this approach resulted in chronic colonization with fungi for up to 28 days. Fungal lesions within the airways were surrounded by a robust neutrophilic inflammation and peribronchial infiltration of lymphocytes. During the first 2 weeks of infection, low level Th2 type responses were seen in the infection, including increased pulmonary IL-4 levels, elevated serum IgE, and a mild increase in airway responsiveness. In addition, significant levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines including TNF-α and MIG were observed, suggesting a mixed inflammatory picture. Furthermore, elevated IL-17 levels and presence of RORγ-positive mononuclear cells during late phase of the infection indicated the development of a Th17 response in association with reduction in pulmonary fungal load. Collectively, these results provide insight into the pathogenesis of A. fumigatus-induced chronic airways disease in patients without allergic bronchopulmonary aspergillosis, and suggest a possible role for mast cells in the pathogenesis of this condition. / La colonisation des voies respiratoires par les hyphes d'Aspergillus fumigatus chez des patients immunocompétents, mais avec une maladie pulmonaire chronique, entraîne le déclin progressif de la fonction des poumons. Alors qu'une minorité de ces patients développe une réponse allergique aigue au champignon, la majorité montre un déclin dans la fonction des poumons et une hyperréactivité des voies respiratoires malgré l'absence d'une augmentation du niveau des IgE, des éosinophiles ou d'autres indications d'hyper-sensibilité. Le traitement antifongique chez ces patients améliore les symptômes suggérant que le champignon peut être la cause directe des complications observées. Les mécanismes qui sous-tendent la colonisation par A. fumigatus et la pathogenèse de l'inflammation des voies respiratoires restent largement indéterminés. Notre hypothèse centrale stipule que le champignon interagit directement avec des éléments du système immunitaire pour faciliter la colonisation et induire une réponse inflammatoire inefficace qui cause des dégâts aux voies respiratoires de l'hôte. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons développé deux approches complémentaires visant à tester l'interaction d'A. fumigatus avec des éléments du système immunitaire pulmonaire. D'abord, nous avons étudié l'interaction in vitro entre A. fumigatus avec les mastocytes, une population clé de cellules impliquées dans la réponse inflammatoire. Nous avons montré que le champignon déclenche la dégranulation des ces cellules, tout en bloquant l'expression des cytokines indépendamment des IgE. Les processus de dégranulation et de transcription des cytokines nécessitent un contact direct avec les hyphes matures, alors que la suppression des cytokines quant à elle peut être induite en partie par le surnageant de culture d'A. fumigatus. Une étude plus approfondie nous a permis de montrer que les hyphes d'A. fumigatus peuvent moduler la fonction des mastocytes via une régulation négative de la phosphorylation d'une protéine tyrosine kinase et, en partie, via l'activation clivage-dépendante de la protéine tyrosine phosphatase 1B (PTP1B). Ce clivage de PTP1B est causé par la serine protéase du champignon. Dans une seconde approche, nous avons développé un modèle murin pour la colonisation par A. fumigatus, où nous avons fait coloniser les voies respiratoires de souris saines avec le champignon par injection intra-trachéale de conidies encapsulées dans des billes en agar. Ce modèle, au contraire des précédents, qui induisent l'hyperréactivité des voies respiratoires par exposition répétée à un antigène ou des spores de A. fumigatus, permet une colonisation chronique par le champignon allant jusqu'à 28 jours. Après ce traitement, les lésions des voies respiratoires, causées par le champignon, se retrouvent entourées par une inflammation neutrophilique robuste ainsi qu'une infiltration péri-bronchiale des lymphocytes. Durant les deux premières semaines qui suivent l'infection, nous avons détecté des niveaux bas d'une réponse type Th2, y compris une augmentation des niveaux des IL-4 pulmonaires, élévation des IgE dans le sérum, et une augmentation légère de la réponse des voies respiratoires. En plus, une augmentation significative des cytokines et des chémokines pro-inflammatoires, y compris les TNF-α et MIG, a été observée suggérant une réponse inflammatoire mixte. Les niveaux élevés des IL-7 et la présence des cellules mononucléaires RORγ-positives durant la phase tardive de l'infection indiquent le développement d'une réponse de type Th-17 associée à une réduction de la charge fongique pulmonaire. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre le processus de pathogenèse lié aux maladies chroniques des voies respiratoires induites par A. fumigatus chez les patients sans aspergillose bronchopulmonaire allergique, et suggèrent que les mastocytes peuvent jouer un rôle dans cette pathogenèse.

The reverse transcriptase of the Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1) is responsible for transcribing the viral single-stranded RNA genome into double-stranded DNA. Due to its vital role in the viral life cycle, it is often targeted in the treatment of HIV-1 infected patients. Inhibitors that block the reverse transcriptase enzyme were shown to interfere with nucleotide incorporation. At the end of a nucleotide incorporation cycle, the newly incorporated substrate is still located in the nucleotide binding site. In order to continue the elongation of the DNA chain, the enzyme has to move by one nucleotide relative to the nucleic acid template to free the nucleotide binding site. This movement is referred to as translocation. Translocation is extremely rapid and is therefore kinetically invisible. In order to study the mechanism of translocation, I developed site-specific footprinting assays with a resolution of a single nucleotide, which allowed us to detect the precise positioning of the reverse transcriptase on a DNA template. Using these techniques, in combination with kinetic analysis as well as other enzymatic assays, I studied the translocational status of the reverse transcriptase in various conditions, and concluded that this enzyme translocates according to a “Brownian ratchet model”. In this model, the enzyme oscillates between pre- and post-translocated positions and the nucleotide substrate traps the post-translocational state. I identified important factors that affect the translocational equilibrium: the sequence of the nucleic acid template, the nature of the nucleotide at the 3’ end of the primer, the presence of mismatches in the double-stranded nucleic acid substrate, the presence of nucleotides, the presence of inhibitors, the nature of these inhibitors, the presence of drug resistance conferring mutations and the temperature are parameters that have all been shown to modify the translocational equilibrium of the reverse / La transcriptase inverse du Virus d’Immunodéficience Humaine de type 1 (VIH-1) est responsable de la transcription du génome viral composé d’ARN simple brin en ADN double brin. Étant donné son rôle vital dans le cycle viral, cet enzyme est une cible de choix pour le traitement des patients infectés par le VIH-1. Les inhibiteurs qui bloquent la transcriptase inverse affectent régulièrement l’incorporation des nucléotides. Après l’incorporation d’un nucléotide, ce dernier est toujours situé dans le site de liaison des nucléotides. Afin de libérer ce site, la transcriptase inverse doit se déplacer d’un nucléotide par rapport à la matrice d’acide nucléique, déplacement que nous appelons la translocation. Celle-ci est un mouvement très rapide qui est cinétiquement invisible. Afin d’étudier le mécanisme de translocation, j’ai dévelopé des tests d’empreinte moléculaire ayant une résolution d’un seul nucléotide nous permettant de détecter la position précise de l’enzyme sur une matrice d’ADN. En utilisant ces tests, en combinaison avec des analyses cinétiques et autres expériences enzymatiques, j’ai étudié le statut translocationel de la transcriptase inverse, et nous en sommes venus à la conclusion que cet enzyme se déplace selon un modèle dans lequel un mouvement Brownien est responsable du déplacement de l’enzyme. Celui-ci est stabilisé par la liaison d’un nucléotide dans le stade post-translocationel. J’ai identifié des facteurs importants influençant la translocation : la séquence de la matrice d’acide nucléique, la nature du nucléotide à l’extrémité 3’ de l’amorce, la présence d’erreurs d’association dans le substrat d’acide nucléique double brin, la présence de nucléotides, la présence d’inhibiteurs, la nature de ces inhibiteurs, la présence de mutations conférant une résistance aux médicaments et la température ont tous été démontrés comme mod