In Canada, prostate cancer is the most frequently diagnosed cancer in man and the third leading cause of cancer related death. In order to identify genes implicated in prostate cancer progression, we used microcell-mediated chromosome transfer to introduce chromosomes 10, 12, 17 and 18 into human PC-3-derived cells lines called PC-3M-Pro4GP1 and PC-3M-LN4GP2. The properties of the hybrids were determined by invasion assay, growth in soft agar and injection into nude mice (either subcutaneously or orthotopically). After the transfer of chromosome 18 in our cell lines, we have identified two sets of hybrids that show opposite phenotypes. Genotyping studies indicated that one locus on chromosome 18 (D18S51) contains an additional allele in the less tumorigenic hybrids. This allele is absent in the highly tumorigenic hybrids as well as in tumors derived from the injection of less tumorigenic cells into nude mice. Preliminary microarray data analysis showed that two genes located in the D18S51 region (ERK4 and BCL2) were differentially expressed in the less tumorigenic hybrids compared to the tumorigenic hybrids. We examined publicly available microarray data sets and found that ERK4 was down regulated in prostate, adrenal and lung cancers. We have also examined the possibility that the metastasis suppressor gene MASPIN (also located in the D18S51 region) could be responsible for the less tumorigenic phenotype seen in our hybrids. Real-time PCR studies showed that ERK4 and MASPIN were up regulated in the less tumorigenic hybrids and that BCL2 was down regulated in these same cells. However, Western immunoblot experiments did not show any difference in the MASPIN or the BCL2 protein levels. Thus, MASPIN or a BCL2 repressor are most likely not responsible for the less tumorigenic phenotype of our hybrids. Interestingly, re-introduction of ERK4 in our tumorigenic hybrids completely abolished their ability to form colonies in soft agar and to invade through Matrigel. However, there is no difference in tumor growth rate upon injection of ERK4-over-expressing cells compared to mock-transfected controls. We also found a non-synonymous polymorphism in the coding sequence of the ERK4 gene. This polymorphism is present at the same frequency in Asian, European and Ashkenazi Jewish populations but less frequently in the African (Yoruba) population. This is the first report of a non-synonymous polymorphism in the coding sequence of the ERK4 gene. However, based on a limited number of prostate cancer cases, the presence of this poylmorphism is not associated with the disease. Taken together, these results demonstrate that ERK4 is a good candidate for a tumor suppressor gene implicated in prostate cancer progression.

The CDP/Cux transcription factor is expressed as a 200 kDa protein that interacts rapidly and transiently with DNA. Proteolytic processing generates a shorter isoform, p110 CDP/Cux, that binds stably to DNA. Processing occurs at the G1/S transition of the cell cycle in normal cells, and constitutively in transformed cells. p110 CDP/Cux stimulates cell proliferation by accelerating entry into S phase. Transgenic mice expressing p110 CDP/Cux are more susceptible to different cancers. / CDP/Cux was originally described as a repressor of transcription. My goal was to verify whether CDP/Cux might also participate in transcriptional activation and characterize the molecular basis for transcriptional activation by CDP/Cux. Using the DNA polymerase alpha gene promoter as a model system, I showed that stimulation of a DNA pol alpha reporter correlated with DNA binding. Importantly, p110 CDP/Cux stimulated expression from the endogenous DNA pol alpha promoter. Linker-scanning analysis of the DNA pol alpha promoter identified a cis-element that was required for p110-mediated activation, yet was not bound by it. I determined that E2F1 and E2F2 cooperated with p110 in activating the DNA pol alpha promoter, and did so via this cis-element. Furthermore, CDP/Cux recruited these E2Fs to the promoter in chromatin immunoprecipitation experiments. Location array analysis revealed many targets common to p110 and E2F1. DNA metabolism and cell cycle targets were overrepresented, and further studies showed that p110 and E2F cooperated to activate many cell cycle genes. / I also described a second proteolytic event, which generated an isoform lacking two active repression domains in the C-terminus. Processing was observed in S phase, but not in early G1, suggesting that processing occurs in proliferating cells. I determined that caspases were responsible for this processing, and that this occurs in non-apoptotic conditions. A C-terminally-truncated CDP/Cux protein was a more potent activator of cell cycle-regulated promoters, and accelerated entry of Kit225 T cells into S phase, while uncleavable p110 CDP/Cux proteins were inactive in both assays. These results identified p110 CDP/Cux as a substrate of caspases in proliferating cells, and suggested a mechanism by which caspases may accelerate cell cycle progression.

In humans, there are 18 known histone deacetylases (HDACs) that can be divided into four classes, with HDAC4, 5, 7 and 9 forming the class IIa subgroup. These four deacetylases are signal-responsive transcriptional co-repressors involved in a wide variety of physiological and pathological processes. In response to a spectrum of extracellular signals, class IIa HDACs become phosphorylated on three or four conserved serine residues, creating specific binding sites for 14-3-3 chaperone proteins and inducing deacetylase nuclear export and derepression of target genes. The goal of my thesis project was to identify regulatory mechanisms underlying class IIa HDAC nucleocytoplasmic trafficking. Following a literature review in Chapter I are two sets of novel findings from my thesis project. In Chapter II, I identify the salt-inducible kinases, SIK2 and SIK3 as novel class IIa HDAC kinases that induce the nuclear export of these deacetylases. I also demonstrate that SIK2/3-mediated HDAC export is stimulated by liver kinase B1 (LKB1, a major tumour suppressor for lung and other cancers) and inhibited by protein kinase A (PKA). In Chapter III, I demonstrate that PKA can also prevent nuclear export of HDAC4, 5, and 9 independent of SIK2/3 inhibition. PKA achieves this by controlling a novel phosphorylation event that is unique to these three deacetylases but absent from HDAC7. Due to the pervasive roles of LKB1, PKA, and class IIa HDACs in health and disease, these findings may lead to a better understanding of the etiology of various maladies and point to novel targets for therapeutic intervention in the future. / Chez l'homme, la famille d'enzymes histone déacétylase (HDAC) compte 18 membres. Ces protéines peuvent être répartis en quatre classes; dont la classe IIa est composée d'HDAC4, 5, 7 et 9. Les membres de cette classe agissent comme corépresseur de la transcription et interviennent dans une grande variété de processus physiologiques et pathologiques. En réponse à une gamme copieuse de signaux extracellulaire, les HDAC de la classe IIa sont phosphorylées sur trois ou quatre résidus sérine conservés. Cet événement crée des sites de liaison spécifiques pour les protéines 14-3-3, qui agissent comme chaperon et induisent l'exportation nucléaire des HDAC. De ce fait, la relocalisation des HDAC, anéantit la répression d'expression de gènes cibles. Le but de mon projet de thèse était d'identifier les mécanismes sous-jacents qui règlent la localisation nucléocytoplasmique de la classe IIa d'HDAC. Suite à une revue de la littérature scientifique au chapitre I, deux séries de résultats parvenant de mon projet de recherche sont présentées. Dans le chapitre II, j'identifie les protéines salt-inductible kinase, SIK2 et SIK3, comme étant kinases d'HDAC de la classe IIa qui induisent l'exportation nucléaire de ceux-ci. Je démontre ainsi que cette exportation est stimulée par liver kinase B1 (LKB1, un suppresseur de tumeur impliqué dans la pathologie de plusieurs cancers) et inhibée par la protéine kinase A (PKA). Dans le chapitre III, je démontre que la PKA peut également empêcher l'exportation nucléaire de HDAC4, 5 et 9 indépendamment de SIK2/3. PKA atteint cet objectif en dirigeant un événement de phosphorylation unique au déacétylases de la classe IIa, autres que HDAC7. En effet, puisque LKB1, PKA, et les HDAC de la classe IIa jouent un rôle omniprésent en matière de santé, ces résultats pourraient conduire à une meilleure compréhension de l'étiologie de diverses maladies et engendrer des nouvelles cibles thérapeutiques.

A number of innovative techniques were developed to carry genetic material into cells, making gene therapy one of the most active fields in biotechnology. Interest in this domain is due to two factors: the therapeutic potential of the approach and lack of delivery systems which fulfil all requirements for clinical implementation. The advent of new nanotechnologies, combined with a better understanding of biological processes, enables the development of more sophisticated tools for delivery of genetic material to cells. This thesis reports on these novel nanocarriers with promising features for gene delivery. The first part of this thesis describes the state of the art of gene delivery approaches relevant to the research conducted throughout this PhD project. Major gene delivery systems are described to give insight into current advancements, limitations and challenges in the field. This section is followed by a review of therapeutic agent delivery using chitosan-based nanocarriers. In this review, we provide a summary of the most important progress concerning the use of chitosan to produce nanocarriers for several forms of delivery; this includes small molecules, proteins and genetic material. New trends in the area of gene delivery such as the development of stimuli-sensitive devices are described in a separate chapter in order to illustrate the new trends in the field of therapeutic delivery. Together, these three chapters provide a background to better understand the motivation behind the development of the nanocarriers. The second part of the thesis focuses on design and assembly of novel non-viral nanocarriers for gene delivery applications. The characterization and optimization of a delivery system formulated with chitosan and hyaluronic acid are presented, providing an original and viable option to transfer genetic material into cells. The functionalization of the chitosan-based nanocarriers, to obtain an ultraviolet light stimuli-sensitive gene delivery system, is also accomplished, allowing a better control of the spatiotemporal release of genetic material. Validation of the assembly, combined with a proof of concept of nanocarrier functionality, is demonstrated.The research conducted during this PhD thesis represents a significant step towards the development of a new generation of smart carriers, with safer and more efficient delivery of therapeutics. It provides the foundation for further development of a low-cost and easy to produce delivery system, with readily available, biocompatible and biodegradable materials with tunable properties. / Une multitude de techniques innovatrices ont été établies, pour transporter ou effectuer la correction de gènes à l'intérieur des cellules; rendant la thérapie génique un des secteurs les plus actifs de la recherche biomédicale. L'intérêt pour ce champ d'expertise est principalement attribuable à deux principaux facteurs : les gigantesques attentes médicales associées à ce type de traitement, ainsi que l'absence de système présentant les caractéristiques nécessaires pour l'implémentation de cette technologie, dans le milieu clinique. L'avènement de procédés novateurs, combiné à une compréhension plus approfondie des processus biologiques, rend possible l'élaboration d'outils plus sophistiqués pour la vectorisation de matériel génétique. En l'occurrence, cette thèse expose une de ces nouvelles innovations, par la présentation d'un nanotransporteur comportant des particularités avantageuses, pour de futures applications dans le domaine de la thérapie génique.La première partie de cet ouvrage offre une vue d'ensemble des derniers développements technologique, en relation avec le projet de recherche de ces études de PhD. Un survol des principaux progrès technologies, pour exécuter l'insertion d'information génétique à l'intérieur des organismes, est décrit. Cela permet de connaître les limitations, les avancées et les défis actuels qui restent à surmonter pour permettre, à ce type de traitement, d'être utilisé cliniquement. Cette section est suivie de deux revues concises de la littérature. L'une présente l'utilisation de nanotransporteurs, constitués de chitosan, pour le largage d'agents médicinaux. L'autre décrit les principes fondamentaux, reliés aux systèmes répondants et sensibles aux stimuli spécifiques afin de libérer des composées thérapeutiques. La compilation de ces données scientifiques constitue un élément essentiel dans la conception des transporteurs réalisés au cours de ce doctorat. La seconde partie consiste en la conceptualisation, la réalisation et la validation du concept des nanoparticules à base de chitosan et d'acide hyaluronique comme véhicule de matériel génétique. L'optimisation et la caractérisation de ces nanovecteurs, ont été effectuées avec succès ; fournissant ainsi une avenue prometteuse pour le transfert de gènes à l'intérieur des cellules. Un composé chimique photosensible a été synthétisé et incorporé aux nanoparticules décrites ci-haut, pour leur conférer une fonction particulière : le largage d'ADN en réponse à des stimuli lumineux. L'ensemble du travail accompli durant cette thèse a permis de développer un vecteur du matériel génétique, peu coûteux et facile à produire, avec des matériaux biocompatibles et biodégradables. Elle constitue une contribution considérable dans l'élaboration de véhicules non viraux, pour sa mise en application dans le domaine de la thérapie génique.

Histone deacetylases (HDACs) are members of an important family of enzymes that govern acetylation of histone and non-histone proteins in many biological processes. HDAC4, -5, -7 and -9, members of class IIa, share a unique tripartite structure enabling them to function as signal-responsive transcriptional modulators. Phosphorylation of their conserved serine residues leads to 14-3-3 protein-dependent nucleocytoplasmic shuttling and regulation of HDAC-mediated transcriptional control. In addition, intrinsic nuclear import and export signals actively dictate the subcellular localization of these deacetylases. Despite such similarity, they display differential nucleocytoplasmic localization. To gain a better understanding of the molecular determinants behind this difference, I sought to compare various sequence elements systematically. Through this analysis, I have found that while several N-terminal sequence elements and a highly conserved region mediating PKA-directed nuclear import contribute to the distinct basal localization patterns of class IIa members, the NLS, NES, and a HDAC7-specific 14-3-3 binding motif are all insufficient, on their own, of governing this regulatory mechanism. Instead, the unique combination of these molecular elements is responsible for differences in their basal subcellular localization. Due to the importance of class IIa HDAC activity in vivo, these findings may provide a better comprehension of the regulatory mechanisms governing their function in a variety of physiological and pathological processes. / Les histones déacétylases (HDAC) sont membres d'une famille d'enzymes importante qui régissent l'acétylation des histones et protéines non-histone dans de nombreux processus biologiques. HDAC4, -5, -7 et -9, membres de la classe IIa, partagent une structure tripartite unique leur permettant de fonctionner comme modulateurs signal-sensible de la transcription. La phosphorylation de leurs résidus sérine conservée conduit à la relocalisation nucléocytoplasmique par le biais d'interaction avec les protéines 14-3-3 et à la régulation de leur fonction comme corépresseur de la transcription. De plus, des séquences agissant comme signaux d'importation et d'exportation nucléaire dictent également la localisation subcellulaire de ces déacétylases. Malgré cette similitude, ces enzymes démontrent une localisation subcellulaire distincte. Pour acquérir une meilleure compréhension des déterminants moléculaires à l'origine de cette différence, j'ai cherché à comparer divers éléments de leur séquence systématiquement. Quoique quelques éléments de l'extrémité N-terminale et une région hautement conservée qui gère l'importation nucléaire induit par PKA contribue à la localisation distinct des membres de la classe IIa, les régions NLS, NES et un site de liaison 14-3-3 spécifique à HDAC7 sont tous insuffisants, à eux seuls, de diriger ce mécanisme de régulation. De ce fait, la combinaison unique de ces éléments moléculaires dans les membres de la class IIa est responsable pour les différences dans leur localisation subcellulaire basale. Puisque l'activité des HDACs de la classe IIa est indispensable in vivo, ces résultats pourraient conduire à une meilleure compréhension des mécanismes qui régissent leur fonction dans divers processus physiologiques et pathologiques.

Gene amplification and elevated expression of ErbB2 receptor tyrosine kinase has been implicated in the development and progression of human breast cancer, and correlates to poor clinical outcomes. Transgenic mouse models provide a good tool to study ErbB2 mediated mammary tumourigenesis. In both human ErbB2 positive mammary tumour and ErbB2 knock-in mouse model derived mammary tumours, Grb7 is found to be co-amplified and co-expressed with ErbB2. Here we demonstrated ectopic expression of Grb7 in MDCK cells correlates to the loss of epithelial cell polarity, and this was also found true in primary mammary epithelial cells derived from transgenic mice overexpressing Grb7. Elevated expression of Grb7 in mouse mammary gland during developing stage can lead to incomplete mammary ductal outgrowth accompanied by mammary ducts with multiple epithelial layers and myoepithelial missing. NDL transgenic overexpressing Grb7 had longer tumour latency, and it was found that NDL tumours selectively down-regulated the induced-expression of Grb7. / L'amplification génique et l'expression élevés de récepteur tyrosine kinase ErbB2 a été impliqués dans le développement et la progression du cancer du sein humain, et corrèle avec de mauvais résultats cliniques. Les modèles de souris transgéniques constituent un bon outil pour étudier la formation de tumeurs médiées par ErbB2 dans la glande mammaire. Dans le cancer mammairehumaines positif pour ErbB2 et le modèle de cancer mammaire de souris ErbB2 knock-in, Grb7 est co-amplifié et co-exprimé avec ErbB2. Ici, nous avons démontré que l'expression ectopique de Grb7 dans les cellules MDCK corrèle avec la perte de polarité des cellules épithéliales, et qui est aussi consistent dans les cellules épithéliales mammaires primaires dérivés de souris transgéniques surexprimant Grb7. Expression élevée de Grb7 dans la glande mammaire de souris pendant la phase de développement peut causer l‟incomplets excroissance canalaires mammaires accompagnés par des conduits mammaires avec de multiples couches épithéliales et myoépithéliales manquants. NDL transgéniques surexprimant Grb7 avait une plus longue délais avant formation de tumeur, et il a été constaté que les tumeurs NDL, de façon sélective, perde la capacité d`induirel`expression de Grb7.

Lung cancer is the leading type of cancer-related death among Canadians. The most common type of lung cancer, adenocarcinoma, is a form of non-small cell lung cancer (NSCLC) that accounts for ~45% of all lung cancers. Activating mutations in RAS and RAF, key players in the MAPK pathway, are found in 25% of NSCLC. BRAFV600E is the most common BRAF mutation and results in a constitutively active form of the kinase. In a previously developed murine model (BRafCA), BRAFV600E activation was shown to co-operate with p53 loss in the initiation and development of adenocarcinoma. This model has allowed us to identify genes responsible for malignant progression, but because oncogene activation and tumour suppressor gene (TSG) loss occur simultaneously, it is unclear temporally how these separate genetic events impact lung cancer progression. The focus of the study, therefore, has been on the construction and characterization of a novel mouse model that allows for BRAFV600E activation to occur independently of p53 loss. The genomic BRaf locus was altered using a targeting vector carrying a a cassette comprised of portion of wild type BRAF cDNA flanked by FLP recognition target (frt) sites. The exon following the frt-flanked cassette was modified to harbour the V600E mutation. This system allows for expression of the normal allele at physiologic levels prior to FLP-mediated recombination, whereafter BRAFV600E is expressed. In a similar manner, the endogenous p53 locus was targeted such that loxP sites flank a large portion of the coding region. In this way, BRAFV600E and p53 can be independently activated and ablated with the use of FLP and Cre recombinases, respectively. To determine the function of the engineered BRaf allele, we infected the mice with an adenovirus carrying the FLP recombinase via intranasal instillation. Eight weeks post-infection, the mice were sacrificed and the lungs were found to contain multiple lesions (adenomas). Importantly, adenomas were produced solely in response to FLP and not Cre recombinase. Furthermore, the tumours that developed were identical to those produced from the BRafCA allele, with respect to time of formation as well as proliferative capacity. Preliminary work involving the use of adenoviral vector-mediated delivery of the individual Cre and FLP recombinases revealed that our current method of TSG ablation is insufficient to produce an observable phenotype. To remedy this, bicistronic lentiviral fusion vectors have been created and tested in vitro. These will allow for the user-controlled expression of both recombinases within a single genetic element, thereby overcoming the requirement for a secondary infection. When used in conjunction with a Cre-conditional p53 null allele, this model will provide complete temporal control over the timing of the independent genetic events, and will allow us to more accurately model human tumourigenesis. / De tous les types de cancer, le cancer du poumon est celui ayant la plus grande mortalité au Canada. Le type le plus commun de cancer du poumon, l'adénocarcinome, est une forme de cancer du poumon non à petites cellules (CPNPC) qui correspond à environ 45% de tous les cancers pulmonaires. Des mutations activatrices de RAS et RAF, des membres importants de la voie MAPK, sont détectées dans 25% des CPNPC. BRAFV600E (BRAFVE) est la mutation la plus fréquente de BRAF et a comme conséquence une forme constitutivement active de la kinase. Dans un modèle murin développé précédemment (BRAFCA), il a été montré que BRAFVE coopère avec la perte de p53 dans l'initiation et le développement d'adénocarcinomes. Ce modèle nous a permis d'identifier des gènes responsables de la progression maligne, mais puisque l'activation de l'oncogène et la perte du gène suppresseur de tumeurs (GST) se produisent simultanément, on ne peut déterminer comment chacun de ces événements génétiques peuvent avoir un impact au niveau temporel sur la progression du cancer. Ainsi, le but de cette étude était la construction et la caractérisation d'un nouveau modèle de souris permettant l'activation de BRAFVE indépendamment de la perte de p53. Le locus génomique de BRaf a été modifié en utilisant un vecteur portant une portion de l'ADNc de type sauvage de BRAF situé entre deux sites de reconnaissance de FLP (FLP recognition target, frt). L'exon qui suit cette cassette a été modifié pour porter la mutation V600E. Ce système permet l'expression de l'allèle normal à des niveaux physiologiques précédant la recombinaison par la recombinase FLP, après quoi BRAFVE est exprimé. De façon similaire, le locus endogène de p53 a été modifié de façon à contenir des sites loxP qui chevauchent une grande portion codante du gène. Ainsi, l'activation de BRAF et la perte de p53 peuvent être dictées de façon indépendante en utilisant les recombinases Flp et Cre, respectivement. Pour déterminer la fonction de l'allèle de BRaf que nous avons conçu, nous avons infecté des souris avec un adénovirus experimant la recombinase FLP par instillation intranasale. Huit semaines post-infection, les souris ont été sacrifiées et plusieurs lésions, des adénomes, ont été observées dans les poumons. De plus, ces adénomes se sont formés seulement en la présence de la recombinase FLP et non la Cre. Par ailleurs, ces tumeurs étaient identiques à celles produites avec l'allèle BRafCA, tant au niveau du temps de formation que de leur capacité à proliférer. Des résultats préliminaires impliquant l'utilisation des recombinases individuellement ont révélé que notre méthode actuelle de suppression de GST est insuffisante pour produire un phénotype observable. Pour y remédier, des vecteurs lentiviraux à expression bicistronique ont été créés et testés in vitro. Ceux-ci vont permettre à l'utilisateur de contrôler l'expression de chaque recombinase avec un seul élément génétique, évitant du coup le besoin de recourir à une deuxième infection. Lorsqu'utilisé en conjonction avec un allèle nul de p53 conditionnel à la Cre, ce modèle va fournir un contrôle temporel complet sur plusieurs événements génétiques indépendants, et ainsi permettre de modeler de façon plus fidèle la tumorigenèse humaine.

Grb2, an adaptor protein, is ubiquitously expressed and is involved in mediating a multitude of cellular processes in various body tissues such as development and tumourigenesis. Grb2 binds to proteins via its Src-homology domains and by doing so brings them in proximity of each other. In breast tissue, Grb2 can recruit SOS and Gab1 to the plasma membrane by binding to a specific phosphorylated tyrosine residue of HER2, a member of the epidermal growth factor receptor family. HER2 is overexpressed and activated in 20-30% of human breast cancers and correlates with poor patient prognosis. In transgenic mouse models, activated Neu, a rat analog of HER2, has shown the ability to induce mammary tumours. Given that Grb2 is a link between HER2 and tumourigenic signaling pathways, the goal of the current study was to investigate how loss of Grb2 expression affects mammary gland development and mammary tumourigenesis using a conditional Grb2 mouse model. Differences in protein expression, ductal outgrowth, delay in tumour onset, metastasis to the lung were some of the measurements taken to evaluate the role of Grb2. Also, parallel in-vivo experiments were conducted by using shRNA construct targeted to Grb2 in mammary gland tumour-derived cell lines. As expected, it was uncovered that Grb2 is required for normal mammary gland development and mammary tumour initiation in a HER2-induced mammary tumour mouse model but its mechanism of action has yet to be elucidated. / Growth factor receptor bound protein 2(Grb2) est une protéine adaptatrice, exprimée demanière ubiquitaire, qui joue un rôle important dans une multitude de processus cellulaires tels que le développement mammaire et la genèse de tumeurs mammaires. Grb2 regroupe diverses protéines grâce à ses domaines d'homologie Src afin de permettre leur interaction. Dans les tissues mammaires, Grb2 peut recruter SOS et Gab1 à la membrane plasmique en se liant à une tyrosine spécifique, phosphorylée et localisée sur HER2, un membre de la famille des récepteurs du facteur de croissance épidermique. HER2 est sur exprimé et activé dans 20-30% des cancers du sein et est lié à un mauvais pronostic chez le patient. Plusieurs études effectuées à partir de modèles de souris transgéniques, ont démontrées la capacité d'ErbB2, l'analogue d'HER2 chez la souris, à induire des tumeurs mammaires. L'objectif de ma recherche est d'étudier les conséquences de l'ablation fonctionnelle et spécifique de Grb2. Un modèle de souris avec un knock-out spécifique de Grb2 au niveau des glandes mammaires permet d'étudier le rôle distinctif de la protéine dans le cadre de la genèse des tumeurs mammaires. Les différences au niveau de l'expression protéique de Grb2, la longueur des canaux lactifères, le délai au niveau de l'apparition de tumeurs et les métastases aux poumons détectés chez l'animal représentent quelques-uns des paramètres évalués afin de déterminer l'importance de Grb2 dans le développement des tumeurs mammaires. Parallèlement, des expériences in vitro tel l'utilisation de constructions shRNA ciblant l'ARN messager de Grb2 introduits dans une lignée cellulaire dérivée d'une tumeur de la glande mammaire, permettent d'élaborer sur le rôle de la protéine d'intérêt dans le développement des tumeurs mammaires.

The transforming growth factor beta (TGFbeta) superfamily comprises a large group of structurally and functionally related pluripotent polypeptide growth factors that regulate a variety of cellular processes including; proliferation, lineage determination, differentiation, motility, adhesion and cell death. Although diverse in their final effects, the basic intracellular signaling cascade governing responses initiated by TGFbeta family members is highly conserved throughout evolution, from nematodes to humans. / Ligands of the TGFbeta superfamily bind heteromeric complexes of type I and type II serine/threonine kinase receptors at the cell surface, which phosphorylate the primary intracellular mediator of the signaling cascade, the receptor-regulated Smads (R-Smads). Phosphorylated R-Smads then form heterotrimeric complexes with the common partner Co-Smad, Smad4, and accumulate within the nucleus to associate with various coactivators or co-repressors of transcription, to either activate or repress the transcription of various target genes. / The studies in this thesis were conducted to gain a better understanding of the molecular mechanisms mediating and regulating signaling by activin/TGFbeta. In the first study we examined the role of activin in inhibiting cell growth within human heptocarcinoma cells. This study revealed that activin-induced cell growth arrest within hepatocytes is mediated by the cyclin dependent kinase inhibitor p15 and Sp1. In the second study, we identified the G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as a novel activin/TGFbeta-inducible antagonist of activin/TGFbeta signal transduction, initially within hepatocytes, and then extended our finding to other normal and cancer cell types. In particular, we defined GRK2 mediated phosphorylation of the R-Smads to inhibit TGFbeta-mediated target gene expression, cell growth inhibition and apoptosis. In a subsequent study we examined, at a molecular level, the mechanism by which GRK2 targeted phosphorylation of the Smad linker region modifies the behavior of the R-Smads, leading to an inhibition of signaling, through the use of a mutant R-Smad to mimic the structural and electrostatic properties of GRK2-mediated phosphorylation. This study defines novel dominant negative forms of the R-Smads that antagonize activin/TGFbeta signaling. / Together, our results indicate that GRK2 is a potent negative feed-back regulator of activin/TGFbeta signaling in a variety of cell types and has the capacity to block, in particular, activin/TGFbeta-induced p15 expression, leading to an inhibition of activin/TGFbeta induced growth arrest and apoptosis. Moreover, the use of GRK2 phospho-mutant R-Smads, with the capacity to inhibit endogenous R-Smad signaling, may provide insights into the development of novel antagonists to the activin/TGFbeta signaling.

Osteopetrosis is a genetic disorder resulting from excessive amount of bone due to a defect in osteoclasts. Our laboratory characterized the Ostm1 gene that is responsible for the most severe form of osteopetrosis in mice and humans. In addition, our laboratory then identified the Inositol polyphosphate 4- phosphatase type II alpha (Inpp4b alpha) gene in a differential display screen with reduced expression in Ostm1 deficient osteoclasts. Following characterization of the mouse Inpp4b gene, its role in bone biology was investigated. First, Inpp4b alpha co-localized with F-actin in the podosome subunits, which forms the actin ring of the osteoclast cytoskeletal structure that is essential for osteoclast resorption activity. Second, expression of the phosphatase-inactive Inpp4b in RAW 264.7 OCLs resulted in the formation of multiple, small actin rings leading to poor bone resorption. This result suggested that the phosphatase catalytic activity of Inpp4b alpha is crucial for osteoclast actin ring formation and cytoskeletal dynamics in vitro. We then hypothesized that Inpp4b alpha can be an essential phosphatase involved in the osteoclast cytoskeleton and resorption activity in vivo. Toward this aim, we decided to overexpress three forms of Inpp4b in transgenic mice: the native Inpp4b alpha, the Inpp4b alpha phosphatase inactive form (C845A), and the native form missing the lipid binding C2 domain. Specific expression of these transgenes was targeted with the human Ctsk promoter, which is specifically expressed in mature osteoclasts. These mice were also crossed with Inpp4b knockout mice to avoid interference with expression of endogenous Inpp4b and to mimic a knock-in situation. The expression of Inpp4b alpha (C845A) OCLs differentiated in ex vivo presented multiple, small actin rings and disruption in cytoskeletal rearrangement correlating with previous results. The expression of Inpp4b alpha missing the C2 domain had a diffused podosome belt, similar to osteoclasts derived from the Inpp4b knockout mice. These results illustrated that Inpp4b alpha plays a major role in the osteoclast cytoskeletal rearrangements in vivo, and this is directly dependent on the catalytic activity of the Inpp4b phosphatase. / L'ostéopétrose est un désordre génétique résultant d'une accumulation osseuse dûe à un défaut des ostéoclastes. Nôtre laboratoire a caractérisé la mutation du gène Ostm1 en tant que responsable de la forme la plus sévère d'ostéopétrose chez la souris et l'humain. De plus, nôtre laboratoire a parallèlement identifié une diminution de l'expression du gène Inositol polyphosphate 4- phosphatase type II alpha (Inpp4b alpha) dans les ostéoclastes déficients d'Ostm1. À la suite de la caractérisation du gène Inpp4b chez la souris, l'importance de ce gène dans la biologie du tissu osseux a été établie : D'une part, Inpp4b alpha co-localise avec la F-actine qui forme les anneaux d'actine constituant des sous-unités du podosome, une structure responsable de l'activité de résorption des ostéoclastes. D'autre part, l'expression de la forme inactive d'Inpp4b dans la lignée ostéoclastique RAW 264.7 entraîne la formation de petits et multiples anneaux d'actine résultant en une faible résorption osseuse. Ce résultat suggère que l'activité catalytique de la phosphatase Inpp4b alpha soit cruciale pour la formation des anneaux d'actine et de la dynamique du cytosquelette des ostéoclastes in vitro. À la lumière de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse qu'Inpp4b alpha est une importante phosphatase impliquée dans le cytosquelette ainsi que dans l'activité de résorption des ostéoclastes in vivo. Pour ce faire, nous avons surexprimé trois formes d'Inpp4b dans des souris transgéniques: la forme native d'Inpp4b alpha, la forme inactive d'Inpp4b alpha (C845A), ainsi que la forme native manquant le domaine de liaison aux lipides C2. La spécificité d'expression de ces transgènes a été ciblée dans les ostéoclastes matures en utilisant le promoteur de Ctsk humain. Ces souris ont été croisées avec des souris Inpp4b knockout afin d'éviter l'interférence avec l'expression d'Inpp4b endogène ainsi que de mimer un knock-in. Les ostéoclastes exprimant la forme inactive d'Inpp4b alpha(C845A) et différentiés ex vivo présentent de petits et multiples anneaux d'actine, ainsi qu'un défaut du réarrangement du cytosquelette tel qu'observé précédemment. Les ostéoclastes démontrant l'expression d'Inpp4b alpha sans domaine C2 présentent une ceinture de podosomes diffuse, comparable à celle observée dans les souris Inpp4b knockout. Ces résultats illustrent l'importance de la phosphatase Inpp4b alpha dans le réarrangement du cytosquelette des ostéoclastes in vivo, et ceci dépend directement de l'activité catalytique d'Inpp4b.