In mammals, seven proprotein convertases (PCs) cleave secretory proteins after basic residues. Four members of this family are called furin-like PCs: furin, PACE4, PC5, and PC7. Furin and PC7 are ubiquitous, while PACE4 and PC5 are widely expressed. In vitro, they share many substrates (redundancy). However, furin is essential during development. Inactivation of its gene (Pcsk3) in mouse resulted in lethality at embryonic day 11 (E11). The embryos exhibit multiple developmental defects, particularly related to the function of endothelial cells. In order to define the role of furin in endothelial cells, Pcsk3flox/flox mice carrying Tie2-Cre transgene that expresses Cre under the control of the Tie2 promoter were generated. Pcsk3flox/flox Tg(Tie2-cre) embryos (ecKO) do not survive, indicating that furin has an essential role in endothelial cells. We determined that lethality occurs after birth, and newborns have no visible phenotypes. However, magnetic resonance imaging revealed that ecKO mice exhibit a heart phenotype consisting of ventricular septal defects (VSD) and/or valve malformations. / Searching for candidate furin substrates, the loss of which exhibit VSD led us to analyze the processing of endothelin-1 (ET-1) and bone morphogenic protein 4 (BMP4). While proET-1 cleavage into ET-1 is reduced by 57% in absence of furin in ecKO lungs, proBMP4 activation into BMP4 was more than 90% lost in the heart of these mice. We conclude that proET-1 and proBMP-4 are in vivo substrates of furin and that the impaired processing of proBMP-4 is most likely the cause of the observed VSD in mice lacking endothelial furin. Further studies on other regulatory proteins of endothelial cell will unravel more specific in vivo functions of furin identifying other in vivo substrates. / Chez les mammifères, 7 proprotéines convertases (PC) clivent diverses protéines de sécrétion après les acides aminés basiques. Quatre membres de cette famille de convertases sont appelés: furin, PACE4, PC5 et PC7. Furin et PC7 sont omniprésents, tandis que PACE4 et PC5 sont largement exprimées. In vitro, ils ont beaucoup de substrats en commun. Cependant, la furin est essentielle pendant le développement. L'inactivation de son gène (Pcsk3) dans la souris a abouti à la mortalité embryonnaire au 11éme jour (E11). Les embryons montrent de multiples défauts liés au développement particulièrement reliés à la fonction des cellules endothéliales. Afin de définir le rôle de la furin dans les cellules endothéliales, des souris Pcsk3flox/flox portant le transgène Tie2-Cre qui exprime Cre dans le contrôle du promoteur Tie2 ont été produites. Les embryons Pcsk3flox/flox Tg(Tie2-cre) (aussi référés comme ecKO) ne survivent pas, indiquant que la furin a un rôle essentiel dans les cellules endothéliales. Nous avons déterminé que la mortalité arrive peu de temps après la naissance, ne montrant aucun phénotype apparent. Cependant, l'imagerie par résonance magnétique a révélé que les souris ecKO présentent un défaut septal ventriculaire (VSD). / Par la sélection du phénotype utilisant VSD sur les substrats de la furin, nous avons observé que proendothelin-1 (proET-1) a été moins produite dans le poumon de souris ecKO. Nous avons aussi démontré que la protéine morphogénétique-4 de l'os (proBMP-4) a été aussi moins clivée dans le coeur de souris ecKO. Ces observations soutiennent notre hypothèse que proET-1 et proBMP-4 sont les substrats in vivo de la furin et que la production altérée de proBMP-4 est la cause de VSD la plus probable. De nouvelles études sur d'autres protéines régulatrices des cellules endothéliales élucideront les fonctions in vivo plus spécifiques de la furin et l'identification d'autres substrats in vivo. fr

The Met receptor tyrosine kinase (RTK) and its ligand, the hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), which regulate epithelial cell remodelling, dispersal and invasion, are deregulated in many human cancers. In the last twenty years, mechanisms of RTK activation and signalling have been studied extensively. In contrast, very little is known about the mechanisms of down-regulation of RTKs. At the time I began my thesis work, the family of Cbl ubiquitin-protein ligases emerged as negative regulators for RTKs. In this thesis, I demonstrate that c-Cbl is an important negative regulator of the Met receptor. Upon HGF stimulation, c-Cbl promotes ubiquitination of the Met RTK. This requires the association of the c-Cbl tyrosine kinase binding (TKB) domain with a DpYR binding motif, including Y1003, present in the juxtamembrane of the Met receptor. A Met Y1003F receptor, which lacks the c-Cbl TKB binding site, is not ubiquitinated, transforms fibroblast and epithelial cells in vitro and is tumorigenic in vivo. I demonstrate that ubiquitination of the Met receptor is not required for its internalization from the plasma membrane, but is essential for its lysosomal degradation. In the presence of HGF, the Met Y1003F receptor is poorly degraded and remains phosphorylated, leading to sustained activation of the Ras-MAPK pathway. Moreover, fusion of a ubiquitin moiety to the carboxy-terminus of Met Y1003F is sufficient to decrease Met receptor stability, prevent sustained MEK1/2 activation and reduce cell transformation. / To examine the tumorigenicity of the Met Y1003F receptor in animals, I generated a murine model expressing Met Y1003F under the MMTV promoter, and observed that Y1003F substitution increases Met receptor tumorigenicity in mammary glands. This demonstrates for the first time that ubiquitination of a RTK is required for its biological functions in vivo. Furthermore, this highlights synergy between an activating mutation (M1250T) and a loss of down-regulation mutation (Y1003F) in the tumorigenicity of the Met receptor. Based on these results and on the observation that several RTKs escape the lysosomal degradative pathway in human tumours, I propose that loss of RTK down-regulation is a common mechanism for oncogenic activation of RTKs in human tumours.

Growth factor receptor tyrosine kinases (RTKs) are critical initiators of signal transduction pathways necessary for cell growth, differentiation, migration and survival. Many of these signals are coordinated through scaffold proteins that are phosphorylated upon their recruitment to the activated receptor complex. This provides binding sites for multiple proteins to activate and generate distinct biological responses. The amplitude and duration of a signal is regulated via dephosphorylation and degradation of target proteins. Signal regulation in this manner acts to promote the formation and disassembly of multi-protein complexes and diversify and localize signals downstream from RTKs. / The Met RTK and its ligand, hepatocyte growth factor (HGF), are positive regulators of epithelial morphogenesis, scatter, and survival. However little was known regarding the proteins responsible for attenuating Met receptor activation. In Chapter II, I demonstrated that the Met receptor was hyperphopshorylated in PTP1B-null mice in response to Fas-induced liver damage. Inhibition of Met signaling with PHA665752, removed protection from liver failure in PTP1B-null hepatocytes, demonstrating that PTP1B was a negative regulator of the Met RTK and its removal promoted cell survival against Fas-induced hepatic failure. / In response to Met receptor stimulation, the Gab1 scaffold protein is the prominent protein recruited and phosphorylated downstream from Met and is critical in mediating Met-dependent biological responses. In chapters III and IV, I identified the serine/threonine kinase Pak4 and the microtubule-bound guanine nucleotide exchange factor GEF-H1 as novel proteins recruited to Gab1 following Met receptor activation. I demonstrate that Gab1 and Pak4 synergize to enhance migration and invasion following HGF stimulation. Furthermore, the recruitment of Pak4 to Gab1 is important for its subcellular localization to lamellipodia and critical for epithelial cell dispersal and morphogenesis downstream from Met. In addition, GEF-H1 is important in focal adhesion formation and turnover and this correlates with the ability of GEF-H1 to promote epithelial migration and invasion downstream from Met. / Overall, these studies investigate molecular mechanisms regulating Met-dependent signals and demonstrate for the first time that the Met receptor is a substrate for PTP1B and identify Pak4 and GEF-H1 as key integrators of Met dependent cellular migration and invasion. / Les récepteurs tyrosine kinase aux facteurs de croissance sont des initiateurs critiques des voies de signalisation nécessaires à la croissance, la différentiation, la migration et la survie cellulaire. Beaucoup de ces signaux sont coordonnés par des protéines d'échafaudage qui sont phosphorylées au cours de leur recrutement au complexe de récepteurs activés. Ceci fournit des sites de liaison à de multiples protéines permettant l'activation et la génération de différentes réponses biologiques. L'amplitude et la durée d'un signal est régulée via la déphosphorylation et la dégradation des protéines cibles. De cette façon, la régulation du signal agit pour promouvoir la formation et le désassemblage de complexes protéiques et pour diversifier et localiser les signaux en aval des récepteurs tyrosine kinase. / Le récepteur Met et son ligand HGF (Hepatocyte Growth Factor) sont des régulateurs de la morphogenèse, la dispersion et la survie des cellules épithéliales. Toutefois, peu d'informations sont disponibles sur les protéines responsables de l'extinction des signaux issus du récepteur Met. Dans le chapitre II, je démontre que le récepteur Met est hyperphosphorylé dans les souris knock-out pour PTP1B en réponse aux dommages induits par Fas. L'inhibition par le composé PHA665752 de la signalisation par Met, relève la protection contre les crises hépatiques dans les souris KO pour PTP1B. Ceci démontre que PTP1B est un régulateur négatif de Met et son retrait permet la survie cellulaire contre les crises hépatiques induites par Fas. / En réponse à la stimulation du récepteur Met, la protéine d'échafaudage Gab1 est la plus importante des protéines recrutées et phosphorylées en aval de Met et cette protéine est critique dans la médiation des réponses biologiques dépendantes de Met. Dans les chapitres III et IV, j'ai identifié la kinase Ser/Thr Pak4 et le facteur d'échange de guanine lié aux microtubules (GEF-H1) en tant que nouvelles protéines recrutées à Gab1 suite à l'activation de Met. Je démontre que Gab1 et Pak4 agissent de façon synergique pour promouvoir la migration et l'invasion suite à la stimulation par HGF. De plus, le recrutement de Pak4 à Gab1 est important pour sa localisation cellulaire dans les lamellipodes et est critique pour la dispersion et la morphogenèse des cellules épithéliales en aval de Met. En outre, GEF-H1 est important pour la formation et le roulement des points d'adhésion focaux ce qui est en corrélation avec la capacité de GEF-H1 de promouvoir la migration et l'invasion épithéliale en aval de Met. / Ces études ont pour but d'investiguer les mécanismes moléculaires régulant les signaux dépendants de Met et démontrent pour la première fois que le récepteur Met est un substrat pour PTP1B. Finalement, Pak4 et GEF-H1 sont identifiés comme des intégrateurs clés de la migration et l'invasion cellulaire dépendante de Met.

Disruption of the epigenome and its components is a hallmark of all forms of cancer. Typically observed in cancer is an alteration of the DNA methylation pattern, with silencing of tumour suppressor genes, as well as an increase in DNA methyltransferase 1 (activity or expression). However it has yet to be determined exactly how DNMT1 increases in cancer and how this increase might serve as therapeutic target. This thesis focuses on the regulation of DNMT1 in the cell cycle and the consequences of depleting DNMT1 in cancer cells. / During the cell cycle DNMT1 levels increase as the cell enters into S-phase. It has previously been shown that this cyclical regulation of DNMT1 occurs by destabilization of DNMT1 mRNA in G0/G1 through the action of a protein, identified to be the mRNA binding protein AUF1. AUF1 binds a regulator element located in the 3'UTR of DNMT1 mRNA and recruits the exosome, the RNA degradation complex, to degrade it. / When AUF1 is depleted in these cells, DNMT1 mRNA is stabilized which leads to increased DNMT1 protein levels, methyltransferase activity and genomic methylation. The changes of DNMT1 mRNA levels in the cell cycle were determined to occur as an inverse function of AUF1 protein levels. AUF1 levels were observed to decrease in S-phase which lead to increased stability in DNMT1 mRNA. This cell cycle regulation of AUF1 was determined to occur as a function of Rb. Rb actively stabilizes AUF1 protein. Indeed, upon elimination of Rb, AUF1 is degraded through the function of Hsp70 and the proteasome. This consequently leads to an elevation in DNMT1 protein levels which in turn increases genomic methylation levels. Elevated DNMT1 levels resulted in greater association with EZH2, which in turn leads to increased methylation of EZH2 targeted promoters, including p16 and CNR1. This promoter hypermethylation occurred as a function of DNMT1 and EZH2.These observations indicate that regulation of DNMT1 is tied into the cell cycle function of Rb and upon disruption of this system, a characteristic of cancer, site-specific methylation occurs at tumour suppressors, another characteristic of cancer. / Furthermore, we examined the effect of depleting DNMT1 in cancer cells. Upon depletion of DNMT1, a signaling pathway known as the replication arrest/DNA damage checkpoint was induced. Activation of this pathway results in arrest of cell growth and cell cycle blockage and occurred independently of the catalytic activity of DNMT1 and instead responded to the absence of DNMT1. This supports a role for DMNT1 as a negative regulator of the replication arrest/DNA damage checkpoint through the action of interaction with an unknown protein. Moreover, suppression of the replication arrest/DNA damage checkpoint has been determined to be a necessary step in the proliferation of cancer cells. Taken together, the data from this thesis determined that common events in cancer, such as inactivation of Rb, lead to deregulation of DNMT1 mRNA, through AUF1, leading to site-specific methylation of tumour suppressors and could potentially serve to block growth arresting checkpoints like the replication arrest/DNA damage checkpoint. The novel functions of DNMT1, such as cell cycle regulation, site-specific methylation and role in the replication arrest/DNA damage checkpoint discovered in this thesis could serve to help better understand how cancer develops. The results of this thesis could serve to develop novel strategies to target these events and better treat cancer. / L'altération de l'épigénome et de ses composants est une marque caractéristique de tous types de cancer. Une altération des profils de méthylation de l'ADN, associée à une inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs ainsi qu'une augmentation de l'(activité/expression) de la méthyltransférase de l'ADN (DNMT1) sont largement observés dans les cancers. Cependant, les causes de cette augmentation de DNMT1 (expression/activité) dans le cancer et l'utilisation potentielle de cette augmentation comme cible thérapeutique n'ont pas encore été déterminées. / Au cours du cycle cellulaire, le niveau de DNMT1 augmente dès lors que la cellule entre en phase S. Il a été montré précédemment qu'une régulation cyclique de DNMT1 se met en place grâce à une déstabilisation de son ARN messager en phase G0/G1 sous l'action d'une protéine non identifiée. Cette protéine a été identifié comme AUF1. AUF1 interagit avec un élément régulateur situé dans la partie 3'-UTR de l'ARNm de DNMT1 et entraîne la dégradation de cet ARNm en recrutant l'exosome, un complexe de dégradation de l'ARN. La déplétion d'AUF1 stabilise l'ARNm de DNMT1 ce qui conduit à une augmentation de l'expression de cette protéine, de son activité méthyltransférase ainsi que de la méthylation du génome. Il a été également montré que le niveau d'expression de l'ARNm de DNMT1 au cours du cycle cellulaire est inversement corrélé à celui de la protéine AUF1. Ce niveau d'AUF1 est diminué en phase S ce qui traduit par une stabilité accrue de l'ARNm de DNMT1. Il a été montré que cette régulation d'AUF1 au cours du cycle cellulaire est fonction de la protéine Rb. Rb stabilise activement la protéine AUF1. En effet, AUF1 est dégradée par l'intermédiaire de la protéine Hsp70 et du protéasome. Cette dégradation a pour conséquence une augmentation du niveau d'expression de DNMT1 lequel conduit à une augmentation du niveau de méthylation du génome. De plus, cette augmentation de DNMT1 résulte en une plus grande association avec la protéine EZH2 entraînant une hyperméthylation de promoteurs de gènes ciblés par EZH2 (ex : p16, CNR1 et PCNA). Ces observations démontrent que la régulation de DNMT1 est étroitement liée aux fonctions de Rb dans le cycle cellulaire. Caractéristique dans les cancers, une rupture de cette relation DNMT1-Rb, entraîne ainsi une méthylation site-spécifique de gènes suppresseurs de tumeurs, une autre caractéristique des cancers. / En parallèle, nous avons étudié l'effet d'une déplétion de DNMT1 dans des cellules cancéreuses. Suite à une déplétion de DNMT1, une voie de signalisation connue comme un point de contrôle de l'arrêt de la réplication/lésions de l'ADN est induite. L'activation de cette voie de signalisation entraîne l'arrêt de la croissance cellulaire et le blocage du cycle cellulaire. L'activation de cette voie répond à l'absence de DNMT1 et de façon indépendante de son activité catalytique. Ceci est en faveur d'un rôle pour DNMT1 de régulateur négatif du contrôle de l'arrêt de la réplication/lésions de l'ADN via l'interaction avec une protéine qui reste encore à identifier. De plus, la suppression des points de contrôle de l'arrêt de la réplication/lésion de l'ADN a été montré comme étant une étape nécessaire à la prolifération des cellules cancéreuses. L'ensemble des données de cette thèse démontre que des événements communs aux cancers, telle que l'inactivation de Rb, peuvent conduire à la dérégulation, via AUF1, de l'ARNm de DNMT1, laquelle entraîne la méthylation site-spécifique de gènes suppresseurs de tumeurs. Cette dérégulation de DNMT1 pourrait potentiellement servir à bloquer les points de contrôle d'arrêt du cycle cellulaire/lésions de l'ADN. / Les nouvelles fonctions de DNMT1, telles que la régulation du cycle cellulaire, la méthylation site-spécifique et le contrôle de la réplication/lésions de l'ADN découverts dans cette thèse devraient permettre de mieux comprendre le développement cancéreux et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Increasing evidence suggests that oxidative stress plays a causative role in prostate cancer initiation and progression. Furthermore, enhanced levels of systemic oxidative stress detected in lymphocytes are also associated with prostate cancer risk. Due to mtDNA's high sensitivity to oxidative stress, we hypothesize that mtDNA may serve as a surrogate to oxidative stress in cancer cells and lymphocytes. First, we improved the sensitivity of a novel method for mtDNA damage analysis and proposed a standardized protocol. Secondly, we developed an approach for quantifying systemic oxidative stress using mtDNA responses in circulating lymphocytes. Finally, we demonstrated differential mtDNA responses induced by oxidative stress in two isogenic prostate cancer cell lines with different metastatic potential. The more metastatic C4-2 was more susceptible to oxidative stress and prone to mtDNA damage and copy number change. These results offer new insights into prostate cancer progression. / De plus en plus d'études suggèrent que le stress oxydatif joue un rôle déterminant dans l'initiation et la progression du cancer de la prostate. Aussi, des niveaux élevés de stress oxydatif systémique mesurés dans les lymphocytes ont été associés à un risque accru du cancer de la prostate. Puisque le génome mitochondrial (ADNmt) est très sensible au stress oxydatif, nous postulons que ce dernier peut servir de marqueur pour le stress oxydatif dans les cellules cancéreuses ainsi que dans les lymphocytes. Dans un premier temps, nous avons accru la sensibilité d'une nouvelle méthode d'analyse du dommage de l'ADNmt. Ceci nous a permis de proposer un protocole de mesure standardisé. Deuxièmement, nous avons développé une méthode afin de quantifier le stress oxydatif systémique en utilisant les réponses de l'ADNmt des lymphocytes. Finalement, nous avons démontré que deux lignées cellulaires prostatiques isogéniques, LNCaP et C4-2, ayant un potentiel métastatique distinct, répondaient différemment au stress oxydatif induit expérimentalement. La lignée C4-2, à potentiel plus métastatique, était plus sensible au stress oxydatif, se traduisant par une plus grande susceptibilité de l'ADNmt à être endommagé. Ces résultats apportent donc une nouvelle avenue dans la compréhension de la progression du cancer de la prostate.

Various forms of stress induce pathways that converge on the phosphorylation of the alpha (α) subunit of eukaryotic translation initiation factor eIF2 at serine 51 (S51), a modification that results in a global inhibition of protein synthesis. In many cases eIF2α phosphorylation is a biological response that facilitates cells to cope with stressful environments. Glucose deficiency, an important form of stress, is associated with an induction of apoptosis. Herein, we demonstrate that eIF2α phosphorylation is a key step in maintaining a balance between the life and death of a glucose deficient cell. That is, eIF2α phosphorylation acts as a molecular switch that shifts cells from a pro-apoptotic to a cytoprotective state in response to prolonged glucose deficiency. This adaptation process is associated with the timely expression of proteins and activation of pathways with significant contributions to cell survival and adaptation. We also show that among the eIF2α kinases GCN2 plays a pro-apoptotic role whereas PERK and PKR play a cytoprotective one in response to glucose deficiency. Our data demonstrate that eIF2α phosphorylation is a significant determinant of survival and adaptation of glucose deficient cells with possible important implications in biological processes that interfere with glucose metabolism. / Diverses formes de stress induisent des voies qui convergent vers la phosphorylation de la sous unité alpha (α) du facteur eucaryote d'initiation de la traduction eIF2 à la sérine 51 (S51). Cette modification entraîne une inhibition globale de la synthèse des protéines. Dans de nombreux cas, la phosphorylation d'eIF2α est une réponse biologique qui facilite la réaction des cellules à faire face à un environnement stressant. La déficience en glucose, une forme importante de stress, est associée à une induction de l'apoptose. Nous démontrons ici que la phosphorylation d'eIF2α est une étape clef dans le maintien de l`équilibre entre la vie ou la mort d'une cellule déficiente en glucose. La phosphorylation d'eIF2α agit comme un changement moléculaire qui entraîne le passage des cellules d'un état pro-apoptotique à un état cytoprotecteur en réponse à une déficience prolongée en glucose. Ce processus d'adaptation est associé à l'expression des protéines et l'activation de voies ayant une contribution significative à la survie et l'adaptation des cellules. Nous avons également démontré que parmi les kinases d'eIF2α, GCN2 joue un rôle pro-apoptotique tandis que PERK et PKR jouent un rôle de cytoprotecteur en réponse à une déficience en glucose. Nos résultats montrent que la phosphorylation d'eIF2α est un déterminant significatif de la survie et de l'adaptation des cellules à une déficience en glucose avec de possibles implications importantes dans les processus biologiques qui interfèrent avec le métabolisme du glucose.

Vasculopathy is a major factor in the symptoms and morbidity of scleroderma. Endothelial injury, through an unknown source, is believed to initiate this vasculopathy. While expression analysis would aid in understanding endothelial dysfunction in scleroderma, few such studies have been perform. Here, we evaluate the use of laser capture microdissection (LCM) for acquiring dermal endothelial cells from patient biopsies for real-time PCR quantification. We measured expression changes of vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2), hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha) and mineralocorticoid receptor (MR) between endothelial cells from involved and non-involved skin of same patient. LCM was adequate for acquisition of endothelial cells as it provided consistent and accurate expression Both MR and HIF-1alpha were found to be underexpressed in endothelial cells from involved skin in most patients, whereas VEGFR-2 displayed varying expression between samples. We concluded that this results from abnormal endothelial function in scleroderma and a possible adaptation mechanism in long-term disease. / La vasculopathie est un facteur majeur dans les symptômes et la morbidité de la maladie du sclérodermie. La blessure endothéliale, dont la source reste inconnue, semble initier cette vasculopathie. Bien que l'analyse expressionnelle pourrait aider à la compréhension de la dysfonction endothéliale dans le sclérodermie, très peu de ces sortes d'études ont été réalisées. Dans ce projet, nous avons évalué l'utilisation de la technique de la microdissection à capture au laser, (laser capture microdissection; LCM), pour sélectionner les cellules endothéliales dermiques à partir de biopsies de patients et ensuite quantifier l'expression par PCR en temps réel, (real-time PCR; RT-PCR). Dans les cellules endothéliales de tissus affectés et non-affectés du même patient, nous avons mesuré les changements d'expression des gènes suivants : VEGFR-2 (récepteur 2 du facteur de croissance endothéliale), HIF-1alpha (facteur inductible par hypoxie 1alpha), et MR (récepteur minéralocorticoïde). La technique de LCM a été adéquate pour capturer les cellules endothéliales et mesurer une expression consistante et exacte. Les gènes MR et HIF-1alpha ont tous les deux été sousexprimés dans les cellules endothéliales des tissus affectés chez la plupart des patients, tandis que VEGFR-2 a démontré une expression variable entre les échantillons. Nous avons conclu que ce résultat correspond à une dysfunction endothéliale présente chez les patients et possiblement à un mécanisme d'adaptation de long terme de cette maladie.

The integrity of bone is essential for normal function throughout life, because it provides a hard matrix on which the soft tissues can operate; facilitating protection of body organs, storage of micronutrients, and locomotion. Bone itself begins as a soft tissue secreted by the bone forming cells, the osteoblasts: these cells secrete the soft matrix and then regulate its mineralization to the hard skeleton. However, before mineralization can occur, the soft matrix, or “osteoid” secreted by the osteoblasts must be of proper microstructure such that the mature bone is formed on an underlying matrix that can withstand the tensile forces and storage requirements that will be placed upon it. Crosslinking of the extracellular matrix components by a class of enzymes, the transglutaminases, is thought to play an important role in assuring the quality of osteoid before mineralization occurs. The transglutaminases are a family of calcium-dependent enzymes that can stabilize protein networks by covalent crosslinks between glutamine side chains and lysines or other primary amines. Previous studies have indicated that the transglutaminases TG2 and FXIIIa are expressed in bone, and that they are capable of crosslinking components of the osteoid such as fibronectin and collagen in vitro. This study sought to identify elements regulating transglutaminase expression and cross-linking activity in maturing cultures of mouse calvarial preosteoblasts. The data confirm previous findings that FXIIIa, but not TG2, is externalized in differentiating osteoblasts. Newly realized is that this externalization is due to concurrent collagen type I secretion and deposition, and not due to direct affects of AA. Furthermore, externalization is required by the MAPK-pathway, but is apparently not mediated through collagen signaling via its receptor, the α2β1 integrin. In addition, collagen was found to not be a glutamine substrate donor for the transglutaminase-mediated crosslinking r / La santé et l'intégrité du tissu osseux représentent un attribut essentiel pour le bon fonctionnement de l'organisme tout au long de sa vie. Le tissu osseux fournit à l'organisme une structure dure et solide au moyen de laquelle l'ensemble de la matière organique et les tissus biologiques mous peuvent fonctionner correctement. La structure robuste et fonctionnelle de l'os facilite la protection des organes du corps et l'entreposage des éléments nutritifs et joue un rôle décisif dans la locomotion. L'os naît sous forme d'un tissu mou appelé tissu ostéoïde élaboré comme produit de sécrétion des cellules génératrices de tissu osseux, à savoir les ostéoblastes. Ces cellules secrètent la matière organique molle qui sera ensuite minéralisée à la suite de l'action coopérative concertée des protéines et d'autres biomolécules pour former la matière dure du squelette. Cependant, avant que la minéralisation soit commencée le tissu ostéoïde mou sécrété par les ostéoblastes doit posséder une microstructure appropriée de telle sorte que l'os mature soit développé sur un support accommodant de contraintes mécaniques et qui permettra l'entreposage des éléments et substances métaboliques qui vont s'y déposer. La réticulation (ou le crosslinking, de l'anglais) des composants de la matrice extracellulaire élaborée par les ostéoblastes par une classe d'enzymes connues sous le nom de transglutaminase joue en rôle déterminant pour la qualité du tissu ostéoïde généré avant la minéralisation. Les molécules transglutaminase font partie d'une famille d'enzymes critiques au calcium qui stabilisent le réseau des protéines par la formation de liaisons covalentes de type crosslinking entre les fonctionnalités chimiques amminées de la glutamine et de la lysine ou des autres biomolécules contenant des amines primaires. Alors que de travaux de recherche ont montré que les transglutaminases TG2 et FXIIIa sont exprimées dans l

The Birt-Hogg-Dubé (BHD) syndrome is a hereditary human cancer syndrome that predisposes affected individuals to develop skin hamartomas, lung cysts and pneumothorax as well as renal carcinoma. BHD is caused by loss-of-function mutations in the folliculin (FLCN) gene. The molecular function of the FLCN gene product is still largely unknown; opposite and conflicting evidence of mTOR signaling activity has been reported. To further study the development of BHD malignancies, a novel conditional Pax8Cre FLCN floxed mouse model was generated. Pathological analysis revealed that the mice developed a unique and relevant phenotype of renal tubule hyperplasia, multifocal renal cysts, adenomas as well as histiocytic sarcoma. From this model, FLCN-null MEFs were generated to further investigate the molecular pathways by which FLCN suppresses tumorigenesis. Preliminary data showing lengthened survival of FLCN-null MEFs under metabolic stress supports a role for FLCN in nutrient sensing. Upon further investigation, FLCN-null MEFs show an increase in mitochondrial biogenesis as denoted by an increase in AMP:ATP ratio, respiration rates, lactate levels, mitochondrial numbers and PGC1-alpha/beta transcripts. We hypothesize that the previously shown indirect physical interaction between AMPK and FLCN could provide a rationale for the striking metabolic phenotype. To this end, FLCN-null MEFs with stably knocked down levels of AMPKalpha1/2 isoforms were generated in an attempt to rescue the novel metabolic phenotype. Altogether, these studies are aimed to further elucidate the metabolic function of FLCN in order to better understand its role as a tumor suppressor. / Le syndrome de Birt-Hogg-Dubé (BHD) prédispose les personnes atteintes à développer des hamartomes de la peau, des kystes pulmonaires et un carcinome du rein. Le syndrome de BHD est causé par des mutations causant la perte de fonction d'un gène encodant la folliculine (FLCN). Les fonctions moléculaires de la FLCN sont encore peu connues. Ici, nous étudions la progression de néoplasmes du syndrome de BHD, tel que de l'hyperplasie kystique et des adénomes rénaux, en utilisant un nouveau modèle de souris transgénique conditionnel Pax8 Cre FLCN. Créés de ce modèle, des fibroblastes embryonnaires de souris (FES) nuls pour l'expression de la FLCN présentent une survie prolongée face à restrictions nutritives de même qu'une augmentation de biogénèse mitochondriale tel que démontré par des taux élevés d'ARN messager de PGC1-alpha/beta, un haut ratio d'AMP:ATP et une augmentation de phosphorylation oxidative. Ensemble, ces données préliminaires et inédites supportent un rôle pour la FLCN dans la détection de nutriments. Nous émettons l'hypothèse que l'interaction précédemment publiée entre la kinase AMPK et le FLCN pourrait expliquer ce phénotype métabolique. Afin de vérifier cette hypothèse, les FES nuls pour la FLCN exprimant des shARN de la kinase AMPK alpha1/2 stable ont été générés. Ensemble, ces études novatrices ont comme but d'élucider les fonctions métaboliques de la FLCN afin de mieux co mprendre son mécanisme de suppression de tumeurs.

Protein synthesis is a highly regulated process and it is vital to life. If the rate of translation is too slow, proteins will not be replaced fast enough causing an imbalance in protein turnover and eventual cell death. On the other hand, if the rate of translation is too fast, it can lead to uncontrolled growth and potential tumorigenesis. The scientific community is now trying to exploit this concept to create novel anticancer therapies using inhibitors of translation. These inhibitors have also been invaluable to dissecting the mechanism of translation.Hippuistanol is an inhibitor of translation initiation which inhibits eIF4A:RNA interaction. Herein I characterize the binding site of hippuristanol on eIF4A and develop hippuristanol-resistant mutants to demonstrate that both helicase activity and eIF4G:eIF4A interaction are absolutely required for eIF4A to function in translation. As well, I utilize this compound to determine that eIF4B, eIF4H, and eIF3a cross-link to RNA in an eIF4A-dependent manner up to 52 nucleotides downstream from cap structure of the mRNA. We also demonstrate that eIF4E only cross-links to RNA within a few nucleotides of the cap structure and is not visible at 12 nucleotides downstream of the cap structure. These results shed light on the positioning of initiation factors within the 5'UTR.Herein I also present that cytotrienin A, an inducer of apoptosis in leukemia cell lines, as a novel inhibitor of translation elongation. The compound inhibits proper eEF1A function and inhibits translocation when aminoacyl-tRNA is loaded onto the ribosome in an eEF1A-dependent fashion. Cytotrienin A also hindered growth in several models of angiogenesis indicating that this compound has potential as an anticancer therapeutic. These results strengthen the idea that inhibitors of translation have great potential as anticancer agents as well as being great tools to dissect the mechanism of protein synthesis. / La synthèse protéique ou traduction est un processus hautement régulé et essentiel à la vie. Si le rythme de synthèse protéique est trop lent, les protéines ne sont pas remplacées assez rapidement créant un débalancement du taux de renouvellement protéique ce qui entraîne la mort cellulaire. À l'opposé, si le rythme de synthèse est trop rapide, ceci peut engendrer une croissance cellulaire anarchique et potentiellement initier la tumorigenèse. La communauté scientifique cherche à exploiter ce concept afin de créer de nouvelles thérapies anticancéreuses utilisant des inhibiteurs de la traduction. Ces inhibiteurs sont également des outils inestimables pour disséquer les mécanismes de la traduction.L'hippuristanol est un inhibiteur de la traduction qui bloque l'interaction entre eIF4A er l'ARN. Ici, j'ai caractérisé le site de liaison de l'hippuristanol sur eIF4A et j'ai développé des mutants résistant à l'hippuristanol qui ont servis à démontrer que la fonction d'hélicase et l'interaction eIF4G:eIF4A sont toutes deux requises pour que eIF4A soit fonctionnel dans la traduction. De plus, j'ai utilisé ce composé pour déterminer que eIF4B, eIF4H et eIF3a sont tous liés à l'ARN par chimio-pontage et ces interactions qui peuvent être détectées jusqu'à 52 nucléotides en aval de la coiffe requièrent eIF4A. Nous avons également démontré que l'association de eIF4E à l'ARNm n'est détectée par chimio-pontage qu'avec les quelques nucléotides immédiatement en aval de la coiffe et n'est pas détectable au niveau du douzième nucléotide. Ces résultats ont éclaircis le positionnement des facteurs d'initiation au niveau du 5'NTR.Ici, je démontre également que la cytotriénine A, un inducteur d'apoptose dans les cellules leucémiques, est un nouvel inhibiteur de l'élongation lors de a traduction. Ce composé inhibe le fonctionnement du facteur eEF1A et inhibe l'étape de translocation dépendante de eEF1A qui ensuit le chargement du complexe aminoacyl-tRNA sur le ribosome. Le cytotriène A empêche également la croissance dans plusieurs modèles d'angiogenèse, indiquant que ce composé possède un potentiel comme agent anticancéreux. Ces résultats renforcent l'idée que les inhibiteurs de la traduction possèdent un énorme potentiel en tant qu'agent anticancéreux, ainsi que comme outils afin de décortiquer les mécanismes gouvernant la synthèse protéique.