Candida glabrata is the second most common cause of candidiasis after Candida albicans. Recent studies on resistance to the antifungal drugs echinocandin and azole among Candida bloodstream infection isolates showed the prevalence of C. glabrata isolates. Zinc cluster proteins are fungal transcriptional regulators of genes involved in a wide variety of cellular processes including chromatin remodelling, gluconeogenesis and respiration, nitrogen utilization, meiosis and mitosis and drug resistance. However, the role played by zinc cluster proteins in C. glabrata is poorly understood. We have performed phenotypic analysis of 36 genes encoding C. glabrata zinc cluster proteins including 33 putative factors of unknown function. Our analysis revealed that deletion of eight different zinc cluster genes (two homologues of S. cerevisiae RSC3 and one of YRM1) rendered cells sensitive to the antifungal drug flucanozole. Deletions of three other genes resulted in sensitivity to conditions that interfere with cell membrane/wall integrity or cause osmotic stress. Two other deletions of zinc cluster genes rendered cells resistant to terbinafine (homologues of S. cereviaie TEA1and YLR278c). Deletion a homologue of S. cerevisiae PPR1 resulted in resistance to antifungal drugs and sensitivity to compounds that disrupt cell membrane/wall integrity or cause osmotic stress. In summary, our studies assigned phenotypes to a number of previously uncharacterized zinc cluster genes and will be useful to better understand the role played by these transcriptional regulators. / Candida glabrata est la seconde plus importante cause de candidose après Candida albicans. De récentes études portant sur la résistance aux médicaments antifongiques échinocandine et azole ont été faites à partir d'isolats cliniques prélevés à partir du sang; les résultats ont démontré la prévalence de C. glabrata. Les protéines 'zinc cluster' sont des régulateurs transcriptionnels de gènes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires dont le remodelage de la chromatine, la gluconéogénèse et la respiration, l'utilisation de l'azote, la méiose et la mitose ainsi que la résistance aux médicaments. Cependant, le rôle joué par les protéines 'zinc cluster' chez C. glabrata est très peu connu. Nous avons fait l'analyse phénotypique de 36 gènes codant pour des protéines 'zinc cluster' chez C. glabrata, dont 33 facteurs de fonction inconnue. Notre analyse a révélé que la délétion de huit différents gènes 'zinc cluster' rend les cellules sensibles au médicament antifongique fluconazole. La délétion de trois autres gènes (deux homologues du gène RSC3 et un homologue de YRM1 chez Saccharomyces cerevisiae) confère la sensibilité à des conditions qui interfèrent avec la membrane cellulaire/l'intégrité de la paroi ou encore qui causent un stress osmotique. Deux autres délétions de gènes 'zinc cluster' (homologues de TEA1 ou de YLR278C chez S. cerevisiae) causent la résistance au terbinafine. De plus, la délétion d'un homologue de PPR1 chez S. cerevisiae confère la résistance à des médicaments antifongiques ainsi que la sensibilité à des conditions qui interfèrent avec la membrane cellulaire/l'intégrité de la paroi ou qui causent un stress osmotique. En résumé, notre étude a permis d'identifier des phénotypes pour un certain nombre de gènes 'zinc cluster' non caractérisés précédemment et elle sera utile afin de mieux comprendre le rôle joué par ces régulateurs transcriptrionnels.

All growing cells must ensure that their genetic material is faithfully replicated and divided equally to the newly formed daughter cells. Once chromosome replication has begun the cell must assure that it does not start replication until the next cell cycle. In nearly all bacteria chromosome replication is initiated by the highly conserved DnaA protein. In Escherichia coli the activity of the initiator protein DnaA is down regulated by the regulatory inactivation of DnaA (RIDA) system. Shortly after the initiation of replication, the intrinsic ATPase activity of DnaA is stimulated by Hda, a protein with homology to the ATPase domain of DnaA. Therefore, Hda converts DnaA from its active ATP bound form to its inactive ADP bound form. The current models of chromosome replication have been developed using the model bacteria E. coli. However, DnaA proteins form other bacteria differ from DnaA in E. coli in their structures and biochemical properties. A regulatory model based solely on E. coli does not take into account the diversity found among bacteria. Another model is provided by the free-living Gram-negative bacterium Caulobacter crescentus which is found in nutrient poor aqueous environments such as fresh water lakes. Genomic analysis predicts C. crescentus encodes a protein (HdaA) with homology to Hda of E. coli. C. crescentus also makes use of novel regulatory mechanisms not found in E. coli to regulate DnaA. Unlike DnaA of E. coli the DnaA protein of C. crescentus is unstable in growing cells, rapidly degraded during stationary phase and upon nutrient starvation. I have created a strain of C. crescentus with hdaA expressed under the control of a xylose dependent promoter. I demonstrated that C. crescentus depends upon a RIDA mechanism to prevent multiple initiations of chromosome replication in the same cell cycle, as blocking hdaA expression causes an increased frequency of chromosome replication as well as a blockage of cell division. I have also uncovered an unexpected role for HdaA in the stability control of DnaA. Removing HdaA from C. crescentus stabilizes the DnaA protein in growing cells and prevents complete DnaA protein removal from stationary phase cells. My experiments have identified a new role for HdaA in DnaA proteolysis that presumably works in exponentially growing cells to aid the RIDA mechanism that restricts chromosome replication to once per cell cycle. I also demonstrate that HdaA participates in the programmed transition from exponentially growing cells to the stationary phase. C. crescentus also contains a second gene (hdaB) predicted to encode a protein with homology to the DNA binding domain of DnaA. The hdaB gene is not essential for the normal growth of C. crescentus. The fact that homologs of HdaB are found in the genomes of other alphaproteobacteria suggests that, hdaB has an evolutionary conserved role in these bacteria. Form these studies I propose that HdaA not only alters DnaA activity but also DnaA protein stability. This hypothesis further suggests that C. crescentus employs both nucleotide binding/hydrolysis, as seen in E. coli and a novel proteolytic mechanism to regulate DnaA. However, no previous studies have directly addressed the nucleotide binding and ATP hydrolysis of C. crescentus DnaA. To clarify the link between ATPase activity and protein stability I created four independent single amino acid mutations in two conserved positions of C. crescentus DnaA, DnaAR300 and DnaAR357. I showed that mutations in either position reduce DnaA ATPase activity in vitro. Further in vivo studies showed that mutations C. crescentus DnaAR357 increased chromosome replication and increased DnaA stability. These results indicate that the stability of DnaA protein is linked with its ATPase activity state. Combined with the established E. coli RIDA mechanism, my results imply a similar feedback mechanism that also ties DnaA proteolysis with C. crescentus cell cycle progression. / Toutes les cellules vivantes doivent s'assurer que leur matériel génétique soit fidèlement reproduit et divisé également parmi ses cellules filles. Chez les bactéries, le contrôle de la réplication des chromosomes se fait principalement au niveau de la fréquence de l'initiation. La réplication des chromosomes commence à un point prédéterminé sur le chromosome nommé l'origine de réplication. La fréquence d'initiation de réplication dans la bactérie Escherichia coli est contrôlée principalement par le RIDA (regulatory inactivation of DnaA). Après l'initiation de la réplication, l'activité ATPase intrinsèque de DnaA est stimulée par une protéine ayant une homologie avec DnaA (Hda). Ceci stimule la conversion de la forme DnaA-ATP active en forme DnaA-ADP inactive. La protéine responsable de l'initiation de réplication des chromosomes est conservée parmi presque toutes les bactéries. Plusieurs de leurs systèmes ont évolué pour régler l'activité de DnaA qui répond aux besoins des bactéries vivant dans des milieux diversifiés.La bactérie Caulobacter crescentus est une bactérie à Gram négative qui vit dans un environnement pauvre en aliments nutritifs. C. crescentus, peut utiliser le RIDA pour contrôler l'initiation de réplication de son chromosome, car il encode une protéine (HdaA) avec homologie à la protéine Hda d'E. coli. Elle utilise également de nouveaux mécanismes de régulation qui ne se trouvent pas chez E. coli, afin de maîtriser l'activité de DnaA. Contrairement à DnaA chez E. coli, celle de C. crescentus est instable dans les cellules en croissance. Elle se dégrade rapidement pendant la phase stationnaire et lorsqu'il y a carence en éléments nutritifs. C. crescentus contient un deuxième gène (hdaB) qui encode une protéine ayant une homologie avec le domaine de liaison de l'ADN de DnaA. Afin de déterminer le rôle de HdaA, j'ai créé une souche de C. crescentus avec hdaA exprimée sous le contrôle d'un promoteur qui dépend de la présence de xylose. Je démontre que C. crescentus dépend du mécanisme RIDA afin d'empêcher les initiations multiples de la réplication des chromosomes. Bloquer l'expression de hdaA provoque une augmentation de la fréquence d'initiation de la réplication des chromosomes et un blocage de la division cellulaire. J'ai également découvert un rôle inattendu pour HdaA en lien avec la stabilité de DnaA. En l'absence de la protéine HdaA, la protéine DnaA se stabilise dans les cellules en croissance et n'est pas dégradée en phase stationnaire. Mes expériences ont identifié un nouveau rôle pour HdaA dans la protéolyse de DnaA et que HdaA participe à la transition programmée des cellules en croissance exponentielle à la phase stationnaire.J'ai identifié un deuxième gène pour C. crescentus avec homologie à dnaA nommé hdaB. Il affiche une homologie significative avec le domaine de DnaA, responsable des contacts avec l'ADN. Le hdaB n'est pas essentiel à la croissance normale de C. crescentus car il peut être éliminé sans conséquence évidente. Malgré la conservation évidente de la séquence avec le domaine de contact de l'ADN, des expériences avec des protéines purifiées in vitro démontrent qu'elles sont incapables de détecter les contacts entre HdaB et l'ADN. Ces résultats n'indiquent pas précisément un rôle du gène hdaB. Le fait que des homologues de hdaB se trouvent dans le génome d'autres alphaprotéobactéries suggère que hdaB donne un avantage aux bactéries qui n'apparaissent pas dans des conditions de laboratoire.Pour mieux comprendre le lien entre RIDA et la dégradation de la protéine DnaA, J'ai créé quatre mutants de DnaA présentant des déficiences dans leurs activités ATPase. L'expression de ces mutants donne un phénotype similaire aux cellules manquant d'HdaA: une plus haute fréquence d'initiation de la réplication des chromosomes ainsi que la stabilisation de DnaA. Ceci indique que la stabilité de DnaA est directement liée à son état d'activité et à la progression du cycle cellulaire.

PCZ prophylaxis has proven highly effective in preventing invasive fungal infections, despite relatively low serum drug concentrations. However, high tissue levels of this agent have been reported in treated patients. Therefore, we hypothesized that intracellular levels of antifungal agents are an important factor in determining the success of fungal prophylaxis. To examine the effect of host cell-associated antifungals on the growth of medically important molds, we exposed lung epithelial cells to antifungal agents and removed extracellular drug prior to in vitro infection. Epithelial cells exposed to PCZ and its parent molecule itraconazole, but not other antifungals, were able to inhibit fungal growth for at least 48 hours and were protected from damage caused by infection. Cell-associated PCZ levels were 40 to 50-fold higher than extracellular levels and the drug was predominantly detected in cellular membranes. Fungistatic levels of PCZ persisted within epithelial cells for up to 48 hours. Further co-localization studies using fluorophore conjugated PCZ determined that PCZ concentrates within the endoplasmic reticulum of both host and fungal cells and persists long after drug exposure. Finally, during in vitro infection of PCZ loaded cells, there is a rapid transfer of PCZ from host membrane to fungal membranes. We propose a mechanism where PCZ transfers from host membranes to fungal membranes including the endoplasmic reticulum (ER), where it accumulates to inhibit the ER membrane bound target enzyme CYP51a. Therefore, the concentration of PCZ in mammalian host cell membranes mediates its efficacy in prophylactic regimens and likely explains the observed discrepancy between serum antifungal levels and efficacy. / La prophylaxie à l'aide de PCZ est éfficace pour prévenir les infections fongiques invasives, malgré les faibles concentrations sériques. Cependant, des fortes concentrations de PCZ sont trouvés dans les tissus des patients. Nous formulons donc l'hypothése que les concentrations intracellulaires d'antifongiques sont une facteur important pour déterminer le succès des régimes prophylactiques. Pour éxaminer l'effet des concentrations intracellulaires sur des champignons médicale, on a exposé des cellules épithéliales à des concentrations difféerents d'antifongiques pour quelques heures, et qu'on a ensuite enlevé avant d'infecter les cellules avec des spores. Les cellules exposées au PCZ ou à l'itraconazole, mais pas les autres antifongiques, étaient capables d'inhiber la croissance des fongique et prevenir le dommage cellulaires. Les concentrations intracellulaires de PCZ étaient 40 à 50 fois plus élevés que les concentrations extracellulaires, et le PCZ était concentré dans les membranes cellulaires. Des concentrations fongistatiques de PCZ ont persisté dans les cellules pour plus que 48 heures. Par ailleurs, des études de localiaation ont démontré que le PCZ se concentre dans le réticulum endoplasmique des fongi et des cellules épitheliales. Finalement, au cours de l'infection, PCZ est transferé des membranes cellulaires aux fongi, où il s'accumule pour inhiber sa cible, le CYP51a. Donc, l'éfficacité de PCZ pourrait s'éxpliquer par son accumulation dans les membranes cellulaires, expliquant ainsi la descordance entre les niveaux sérumiques et l'éfficacité contre les champignons.

The rise of antibiotic resistance has rekindled interest in the development of alternative antimicrobial agents. Bacteriophages, bacteria's obligate parasites, have drawn a lot of interest from the scientific community and from the industry due to their many advantages. However, there are various challenges hindering the use of bacteriophages as antimicrobial agents. In this dissertation, a number of these challenges have been addressed. After a brief introduction on the advantages and drawbacks of using phage in chapter one, the inherent limitation of using immobilized phage for antimicrobial surfaces is presented in chapter two. In the subsequent three chapters, one of the main issues of challenging bacterial communities with phage was addressed, namely emergence of phage-resistant bacteria variants. The effect of phage on biofilm formation was investigated and it was observed that in some cases they can lead to increase in biofilm formation. Furthermore the colonies of phage-resistant bacteria emerged in contact with phage were studied. It was reported that their phenotype, their virulence traits as well as their in vitro virulence towards mammalian cells had been significantly affected. This investigation highlights the importance of awareness of the effect of phage on bacterial communities for effective utilization of their potential. / L'augmentation de la résistance aux antibiotiques a ravivé l'intérêt dans le développement d'agents antimicrobiens alternatifs. Les bactériophages, parasites bactériens obligatoires, ont suscité beaucoup d'intérêt de la part de la communauté scientifique et de l'industrie à cause de leurs nombreux avantages. Cependant, plusieurs défis restent à relever pour résoudre les problèmes qui empêchent l'utilisation des bactériophages comme agents antimicrobiens. Un certain nombre de ces défis sont adressés dans cette dissertation. Après une brève introduction sur les avantages et désavantages de l'utilisation des bactériophages dans le premier chapitre, nous présentons dans le second chapitre les limitations intrinsèques de l'utilisation de bactériophages immobilisés pour créer des surfaces antimicrobiennes. Dans les trois chapitres suivants, nous traitons de l'une des principales questions concernant l'infection de cultures bactériennes par les bactériophages, à savoir l'émergence de variants bactériens résistants. L'effet des bactériophages sur la formation de biofilms a été étudié et nous avons observé que dans certains cas, les bactériophages peuvent augmenter la formation de biofilms. En outre, nous avons étudié les colonies bactériennes résistantes qui émergent après l'infection par des bactériophages. Nous avons trouvé que leur phénotypes, leurs caractères de virulence ainsi que leurs virulences in vitro envers les cellules mammifères avaient été affectés de manière significative. Cette investigation souligne l'importance des effets des bactériophages sur les cultures bactériennes pour une utilisation efficace de leur potentiel antimicrobien.

A warming climate and improved technology have allowed northern countries to more thoroughly explore and exploit Arctic resources. This increased activity has led to an elevated risk of petroleum contamination, and consequently, there is a need to develop strategies to effectively and efficiently degrade these contaminants on site. While many Arctic soil microorganisms are known to naturally metabolize petroleum hydrocarbons in contaminated sites, a process known as bioremediation, treatments directed at stimulating the hydrocarbon-degrading activity of these microbes (e.g. nutrient amendments) have varied in effectiveness.The objective of this study was to determine whether microbial taxa respond equally to disturbances of the soil environment by hydrocarbon contaminants and nutrient amendments, and whether the most efficient hydrocarbon degraders are naturally stimulated. To determine whether the bacteria inhabiting contaminated Arctic soils assimilate added nitrogen equally, a novel 15N-stable isotope probing approach was developed. After a month of in situ incubation, it was determined that many hydrocarbon-degrading bacteria had incorporated the added nitrogen, but to varying extents. The Alphaproteobacteria most effectively used the added nitrogen, as determined by both 16S rRNA and alkB gene enrichment, and this was noteworthy given that they were not expected to be the most effective hydrocarbon-degrading group.To assess whether the relative abundance of bacterial taxa in hydrocarbon-contaminated soils was determined by soil characteristics as opposed to hydrocarbon-degrading ability, 18 soils from across the Arctic were collected and treated with diesel and monoammonium phosphate. Bacterial diversity and community composition were determined through 16S rRNA gene sequencing on the Ion Torrent platform, while hydrocarbon degradation was measured using gas chromatography. It was found that Actinobacteria dominated soils with low organic matter, while Proteobacteria dominated those with high organic matter. In addition, the extent of bacterial diversity and the relative abundance of specific assemblages of Betaproteobacteria in uncontaminated soils were predictive of hydrocarbon degradation with and without nutrient amendments, respectively. Relative abundance of Betaproteobacteria was associated with efficient hydrocarbon degradation in the presence of added nutrients, suggesting that this may be an important group to target.Finally, to determine whether modifying the microbial community within a given soil would impact rates of hydrocarbon degradation, gentamicin and vancomycin were used to inhibit specific portions of the bacterial community. Bacterial 16S rRNA gene diversity and community composition were again determined using the Ion Torrent platform, qPCR was used to quantify bacterial and fungal populations within each treatment, and GC analysis was used to determine hydrocarbon degradation. Bacterial 16S rRNA gene abundance declined in soils treated with gentamicin, but diesel degradation was highest in the presence of both gentamicin and vancomycin. Bacterial community composition shifted under all treatments, and Xanthomonadaceae (Gammaproteobacteria) and Micrococcaceae (Actinobacteria) dominated soils treated with both antibiotics. Diesel degradation was much less effective when nutrients were also added to soils treated with gentamicin and vancomycin, possibly due to competition from a larger fungal population.Overall, these results suggest that more effective in situ treatments of hydrocarbon-contaminated Arctic soils are possible through selective targeting of efficient hydrocarbon-degrading consortia. Future research should aim to understand which soil microorganisms most quickly degrade various contaminants in situ, as well as the main biotic and abiotic factors that limit their activity. / Le réchauffement climatique et l'amélioration de la technologie ont permis aux pays situés au nord du globe d'exploiter les ressources de l'Arctique comme jamais auparavant. L'accroissement de l'activité humaine augmente le risque de contamination par des produits pétroliers, d'où la nécessité de développer des stratégies afin d'être en mesure de dégrader ces contaminants de façon rapide et efficace. Bien que plusieurs des microorganismes qui peuplent le sol de l'Arctique possèdent la capacité de métaboliser des hydrocarbures, les traitements utilisés afin de stimuler l'activité de ces bactéries (ex. ajouts de nutriments) n'ont pas tous été aussi efficaces que souhaité.L'objectif de cette étude était de déterminer si les microorganismes réagissent de la même façon aux perturbations causées par les hydrocarbures et les ajouts de nutriments, et si les espèces efficaces dans la dégradation des hydrocarbures sont naturellement stimulées. Afin de déterminer si le taux d'assimilation de l'azote est le même pour toutes les bactéries qui vivent dans les sols contaminés de l'Arctique, une nouvelle technique de sondage à l'aide de l'isotope stable 15N a été développée. Après un mois d'incubation, nous avons déterminé que plusieurs groupes de bactéries ont incorporé l'azote, mais à des degrés divers. Les Alphaproteobacteria ont été les plus efficaces dans l'utilisation de l'azote, tel que démontré par l'enrichissement des gènes de l'ARNr 16S et alkB, ce qui constitue un fait intéressant étant donné qu'elles n'étaient pas considérées comme le groupe de bactéries le plus efficace dans la dégradation des hydrocarbures.Afin d'évaluer si l'abondance des espèces bactériennes est influencée plutôt par les caractéristiques du sol que par leurs capacités de dégradation, 18 sols prélevés dans différentes régions de l'Arctique ont été traités avec du diésel et des nutriments. La diversité et la composition des communautés microbiennes ont été déterminées par séquençage sur la plateforme Ion Torrent, alors que la chromatographie en phase gazeuse a permis de mesurer la dégradation des hydrocarbures. Le groupe des Actinobacteria prédominait dans les sols à faible teneur en substances organiques (<10%), tandis que le groupe des Proteobacteria prédominait dans les sols à haute teneur en substances organiques. De plus, la diversité bactérienne et l'abondance relative de certains groupes de Betaproteobacteria constituent un facteur prédictif de la dégradation efficace des hydrocarbures. L'abondance relative de Betaproteobacteria est associée à une dégradation efficace d'hydrocarbures en présence de nutriments, ce qui suggère qu'il s'agirait d'un bon groupe à cibler durant la biorémédiation.Enfin, dans le but de déterminer si une modification de la communauté microbienne influence la dégradation, des fractions de la communauté microbienne ont été inhibées à l'aide de la gentamicine et de la vancomycine. La dégradation du diesel donnait les meilleurs résultats en présence à la fois de la gentamicine et de la vancomycine. Tous les traitements utilisés ont provoqué des changements dans la composition de la communauté microbienne des sols et les groupes des Xanthomonadaceae (Gammaproteobacteria) et des Micrococcaceae (Actinobacteria) prédominaient dans les sols traités avec les deux antibiotiques. La dégradation du diesel était moins efficace lorsque des nutriments étaient également ajoutés en même temps que la gentamicine et la vancomycine, possiblement à cause de la compétition d'une population fongique plus importante.Ces résultats suggèrent qu'il est possible d'améliorer l'efficacité des traitements pour les sols arctiques contaminés par des hydrocarbures. Dans le futur, les recherches devraient se concentrer sur l'identification des microorganismes du sol qui dégradent le plus rapidement les divers contaminants associés à l'exploitation des hydrocarbures, ainsi que sur la compréhension des facteurs qui peuvent limiter leur activité.

mTOR is a serine/threonine protein kinase that controls cell growth, proliferation, and survival in response to mitogens and nutrients. When inactivated by nutrient deprivation or serum withdrawal, mTOR can also enhance stress transcriptional responses. In agreement, once inhibited, mTOR binds 'signal transducer and activator of transcription-1' (STAT1), a pro-apoptotic transcription factor, and the STAT1 kinase 'protein kinase C-delta' (PKCδ). Inactivation of mTOR enhanced STAT1 nuclear import, the induction of STAT1-dependent genes (including STAT1 per se), and apoptosis, indicating a role for mTOR activity in suppressing apoptosis transcriptional responses. However the function of PKCδ in the mTOR/STAT1 complex is unknown. After identifying a target of rapamycin signalling (TOS) motif in PKCδ, we hypothesized that mTOR suppresses STAT1-dependent apoptosis via a physical interaction with PKCδ. We expressed the TOS-mutated isoform of PKCδ (ΔTOS) in mammalian cells, and determined the effect of rapamycin on STAT1 protein levels, apoptosis, or cell viability. In HEK 293T cells, phosphorylation of STAT1 was retained upon expression of ΔTOS PKCδ, indicating preservation of PKCδ kinase activity. There was an increase in cleaved caspase-3 levels (apoptosis) in cells expressing ΔTOS, as compared to wild-type (WT), PKCδ. Rapamycin failed to increase STAT1 levels in ΔTOS-expressing cells exposed to the pro-apoptotic cytokine interferon-β. In human fibrosarcoma (2fTGH) cells, the increase in cleaved caspase-3 levels by rapamycin was lost upon expression of the ΔTOS mutant. In similar, but STAT1-deficient (U3A) cells, WT or ΔTOS PKCδ failed to restore cleavage of caspase-3. Unlike apoptosis, ΔTOS PKCδ reduced viability in U3A cells, but not in 2fTGH cells exposed to rapamycin, indicating that mTOR, PKCδ, and STAT1 can control cell viability by caspase-3-independent mechanisms. Our results are consistent with an inhibitory effect of mTOR on STAT1 expression and apoptosis that is mediated by the PKCδ TOS motif. / mTOR est une sérine / thréonine protéine kinase qui contrôle la croissance cellulaire, la prolifération et la survie en réponse à des mitogènes et nutriments. Quand inactivée par une carence en nutriments ou un retrait de sérum, la protéine mTOR peut également augmenter les réponses transcriptionnelles dues au stress. En accord, une fois inhibée, mTOR se lie au 'transducteur de signal et activateur de transcription-1' (STAT1), un facteur de transcription pro-apoptotique, et une kinase pour STAT1 'protéine kinase C-delta' (PKCδ). L'inactivation de mTOR augmente l'importation nucléaire de STAT1, l'induction de gènes dépendants de STAT1 (y compris STAT1), et l'apoptose, ce qui indique un rôle de la protéine mTOR dans la suppression transcriptionnelle de réponses apoptotiques. Cependant, la fonction de PKCδ dans le complexe mTOR/STAT1 est inconnue. Après avoir identifié un motif de cible de rapamycine dans PKCδ (motif TOS), nous avons émis l'hypothèse que mTOR supprime l'apoptose dépendante de STAT1 par une interaction physique avec PKCδ. Nous avons exprimé l'isoforme TOS-mutée de PKCδ (ΔTOS) dans les cellules, et nous avons déterminé l'effet de la rapamycine sur la teneur en protéines STAT1, l'apoptose, ou la viabilité des cellules. Dans des cellules HEK 293T, la phosphorylation de STAT1 a été retenu lors de l'expression de ΔTOS PKCδ, indiquant la préservation de l'activité kinase PKCδ. Il y avait une augmentation des niveaux de caspase-3 clivés (apoptose) dans les cellules exprimant ΔTOS par rapport à PKCδ de type sauvage (WT). La rapamycine n'a pas pu augmenter les niveaux de STAT1 dans les cellules exprimant ΔTOS exposées à la cytokine pro-apoptotique interféron-. Dans les cellules humaines de fibrosarcome (2fTGH), l'augmentation des niveaux de caspase-3 clivé induite par la rapamycine a été perdue lors de l'expression du mutant ΔTOS. De façon similaire dans les cellules déficientes en STAT1 (U3A), le PKCδ WT ou ΔTOS n'a pas réussi à restaurer les niveaux de caspase-3 clivé. Contrairement à l'apoptose, les ΔTOS réduisent la viabilité des cellules dans U3A, mais pas dans les cellules exposées à 2fTGH rapamycine, ce qui suggère que la protéine mTOR, PKCδ, et STAT1 contrôlent la viabilité des cellules par des mécanismes autres que l'apoptose. Nos résultats suggèrent que le motif TOS dans PKCδ assure un effet inhibiteur de mTOR sur l'expression STAT1 et l'apoptose.

<p> <i>Mycobacterium tuberculosis</i> (<i>Mtb</i>) is a bacterium causing great morbidity and mortality especially in developing countries. In order to identify possible areas of intervention to positively alter the history of the disease, a better identification and characterization of <i>Mtb</i> virulence determinants is required. Specifically, biosynthetic routes for these virulence determinants should be pursued. Furthermore, the interaction between the host and <i>Mtb</i> virulence determinants should be characterized at a molecular level. It is hoped that unraveling these pathogenesis mechanisms could lead to novel strategies to combat the infection. </p><p> In Chapter II, the identification of secreted <i>Mtb</i> molecules that induce macrophage apoptosis was performed. Apoptosis is a mechanism of host cell death and in the life cycle of <i>Mtb</i>, different modalities of host cell death have been suggested to tip the balance between bacterial eradication and multiplication. However, a systematic approach to identify and characterize secreted <i>Mtb</i> molecules that modulate host cell death, has not been performed. Surprisingly, extracellular <i>Mtb </i> RNA fragments were identified as a potent inducer of host cell apoptosis. This extracellular RNA was identified as predominantly rRNA and tRNA fragments that accumulated early during <i>in vitro</i> culture of <i>Mtb</i>. Mechanistic studies determined that the <i> Mtb</i> RNA induced macrophage apoptosis through a caspase-8-dependent, TNF-&alpha;-independent mechanism. Importantly, <i>Mtb</i> RNA abrogated the macrophage's ability to control an <i>Mtb</i> infection. In Chapter II, the first description of an extracellular <i>Mtb</i> RNA with potent biological activity was performed. This opens an exciting field in research of host interactions with pathogen nucleic acids. </p><p> Chapters III and IV were devoted to identifying the biochemical pathway involved in &alpha;-L-polyGlutamine (&alpha;-L-polyGln) biosynthesis and determining its role in pathogenesis in the murine model of TB. &alpha;-L-polyGln is an <i> Mtb</i>and <i>Mycobacterium bovis</i> (<i>M. bovis</i>) specific product and its presence in virulent <i>Mycobacterium</i> spp., suggest that it could play an important role in pathogenesis. <i> Bacillus anthracis</i> (<i>B. anthracis</i>) synthesizes &gamma;-D-polyGlutamate (&gamma;-D-polyGlu), an amino acid polymer that is present in its capsule and is absolutely required for pathogenicity. As the pathway for <i> B. anthracis</i> &gamma;-D-polyGlu biosynthesis has been well characterized, it was used as a model to start elucidating the <i>Mtb</i> &alpha;-L-polyGln biosynthetic pathway. Bioinformatics analysis suggested that Rv0574c and Rv2394 are the <i>Mtb</i> homologues for B. anthracis CapA and CapD, respectively. In Chapter III, a complete biochemical characterization of Rv2394 was performed. Similar to other &gamma;-glutamyltranspeptidases (GGTs), Rv2394 had a conserved catalytic motif consisting of a Threonine (Thr) residue. Mutating this Thr residue to Alanine (Ala) abrogated the enzymatic activity of Rv2394, including its autocatalytic activation. In contrast to eukaryote GGT, Rv2394 was able to perform a GGT activity in the presence of physiological relevant acceptors such as di- or oligopeptides containing Glutamate (Glu) or Glutamine (Gln). In addition to its autocatalytic activation, Rv2394 was shown to be post-translationally modified with hexose residues. A putative phosphorylation and acylation modification also seemed to be present in Rv2394. </p><p> In Chapter IV, <i>Mtb</i> mutants for <i>rv0574c</i> and <i>rv2394</i> were engineered and characterized biochemically to determine if the concentration of &alpha;-L-polyGln had been altered. Furthermore, the mutant's virulence was evaluated in the murine model of TB. Consistent with a putative role in &alpha;-L-polyGln, both mutants had reduced concentrations of Glu and ammonia in the cell wall. Furthermore, preliminary analysis suggested that the apolar lipid profiles were also altered by these mutations. In the murine model, <i>Mtb</i> mutants had a tendency to grow faster in the initial stages of disease. However, the difference between wild type (WT) and mutant strains was not statistically significant and normalized during the later stages of disease. Furthermore, mutant <i>Mtb</i> also seemed to induce more lung damage. In contrast to bacterial burden, this difference persisted throughout the course of the study. Altogether, these results suggest that Rv0574c and Rv2394 participate in the biosynthesis of &alpha;-L-polyGln. Remarkably, similar biochemical and phenotypic results were obtained for both mutants despite being encoded in different loci. These initial results provide the foundation for future studies characterizing the biochemical pathway involved in &alpha;-L-polyGln biosynthesis.</p>

Abstract Not Available.

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